Een introductie tot de centrifuge

De centrifuge is een instrument dat in bijna elk biomedisch onderzoekslaboratorium ter wereld wordt gebruikt.

Centrifugatie is een proces waarbij een centrifuge wordt gebruikt om componenten van een complex mengsel te scheiden.

Door laboratoriummonsters op zeer hoge snelheden te draaien, worden de componenten van een bepaald mengsel onderworpen aan centrifugale kracht, waardoor dichtere deeltjes zich weg van de rotatieas verplaatsen en lichtere deeltjes er juist naartoe bewegen. Deze deeltjes kunnen bezinken op de bodem van de buis tot wat bekend staat als een pellet, waarna dit geïsoleerde monster, of de overblijvende vloeistof, het supernatant, verder kan worden verwerkt of geanalyseerd.

Het belangrijkste onderdeel van een centrifuge is de rotor, het bewegende deel dat met hoge snelheden draait.

Rotors kunnen in een vaste positie staan, of een centrifuge kan meerdere rotors gebruiken die zijn bevestigd op een onderdeel genaamd de spindel.

Gewoonlijk heeft de centrifugerotor een deksel dat stevig is vastgeschroefd om te voorkomen dat monsters eruit vliegen.

Veel centrifuges zijn voorzien van een koelunit waarmee de interne temperatuur tijdens het centrifugeren kan worden geregeld.

Ze hebben ook knoppen om de parameters voor elke run in te voeren, waaronder de duur van het centrifugeren, de temperatuur en de omvang van de rotatie in termen van snelheid of relatieve kracht.

De centrifugeersnelheid wordt gemeten in RPM, of omwentelingen per minuut. RPM is een complexe waarde, omdat niet de snelheid van de centrifuge ervoor zorgt dat deeltjes uit een mengsel scheiden, maar de kracht die op deze deeltjes inwerkt.

De kracht die op een deeltje inwerkt is gerelateerd aan de straal van de centrifugerotor, en aangezien verschillende centrifuges verschillende rotorformaten hebben, kunnen er bij dezelfde snelheid of RPM verschillende krachten worden uitgeoefend.

De centrifugeerkracht kan ook worden gekwantificeerd als de relatieve centrifugale kracht, of RCF. RCF wordt doorgaans weergegeven als een veelvoud van de zwaartekrachtversnelling van de aarde.

RCF wordt uitgedrukt als het product van de straal van de rotor en het kwadraat van de hoeksnelheid, gedeeld door de zwaartekrachtversnelling van de aarde.

RCF kan aan RPM worden gerelateerd via de volgende vergelijking, waarbij r staat voor de straal van de centrifuge gemeten in centimeters.

Het gebruik van deze vergelijking kan het verschil betekenen tussen een mislukt of een geslaagd experiment, maar u hoeft deze berekening niet voor elke nieuwe procedure toe te passen. Centrifuges worden vaak geleverd met nomogrammen die helpen om RCF vrij eenvoudig om te rekenen naar RPM. Gebruik een liniaal om de straal van de centrifuge en een gegeven RPM-waarde te verbinden om de RCF te bepalen.

Houd bij het starten van het centrifugeren van uw monsters rekening met de temperatuur. Als u een gekoelde centrifuge gebruikt, moet de interne temperatuur van het apparaat de gewenste waarde hebben bereikt voordat u begint, of u kunt andere methoden gebruiken om de rotor te koelen.

Controleer direct voor het centrifugeren of alle doppen op uw buisjes goed vastgedraaid en stevig gesloten zijn.

Zorg er bij het laden van de buisjes voor dat elk monster wordt uitgebalanceerd door een ander monster direct tegenover te plaatsen.

Als u slechts één buisje heeft, maak dan een ander buisje dat als contragewicht kan dienen.

Als u drie buisjes heeft, kunt u deze in een driehoek plaatsen zodat ze equidistant van elkaar staan.

Het balanceren van gewichten in een centrifuge is cruciaal. Centrifugerotors bereiken hoge snelheden en hebben veel kinetische energie. Bij een onjuiste balans kan de gehele centrifuge-eenheid van zijn plek worden geslingerd, wat ernstige schade kan veroorzaken.

Zodra u heeft bevestigd dat de rotor en het deksel stevig vastzitten, start u de centrifuge en blijft u in de buurt totdat de gewenste snelheid is bereikt. Als u een probleem opmerkt, roep dan een ervaren lid van het laboratorium ter hulp.

Wanneer de centrifugatie is voltooid, zou u uw biologische monster onderaan de buis moeten zien als een pellet, die is gescheiden van de rest van de oplossing, het supernatant.

Het supernatant kan worden verwijderd door het te decanteren – een technische term voor het afgieten – of het kan worden geaspireerd – een term voor het verwijderen met behulp van zuiging.

Het gezuiverde monster kan vervolgens via een proces genaamd resuspenderen worden teruggebracht in een oplossing. Herhaalde cycli van centrifugeren, gevolgd door het aspireren van cellen en resuspenderen in buffer, wordt vaak aangeduid als het wassen van cellen.

Nu u enkele basisprincipes van centrifugatie heeft gezien, is het tijd om enkele soorten centrifuges en de procedures die u ermee kunt uitvoeren te bekijken.

Centrifuges met een vaste hoekrotor zijn waarschijnlijk het meest voorkomende type instrument dat u in het laboratorium zult tegenkomen. Veel tafelcentrifuges vallen in deze categorie.

Deze centrifuges, waarbij de buisjes in een vaste, schuine positie staan, worden gebruikt in protocollen voor differentiële centrifugatie. In deze protocollen kan een reeks centrifugaties bij verschillende snelheden worden gebruikt om biologische monsters, zoals dierlijke cellen, te zuiveren. Meestal omvatten deze protocollen verschillende cellwasstappen.

In tegenstelling tot vaste hoekrotoren hebben swing-outrotoren flexibele buishouders waardoor monsters naar buiten kunnen roteren. Deze rotoren zijn voordelig bij toepassingen zoals dichtheidsgradiëntcentrifugatie, waarbij biologische monsters migreren naar afzonderlijke lagen van gradiëntmedia. Dit type centrifugatie is nuttig voor het snel isoleren van het ene celtype van het andere, of voor het isoleren van individuele organellen.

Ten slotte is de ultracentrifuge de grote broer van alle centrifuges die u in het laboratorium vindt. Deze kan draaien met meer dan 70.000 rpm, waardoor hij zeer geschikt is voor de isolatie van kleine deeltjes, zoals DNA of virussen.

Vanwege de hoge snelheden van deze centrifuge moet er extra zorg worden betracht om ervoor te zorgen dat de beladingen correct zijn gebalanceerd en dat zowel de rotor als het deksel stevig zijn vastgezet.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over centrifugatie bekeken. In deze video hebben we besproken: wat een centrifuge is en hoe deze werkt, hoe u een centrifuge bedient en gebruikt, enkele veiligheidsvoorzorgsmaatregelen en verschillende toepassingen van centrifugatie. Bedankt voor het kijken en vergeet niet uw buisjes te balanceren.