Name: Isolatie en differentiatie van Stroma vasculaire cellen te Beige / Brite Cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Leer de isolatie en differentiatie van stromale vasculaire cellen tot beige/brite cellen bij muizen. Deze methode maakt metabool onderzoek naar vetweefselbrowning en obesitasbehandeling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda, en Lauren Ruiz voor discussie, technische hulp en redactionele hulp op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (DK087853), van het Programma voor Doorbraak biomedisch onderzoek en van Asubio Pharm Inc Skula werd ondersteund door een SHARE PhD beurzen van de Universiteit van Kopenhagen en het EU-FP7 project Diabat (GEZONDHEID-F2 -2,011 tot 278,373) naar Lise Madsen en Karsten Kristiansen. We erkennen ook het DERC centrum subsidie ​​(NIH P30 DK063720).

1. Bereid Spijsvertering Medium Maak 5 ml per 5 muizen per weefsel (ongeveer 1 ml / 1 g vetweefsel). <ol><li> Weeg bij de spijsvertering enzymen: - Collaginase D: 1,5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223) - Dispase II: 2,4 u / ml (04942078001, 0980 mg / lyo, Roche, 11466200) </li><li> Voeg 25 ml PBS toe en meng goed om op te lossen </li><li> Voeg CaCl2 vlak voor vertering van het weefsel op een eindconcentratie van 10 mM </li></ol> 2. Ontleden vetweefsel van muizen <ol><li> Dissection moeten zorgvuldig worden uitgevoerd, en onmiddellijk na de muizen (6-8 weken oud) worden opgeofferd. Werk steriele met ethanol gespoten op de muis vacht voordat u deze opent. Direct Plaats het weefsel in schone PBS, aparte interscapular BAT en subcutane inguinale WAT. </li><li> Voor interscapular BAT: de muis geplaatst met de rug ogen gezien, opengesneden langs de rug en tot aan de nek. De bruinevetweefsel kan worden gevonden onder de huid tussen de schouders (interscapular). BBT kan worden gezien als twee kwabben, vlindervormige. Een dun laagje wit vet voor de BBT moet zorgvuldig worden verwijderd. </li><li> Voor subcutane WAT (lies WAT): verwijder de huid. Lies WAT is direct te vinden onder de huid aan beide zijden, vanaf bijna op de rug en gaan samen, binnenkant van de dijen en naar beneden in de richting van de testikel. </li></ol> 3. Knippen en Digest vetweefsel <ol><li> Snel alle vervuiling, zoals haar, skeletspieren en bindweefsel uit het weefsel secties. </li><li> Drogen snel tissue op papier te dissectie medium niet verdunnen met PBS en leg hem op een droge plaat. </li><li> Voeg spijsvertering medium (toegevoegd CaCl 2 voorafgaand aan de spijsvertering) en gehakt het weefsel in kleine stukjes. Meng goed door en neer te pipetteren met een 5 ml pipet. Breng het gehakt weefsels in 50 ml buizen met de rest van de digestie medium Meng nog door en neer te pipetteren. </li><li> Digest in 37 ° C onder constant roeren bij 150 rpm voor 40-50 min. Controleer elke 10-15 minuten om te controleren of de spijsvertering verloopt goed en tot meer dan-vergisting te voorkomen. </li></ol> Opmerking: Correcte spijsvertering medium en tijd zijn belangrijk. Het weefsel moet goed worden verteerd, maar teveel spijsvertering kan schade aan de cellen. 