Isolatie en differentiatie van Stroma vasculaire cellen te Beige / Brite Cellen

Het algemene doel van deze procedure is om primaire adipocyten te isoleren en hun differentiatie in cultuur te induceren tot beige of heldere cellen. De eerste stap is het verwijderen van vetweefsel van muizen. Vervolgens wordt het weefsel gedigesteerd met collageinase.

Zodra de stroma vasculaire fractie is geïsoleerd, worden de cellen geplaatst. De laatste stap is het induceren van de differentiatie van de cellen tot beige of heldere cellen. Uiteindelijk worden analytische methoden gebruikt om een verhoogde expressie van bruin adipocyt specifieke genen te tonen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de belangrijkste vragen over bruin vetweefsel, namelijk welk moleculair mechanisme de ontwikkeling van heldere of beige cellen reguleert. De implicaties van deze techniek reiken tot de behandeling van obesitas en andere leefstijlziekten. Aangezien de manipulatie van bruin vetweefsel bij mensen kan worden gebruikt als een potentiële therapeutische interventie, is de eerste stap het bereiden van het digestiemedium.

Na de euthanasie wordt het vetweefsel verwijderd. Eerst isoleer je het interscapulaire bruine vetweefsel of bat door langs de rug van het dier tot aan de nek te snijden. Twee lobben van bruin vetweefsel zijn net onder de huid tussen de schouders te vinden.

Vervolgens verwijder je voorzichtig de dunne laag wit vet dat de bat bedekt. Eenmaal geïsoleerd, plaats je het weefsel direct in schoon PBS. Het inguinale witte vetweefsel of wat bevindt zich direct onder de huid aan beide zijden.

Het strekt zich uit tot de binnenkant van de dijen en loopt door naar de testikels. Verwijder het weefsel en plaats het in schoon PBS. De volgende stappen worden toegepast op zowel de bat- als nat-monsters.

Verwijder snel alle verontreinigingen zoals haar, skeletspier en bindweefsel uit de weefselsecties. Droog het weefsel vervolgens snel op een papieren handdoek om te voorkomen dat het dissectiemedium wordt verdund met PBS en plaats het op een droge plaat. Voeg het digestiemedium toe en hak het weefsel in kleine stukjes.

Breng het weefsel vervolgens over in een buis van 50 milliliter met de rest van het digestiemedium. Plaats de buis in een incubator van 37 graden Celsius met constante agitatie gedurende 40 tot 50 minuten om te verteren. Controleer elke 10 tot 15 minuten om ervoor te zorgen dat de vertering goed gaat en om oververtering te voorkomen.

Nadat het weefsel goed is verteerd, stop de vertering. Door vijf milliliter compleet medium toe te voegen en goed te mengen, zouden de cellen bijna volledig homogeen moeten zijn. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende 10 minuten bij 700 keer G.

De stromale vasculaire fractie zou nu zichtbaar moeten zijn als een bruine pellet op de bodem van de buis. Aspireer de olieachtige rijpe adipocytenlaag bovenop en het grootste deel van de vloeistoflaag. Los vervolgens de pellet op in 10 milliliter compleet medium en meng goed. Eenmaal gemengd, plaats een celstrainer over een nieuwe 50 milliliter buis en filtreer de celsuspensie.

Breng de gefilterde celsuspensie over in een buis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 700 keer G. Zuig vervolgens het medium op en suspendeer de pellet opnieuw. Pipetteer en meng goed in 10 milliliter compleet medium. Plaats de cellen zoals nodig.

Over het algemeen leveren vijf muizen twee 10 centimeter platen van inguinaal wat en één plaat van bat op. Een of twee uur na het plaatsen. Aspireer het medium, was met PBS twee keer en voeg vers medium toe.

Deze stap is belangrijk omdat dit rode bloedcellen, immuuncellen en andere verontreinigingen kan verwijderen. Het onderhouds- en inductiemedium worden van tevoren bereid. Zodra de primaire adipocyten zijn gegroeid tot 95 tot 97% confluency, vervang het reguliere volledige medium door inductiemedium.

Na 48 uur, verander het medium naar onderhoudsmedium dat 0,5 micromolair RO glitazon bevat. Na nog eens 48 uur, verander naar vers onderhoudsmedium dat één micromolair RO glitazon bevat voor nog eens twee tot drie dagen. Druppeltjes verschijnen rond de drie tot vier dagen na de inductie, zoals hier te zien is zes tot zeven dagen na het eerst toevoegen van het inductiemedium.

De cellen moeten volledig zijn gedifferentieerd tot rijpe vetcellen en moeten gevuld zijn met oliedruppeltjes. Cellen kunnen nu worden geoogst en gebruikt voor verdere analyse. Het bruin worden van primaire adipocyten kan worden beoordeeld door het meten van mRNA van bruin vet specifiek of selectieve genen door Q-R-T-P-C-R zoals hier te zien is.

RO glitazon, bracht robuust UCP één mRNA-expressie tot stand FORSKOLIN-behandeling aangeduid hier als cyclische A MP.Versterkte verder de RO glitazon-geïnduceerde UCP één expressie.Cdia. Een ander bruin vet selectief gen werd ook robuust verhoogd op een dosisafhankelijke manier. RO glitazon-behandeling verhoogde ook de expressie van FABP vier en een adipogene marker voor zowel bruin als wit vet.

Dit bruiningeffect was niet eenvoudigweg het gevolg van een verbetering van adipogenese per se. Aangezien de inductie van UCP één en CDIA-expressie nog steeds significant was, zelfs als de mRNA-niveaus werden genormaliseerd naar die van FABP vier, bevestigt deze Western blot de verhoogde eiwitniveaus van UCP één. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u preadipocyten isoleert en hoe u deze cellen in cultuur differentieert tot beige of heldere cellen.