Name: Live-cel Video Microscopie van pathogene schimmel Fagocytose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Leer live-cel video microscopie voor fagocytose van Candida albicans door macrofagen. Deze methode analyseert migratie, herkenning, opname en fagosoomrijping in real-time voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

LPE is een Schotse Senior Clinical Fellow en erkent de steun van de Chief Scientist Office (SCD/03). Dit werk werd gefinancierd door Wellcome Trust Project Grant aan LPE (089.930). NARG werd gefinancierd door een Wellcome Trust Programme Grant (080088) en een uitrusting Grant (075.470) (voor DeltaVision), en door een FP7-2007 tot +2.013 Grant (GEZONDHEID-F2-2.010 tot 260.338-Allfun). We willen de Universiteit van Aberdeen imaging faciliteit, in het bijzonder Kevin MacKenzie, dank voor nuttige ondersteuning en advies.

1. C. albicans Groei en voorwaarden <ol><li> Bereid SC-Ura agarplaten door toevoeging 6,9 g giststikstofbase zonder aminozuren, 1 ml 1 M NaOH, 10 ml 1% (w / v) adenine hemisulfaat zout en 20 g technische agar (eerder in detail beschreven in 11). Vul volume tot 900 ml met gedestilleerd H 2 O. Autoclaaf, laat agar afkoelen, maar niet genoeg om te stollen, en vervolgens 50 ml steriel 40% D-glucose en 50 ml steriel 4% SC-Ura uitval toe te voegen onder aseptische omstandigheden. Meng, giet in petrischalen en laat agarplaten afkoelen en stollen. Store agarplaten bij 5 ° C tot gebruik. </li><li> Streak C. albicans serotype A stam CAI4 + CIp10 van glycerol voorraad bij -80 ° C op SC-Ura agar plaat. </li><li> Incubeer plaat bij 30 ° C tot kolonies vormen en bewaar bij 5 ° C. </li><li> Cultuur een C. albicans kolonie in 5 ml SC-Ura medium (recept als in 1.1, maar zonder technische agar) en incubeer overnacht bij 30° C, 200 rpm tot de stationaire fase C. genereren albicans. </li></ol> 2. C. albicans kleuring met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) <ol><li> Voeg 10 ul C. albicans kweek gedurende de nacht tot 990 ul PBS (pH 7,4) en het uitvoeren van een celgetal met een hemocytometer. </li><li> Om visualisatie van C. helpen albicans tijdens fagocytose assays, vlek 1 × 10 8 C. albicans met 1 mg / ml FITC in 0,05 M carbonaat-bicarbonaat buffer (pH 9,6) gedurende 10 min bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Om ongebonden FITC te verwijderen, wassen C. albicans in 1 ml 1 x PBS, centrifuge bij 3000 x g gedurende 5 minuten, verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml 1 x PBS. Herhaal dit 3 keer. </li><li> Hersuspendeer pellet bij 1 x 10 6 cellen / ul in 1 x PBS. </li></ol> 3. Voorbereiding van de J774.1 Mouse macrofaagcellijn <ol><li> Behoud J774.1 macrofagen in 75 cm 2 weefselkweekflessen in DMEM medium aangevuld met 10% (v / v) foetaal kalfsserum (FCS), 200 U / ml penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine bij 37 ° C met 5% CO2. De bereiding van primaire macrofagen elders in detail 12, 13. </li><li> Schrapen J774.1 cellen van het weefselkweekfles en overbrengen naar een 50 ml Falcon buis. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten aan een cel pellet te verkrijgen. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 10 ml voorverwarmde DMEM aangevuld medium. Tellen cellen met behulp van een hemocytometer en plaat 1 × 10 6 J774.1 macrofagen in 2 ml aangevuld DMEM medium in een 35 mm glas-based imaging schotel. Incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Voorafgaand aan beeldvorming, aangevuld DMEM medium vervangen met 2 ml voorverwarmd aangevuld CO 2-onafhankelijke medium (met 10% (v / v) foetaal kalfsserum (FCS), 200 U / ml penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine) met 1 uM LysoTracker Rode DND-99.</li></ol> 4. Live Cell Video Microscopie Fagocytose Assay <ol><li> De keuze van de microscoop zal afhangen van wat er beschikbaar is ter plaatse, maar de microscoop setup moet een omgekeerde fase, een klimaatkamer verwarmd tot 37 ° C zijn en excitatie / emissie filters voor de gekozen vlekken (FITC en TRITC). </li><li> Voorafgaande Zet de microscoop kachel aan het experiment en of voldoende tijd voor de milieu-regelkamer te warmen tot 37 ° C. De tijd die nodig is voor de kamer temperatuur te stabiliseren zal variëren voor verschillende microscoop opstellingen. </li><li> Zet de microscoop en computer, en laad de imaging software. Monteer de beeldvorming schotel op de microscoop podium en pas de scherpstelling aan de J774.1 macrofagen te vinden. Optimaliseer de verschijning van TRITC en DIC beelden door een aanpassing van het percentage van doorvallend licht en sluitertijden. </li><li> Verwijder de beeldeenheid schotel en voeg 3 × 10 6 FITC-gekleurde C. albicans thij schotel. Noteer het tijdstip waarop C. albicans wordt toegevoegd aan de schotel. Zet de schotel naar het podium en optimaliseren van de verschijning van FITC beelden indien nodig. Stel een punten lijst indien nodig. </li><li> Begin beeldvorming als alle punten zijn scherp en de kanalen zijn geoptimaliseerd. Capture FITC, TRITC en DIC beelden elke minuut gedurende 6 uur. </li></ol>