4. Filter celsuspensie <ol><li> Stop digestie door toevoeging van 5 ml compleet medium (DMEM/F12 met 10% FPS en P / S). De cellen moeten bijna volledig homogeen. Meng goed door pipetteren. </li><li> Centrifugeer bij 700 xg gedurende 10 minuten. </li><li> SVF kan nu worden gezien als een bruinachtige pellet op de bodem van de buis. Zuig het olieachtige rijpe adipocyten laag boven en de meeste van de vloeistoflaag - houdt de pellet en oplossen in 10 ml compleet medium. Meng goed. </li><li> Plaats een cel zeef (50-70 micrometer diameter) over een nieuwe 50<html> ml buis en filter de celsuspensie. </li></ol> 5. Plaat Cellen <ol><li> Breng celsuspensie een 15 ml en centrifugeer bij 700 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Aspireren medium en resuspendeer pellet in 10 ml compleet medium. Pipet en meng goed. </li><li> Schatten hoeveel platen nodig. Dit kan variëren en is afhankelijk van de pelletgrootte. Een algemene regel is 2 van 10 cm platen uit 5 muizen voor inguinale WAT en een 10 cm plaat voor BBT. </li><li> Plaat cellen op collageen gecoate gerechten (R &amp; D) in volledig medium </li><li> 1-2 uur na plating de cellen, aspiraat medium, twee keer wassen met PBS en voeg vers medium. Deze stap is belangrijk omdat dit verwijderen van rode bloedcellen, immuuncellen en andere verontreinigingen. </li></ol> 6. Onderscheid Cellen <ol><li> Maak onderhoud en inductie mediums. </li></ol> Onderhoudsmedium Compleet medium met toegevoegd: ent &quot;&gt; Insuline, eindconc. 5 ug / ml (5 mg / ml stock, *** 100 ul azijnzuur in 10 ml H 2 O tot aangezuurd water pH 2,5 te bereiden. lossen insuline in het aangezuurde water. winkelvoorraden op -20 ° C) 3,3 &#39;,5-trijood-L-thyronine (T3), eindconc. 1 nM (10 pM voorraad *** T3 opgelost in 1N NaOH en medium tot 10 uM bouillon toe. Sigma cat # T-2877) Bewaar bij 4 ° C, goed voor een week Inductiemedium Onderhoudsmedium bevattende volgende verbindingen: Indomethacine, eindconc. 125 uM (0,125 M voorraad in ethanol, Sigma cat # I-7378). Indomethacin moet verwarmd worden tot 60 ° C worden opgelost. Dexamethason, eindconc. 2 ug / ml (2 mg / ml in ethanol sok, Sigma cat # D-1756) 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), eindconc. 0,5 mM (0,25 M stock in DMSO, Sigma cat # I-5879) Rosiglitazon, eindconc. 0,5 uM(10 mM voorraad in DMSO, Sigma cat # R-2408) Opmerking: Zorg verse inductie medium elke keer. <ol start="2"><li> Grow primaire adipocyten tot 95-97% confluentie in compleet medium (samenvloeiende maar niet te vol) </li><li> Wijzig regelmatig compleet medium met inductie medium (dag 0) </li><li> Na 48 uur (dag 2), te wijzigen middellange tot onderhoud medium met rosiglitazon (0,5 uM) </li><li> Na nog 48 uur (dag 4), veranderen vers onderhoudsmedium met rosiglitazon (1 uM) gedurende 2-3 dagen extra. 6-7 dagen na toevoeging van de inductie medium worden de cellen volledig gedifferentieerde cellen rijpen om vet en zijn gevuld met oliedruppeltjes. Druppels verschijnt ongeveer 3-4 dagen na de inductie. </li></ol> Opmerking: Verander medium om de 2-3 dagen totdat de cellen volledig gedifferentieerd. Cellen kunnen nu worden geoogst en mRNA expressie van UCP1 en Other bruin adipocyt-specifieke genen kan worden gemeten met qRT-PCR. Western blot worden gebruikt om eiwitten te detecteren.

<ol><li>Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%3A+genetic%2C+molecular%2C+and+environmental+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).</li>
<li>Rothwell, N. J., Stock, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effects+of+cafeteria+and+tube-feeding+on+energy+balance+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Proceedings+of+the+Nutrition+Society%22%5BJournal%5D)">Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A(1979).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).</li>
<li>Zingaretti, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+UCP1+demonstrates+that+metabolically+active+adipose+tissue+in+the+neck+of+adult+humans+truly+represents+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM16+controls+a+brown+fat%2Fskeletal+muscle+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch.</a> Nature. 454, 961-967 (2008).</li>
<li>Petrovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+%28PPARgamma%29+activation+of+epididymally+derived+white+adipocyte+cultures+reveals+a+population+of+thermogenically+competent%2C+UCP1-containing+adipocytes+molecularly+distinct+from+classic+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).</li>
<li>Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fat+interacts+with+QTLs+controlling+induction+of+Pgc-1+alpha+and+Ucp1+during+conversion+of+white+to+brown+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat.</a> Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).</li>
<li>Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-induced+recruitment+of+brown+adipose+tissue+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis.</a> Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins%2C+leukotrienes%2C+and+essential+fatty+acids%22%5BJournal%5D)">The adipose organ.</a> Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).</li>
<li>Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+brown+adipocytes+in+white+adipose+tissue+during+CL+316%2C243-induced+reversal+of+obesity+and+diabetes+in+Zucker+fa%2Ffa+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity+and+Related+Metabolic+Disorders%3A+Journal+of+the+International+Association+for+the+Study+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats.</a> International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).</li>
<li>Hansen, J. B., Kristiansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+circuits+controlling+white+versus+brown+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation.</a> The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).</li>
<li>Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARy+agonists+induce+a+white-to-brown+fat+conversion+through+stabilization+of+PRDM16+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein.</a> Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+bipotential+adipocyte+progenitors+recruited+by+beta3-adrenoceptor+activation+and+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding.</a> Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+properties+of+adipocytes+in+the+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).</li>
<li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).</li>
<li>Petrovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+%28PPARgamma%29+activation+of+epididymally+derived+white+adipocyte+cultures+reveals+a+population+of+thermogenically+competent%2C+UCP1-containing+adipocytes+molecularly+distinct+from+classic+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).</li>
<li>Rong, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+mitochondrial+biogenesis+is+suppressed+in+db%2Fdb+and+high-fat+diet-fed+mice+and+improved+by+rosiglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone.</a> Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).</li>
<li>Wilson-Fritch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+remodeling+in+adipose+tissue+associated+with+obesity+and+treatment+with+rosiglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).</li>
<li>Sell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonism+increases+the+capacity+for+sympathetically+mediated+thermogenesis+in+lean+and+ob%2Fob+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).</li>
<li>Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+thiazolidinedione%2C+NC-2100%2C+which+is+a+weak+PPAR-gamma+activator%2C+exhibits+potent+antidiabetic+effects+and+induces+uncoupling+protein+1+in+white+adipose+tissue+of+KKAy+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice.</a> Diabetes. 49, 759-767 (2000).</li>
<li>Vernochet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPalpha+and+the+corepressors+CtBP1+and+CtBP2+regulate+repression+of+select+visceral+white+adipose+genes+during+induction+of+the+brown+phenotype+in+white+adipocytes+by+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).</li>
<li>Tai, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+nuclear+receptor+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+promotes+brown+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).</li>
<li>Sugii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARgamma+activation+in+adipocytes+is+sufficient+for+systemic+insulin+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier wordt een betrouwbare cellulaire systeem om de ontwikkeling van beige / brite cellen in primaire gekweekte adipocyten in muizen. Vergeleken met verschillende beschikbare geïmmortaliseerde cellijnen, dit systeem waarschijnlijk grotere relevantie voor het bruinen van witte vet in vivo bieden. Hoewel in de studie van deze primaire adipocyten biedt een aantal voordelen, bestaan ​​er ook een aantal beperkingen en problemen die van belang zijn om te overwegen. Eerst is dit systeem st...

<html> Obesitas is een dramatische toename van de hele wereld en wordt nu beschouwd als een van de meest ernstige bezorgdheid voor de volksgezondheid 1. Deze situatie heeft betrekking op een onbalans in energie-inname ten opzichte uitgaven en resultaten in overtollige energie opgeslagen als vet in wit vetweefsel (WAT). Vergrote WAT wordt in verband gebracht met een verhoogde body mass en gewicht, terwijl de bruine vetweefsel heeft de mogelijkheid om overtollige energie af te voeren om warmte te produceren. Vandaar BBT kan functioneren als bescherming tegen zowel kou en overgewicht 2,3. Dit wordt bereikt door ontkoppeling van het elektronentransport in mitochondria door ontkoppeling eiwit 1 (UCP1). Dit eiwit wordt beschouwd als een keurmerk voor nonshivering thermogenese in BAT 3. Verschillende studies in de afgelopen jaren is gebleken dat volwassen mensen functionele BAT vier-acht hebben en dus, manipulatie van de BBT bij de mens kan een potentiële therapeutische interventie in de strijd tegen overgewicht en de daarmee samenhangende ziekten. jove_content &quot;&gt; Huidig ​​bewijs geeft aan dat twee soorten bruine adipocyten in knaagdieren&quot; klassieke &quot;of&quot; bestaande &quot;bruin vet ontstaat tijdens de prenatale fase en vormt gewijd bruine adipose depots in interscapular regio en andere perifere weefsels Anderzijds. Een &quot;induceerbare&quot; vorm van bruin vet (zogenaamde brite of beige cellen) ontwikkelt tijdens postnatale fase en wordt afgewisseld in wit vetweefsel. Beide soorten bruine vetcellen ook gescheiden door verschillende ontwikkelingsstadia oorsprong. Terwijl de bestaande bruine vetcellen ontstaan ​​uit myoblastsic-achtige Myf5 precursors, de induceerbare brite / beige cellen afgewisseld in WAT voortkomen uit een niet-Myf5 lineage 9,10. Bovendien regulerende pathways van dit celtype waarschijnlijk verschillen van de Myf5 afgeleide bruine adipocyten 11. de ontwikkeling van de beige cellen (bijv. &quot;bruining&quot; wit vet) kan worden geactiveerd in reactie op chronische blootstelling aan kou enβ3-adrenoceptor-agonisten of PPARy agonisten bij volwassenen 12-14. De beige / brite cellen waarschijnlijk een veelbelovend therapeutisch doel voor manipulatie van de totale energiebalans en kan deel kunnen uitmaken behandeling van obesitas, dus is het belangrijk om te begrijpen precieze moleculaire mechanismen en signaalwegen waarbij omgevingsfactoren controle van de ontwikkeling van beige cellen. Om de moleculaire controle van de bruining van wit vet begrijpen zijn in vitro experimenten best geschikt als differentiatie van preadipocyten plaatsvindt eerder asynchroon en het is moeilijk om de cellen te detecteren in situ 15. Hoewel studies op adipocyte ontwikkeling is tot nu toe voornamelijk uitgevoerd op cellijnen zoals 3T3-L1, 3T3-F442A of HIB1, deze cellijnen blijken het moleculaire profiel van beige cellen missen. Anderzijds, primaire adipocyten geïsoleerd uit subcutane WAT het meest waarschijnlijk het proces herhalens van bruinkleuring van wit vet in een cel autonome manier. Hier bieden wij een protocol voor een effectieve isolatie van het stromale-vasculaire fractie uit vetweefsel en voor het induceren van de bruinkleuring van wit vet in reactie op PPAR-agonisten. Rosiglitazon is aangetoond dat een bijzonder effectieve mediator van bruin in deze cellen. Zoals hiervoor 16 kan dit cellulaire systeem gebruikt worden om een betrouwbare cellulaire systeem om de ontwikkeling van beige / brite cellen te bestuderen dienen.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Collaginase D </td><td> Roche </td><td> 11088874103 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM medium </td><td> Visser </td><td> 10017-CV </td><td> Met 2,5 g / l glucose en L-glutamine zonder natriumpyruvaat </td></tr><tr><td> Insuline </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> T3 (3,3 &#39;,5-trijood-L-thyronine) </td><td> Sigma </td><td> T-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Indometacine </td><td> Sigma </td><td> I-7378 </td><td></td></tr><tr><td> Dexamethason </td><td> Sigma </td><td> D-1756 </td><td></td></tr><tr><td> IBMX </td><td> Sigma </td><td> I-5879 </td><td></td></tr><tr><td> Rosiglitazon </td><td> Sigma </td><td> R-2408 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Collageen beklede schaaltjes </td><td> BD </td><td> 354450 </td><td> 10 cm platen </td></tr><tr><td> 70 urn filter </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td> Cel zeef, 70 pm nylon 1/ea </td></tr></tbody></table>

isolatie en differentiatie van stroma vasculaire cellen te beige / brite cellen

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Bruine vetcellen hebben de mogelijkheid om de ademhalingsketen afgekoppeld mitochondria en afgevoerd chemische energie als warmte. Ontwikkeling van UCP1-positieve bruine vetcellen in wit vetweefsel (zogenaamde beige of brite cellen) wordt sterk geïnduceerd door een verscheidenheid aan omgevingsfactoren zoals chronische blootstelling aan kou of PPARy agonisten, dus dit celtype potentieel heeft als een therapeutisch doelwit voor behandeling van obesitas. Hoewel de meeste vereeuwigd adipocyt lijnen kunnen niet herhalen het proces van &quot;bruinen&quot; van wit vet in cultuur, primaire adipocyten geïsoleerd van stromale vasculaire fractie in subcutane wit vetweefsel (WAT) een betrouwbare cellulaire systeem om de moleculaire controle van beige / brite cel ontwikkeling te bestuderen . Hier beschrijven we een protocol voor effectieve isolatie van primaire preadipocyten en voor het induceren van differentiatie beige / brite cellen in kweek. Het bruinen effect kan worden beoordeeld door de expressie van bruin vet-selectieve merkers zoals UCP1.

Browning primaire adipocyten kan worden benaderd door het meten van mRNA expressie van UCP1 en bruin vet-specifieke of selectieve genen door qRT-PCR. Weergegeven in Figuur 1 genexpressiegegevens in lies WAT afgeleide primaire adipocyten. De cellen werden geïnduceerd om te differentiëren in aanwezigheid van twee verschillende doseringen rosiglitazon bij 50 nM en 500 nM. Een subset van cellen werd behandeld met forskoline bij 10 uM gedurende 4 uur voorafgaande aan oogst. Dit zal tot cyclisch AMP ...

Primaire witte preadipocyten geïsoleerd van wit vetweefsel in muizen kunnen worden onderscheiden in beige / brite cellen. Hier wordt gepresenteerd is een betrouwbare cellulaire modelsysteem om de moleculaire regulatie van &quot;bruinen&quot; van wit vet te bestuderen.

Isolatie en differentiatie van Stroma vasculaire cellen te Beige / Brite Cellen

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Het algemene doel van deze procedure is om primaire adipocyten te isoleren en hun differentiatie in cultuur te induceren tot beige of heldere cellen. De eerste stap is het verwijderen van vetweefsel van muizen. Vervolgens wordt het weefsel gedigesteerd met collageinase.Zodra de stroma vasculaire fractie is geïsoleerd, worden de cellen geplaatst. De laatste stap is het induceren van de differentiatie van de cellen tot beige of heldere cellen. Uiteindelijk worden analytische methoden gebruikt om een verhoogde expressie van bruin adipocyt specifieke genen te tonen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de belangrijkste vragen over bruin vetweefsel, namelijk welk moleculair mechanisme de ontwikkeling van heldere of beige cellen reguleert. De implicaties van deze techniek reiken tot de behandeling van obesitas en andere leefstijlziekten. Aangezien de manipulatie van bruin vetweefsel bij mensen kan worden gebruikt als een potentiële therapeutische interventie, is de eerste stap het bereiden van het digestiemedium.Na de euthanasie wordt het vetweefsel verwijderd. Eerst isoleer je het interscapulaire bruine vetweefsel of bat door langs de rug van het dier tot aan de nek te snijde

isolation-differentiation-stromal-vascular-cells-to-beigebrite

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij bieden een methode voor het isoleren en kweken van zuivere populaties van hartklep endotheelcellen (VEC). VEC kan worden geïsoleerd uit beide zijden van de cusp of bijsluiter en onmiddellijk na de onderliggende interstitiële cel (VIC) isolatie is eenvoudig.

Isolatie van Valvulaire endotheelcellen

In 2001, onderzoekers van UCLA beschreef de isolatie van een populatie van volwassen stamcellen, genaamd vet-afgeleide stamcellen of ASC, uit vetweefsel. Dit artikel schetst de isolatie van ASC uit lipoaspirates behulp van een handleiding, enzymatische afbraak protocol met behulp van collagenase.

Handmatig Isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke Lipoaspirates

Bloedvaten in de menselijke skeletspier haven diverse multi-lineage voorloper populaties die ideaal is voor regeneratieve toepassingen zijn. Deze isolatie methode maakt gelijktijdige zuivering van drie multipotente precursor celpopulaties respectievelijk uit drie structurele lagen van de bloedvaten: myogene endotheelcellen van de intima, pericytes van media en adventitia cellen van adventitia.

Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle

Isolatie van lymfeklieronstcellen is een meervoudige procedure die enzymatische vertering en mechanische disaggregatie omvat om fibroblastische reticulaire cellen, lymfatische en bloed-endotheelcellen te verkrijgen. In de beschreven procedure wordt een korte vertering gecombineerd met geautomatiseerde mechanische disaggregatie om de degradatie van oppervlaktemarkeringen van vitale lymfeklersonstcellen te minimaliseren.

Isolatie van muizen lymfkliertest stromale cellen

Menselijk hartweefsel herbergt multipotente perivasculaire precursor celpopulaties die geschikt zijn voor myocard regeneratie kunnen zijn. De hier beschreven techniek maakt de gelijktijdige isolatie en zuivering van twee multipotente stromale cel populaties geassocieerd met natieve bloedvat, dat wil zeggen CD146 + CD34 - pericyten en CD34 + CD146 - adventitia-cellen van de menselijke hartspier.

Isolatie van Perivasculaire Multipotent Precursor Cell Populaties van de Mens Cardiac Tissue

In dit artikel presenteren we methoden om te isoleren en te onderscheiden van het beenmerg stromale cellen en hematopoietische stamcellen van lange beenderen van de muis. Twee verschillende protocollen worden gepresenteerd opbrengst andere cel populaties geschikt voor uitbreiding en differentiatie in botcellen, adipocytes en osteoclasten.

Isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en Osteoclast voorlopercellen van muizen

De differentiatie van wit en beige adipocytes uit vetweefsel vasculaire progenitoren beren mogelijkheden voor metabole verbetering in obesitas. We beschrijven protocollen voor een CD34 + CD31 + endothelial cel los van menselijk vet en voor een latere in vitro expansie en de differentiatie in wit en beige adipocytes. Verschillende downstream toepassingen worden besproken.

Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Deze studie heeft een stabiele en efficiënte methode vastgesteld voor de isolatie, kweek en functionele bepaling van CD34+ stamcellen in de vaatwand (CD34+ VW-SC's). Deze gemakkelijk te volgen en tijdbesparende isolatiemethode kan door andere onderzoekers worden gebruikt om de mogelijke mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij hart- en vaatziekten.

Immunomagnetische isolatie van de vaatwand-bewoner CD34+ stamcellen van muizen

Hier presenteren we protocollen die isolatie van stromale cellen uit muizenbot, beenmerg, thymus en menselijk thymusweefsel mogelijk maken die compatibel zijn met single-cell multiomics.

Stromale celisolatie van hematopoëtische organen

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie, zuivering en kweek van primaire marginale cellen uit de muis stria vascularis, en voor het opstellen van in vitro modellen van oxidatieve stress en cellulaire senescentie om cochleaire laterale wandaandoeningen te bestuderen.

Isolatie en kweek van primaire marginale cellen van de stria vascularis uit neonatale muizen

Leer de isolatie en differentiatie van stromale vasculaire cellen tot beige/brite cellen bij muizen. Deze methode maakt metabool onderzoek naar vetweefselbrowning en obesitasbehandeling mogelijk.

Isolatie en differentiatie van Stroma vasculaire cellen te Beige / Brite Cellen

Meer video's verkennen