<ol><li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li>
<li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li>
<li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li>
<li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li>
<li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li>
<li>Lewis, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578(2012).</li>
<li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialoadhesin+Promotes+Rapid+Proinflammatory+and+Type+I+Interferon+Responses+to+a+Sialylated+Pathogen%2C+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni.</a> J. Immunol. , In Press (2012).</li>
<li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+infection+inhibits+macrophage+cell+division+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li>
<li>Bain, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lytic+expulsion%2Fexocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li>
<li>Mora-Montes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+macrophages+and+cell+wall+oligosaccharides+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).</li>
<li>McPhillips, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+apoptotic+cell+phagocytosis+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).</li>
<li>Erwig, L. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+%28ERM%29+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen. NG is een ontvanger van onbeperkte subsidies voor fundamenteel onderzoek door Gilead Sciences. LE werkt als consultant voor GSK in het begin van de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Hier de werkwijze voor het gebruik van levende cellen videomicroscopie om macrofaag fagocytose studie beschreven. Video microscopie biedt meerdere extra lagen met informatie voor analyse. Een belangrijkste voordeel is dat de opname gegevens kunnen worden verkregen (van een experiment) voor elk tijdstip gedurende de 6 uur observatieperiode. Belangrijker beschreven werkwijze maakt differentiële analyse van de verschillende fasen van fagocytose. We hebben bijvoorbeeld aangetoond dat veranderingen in de totale opname van C. albicans glycosylering en morfogenese mutanten door macrofaag cellijnen en primaire macrofagen kan een gevolg zijn van veranderingen in de macrofaag migratie naar doelcellen of de snelheid van afblazen eenmaal cel-cel contact is gevestigd 7 is vastgesteld. Er zijn een aantal valkuilen bij het uitvoeren van deze experimenten. Ten eerste is het zeer belangrijk om stabiele omgevingsomstandigheden in de gehele experimentele procedure. Dit wordt het best bereikt in een klimaatkamer die is ingesteld op de experimentele omstandigheden enkele uren voordat het experiment. Video kwaliteit is sterk afhankelijk van geavanceerde modules die infrarode lasers gebruiken om automatisch onderhouden sample z-positie, ongeacht mechanische of thermische veranderingen waardoor de noodzaak voor handmatige correcties. Gezien de aard van de uitgebreide experimenten is belangrijk te beperken blootstelling aan laserlicht en bijbehorende fotobleken en fotoconversie effecten die kunnen worden geminimaliseerd door hoog fluorescente markers die laag belichtingstijden vergemakkelijken. De FITC kleuringsprotocol hier beschreven is snel en betrouwbaar. Als FITC is een zeer lichte en stabiele vlek, lage belichtingstijden nodig zijn en dit maakt FITC ideaal voor langere time-lapse filmpjes. Maar we routinematig gebruik van een verscheidenheid van verschillende doel vlekken, waaronder Calcofluor White en PKH kleurstoffen en gelabeld organismen. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; De meeste van onze gepubliceerde werk wordt uitgevoerd met behulp van een wide-field microscoop, maar de blootstelling kan verder geminimaliseerd worden door gebruik te maken van een draaiende schijf confocale microscoop en in onze handen is van essentieel belang voor time-lapse 3D-video microscopie. Tijdens dit onderzoek werden beelden opgenomen met een min tussenpozen gedurende 6 uur fagocytose assay. Het interval tussen afbeeldingen kunnen worden aangepast afhankelijk van de werkwijze onderzocht. Bijvoorbeeld kan het interval verlaagd bij het onderzoek snel processen zoals vesiculair transport. De minimale tijdsinterval zal worden beperkt door microscoop en camera specificaties. Er zijn een aantal overwegingen in gedachten te houden bij het aanpassen van timings. Ten eerste, zal het verminderen van de interval tussen snapshots betekent minder punten kunnen worden afgebeeld en de bestandsgrootte zal flink worden verlengd. Integendeel, zal het verhogen van de beeld-interval te veel make van de film verliest continuïteit. Deze benadering kan worden toegepastin principe aan andere pathogenen en opname van stervende gastheer cellen te bestuderen. Zo hebben we onlangs aangetoond dat beenmerg afgeleide macrofagen van sialoadhesine-deficiënte muizen vertonen sterk verlaagde binding en fagocytose van gesialyleerde Campylobacter jejuni 8. Echter, beoogde omvang is een belangrijke determinant voor de haalbaarheid, zoals beeldanalyse wordt het steeds moeilijker met een vermindering van de doelcel grootte. Geavanceerde beeldanalyse software is essentieel voor een snelle videomicroscopie analyse en dient gepaard met geschikte bio steun voor de generatie van algoritmen migratie van individuele cellen en gehele celpopulaties 7 studieprestaties. Live-cell microscopie video in combinatie met geavanceerde beeldanalyse-software voor de minuut tot minuut analyse van migratie en individuele macrofaag-C.albicans interacties, geeft uniek inzicht in de complexiteit van C. albicans fagocytose door macrophages. Er een enorm potentieel om deze werkwijzen uit te breiden naar andere pathogenen en fagocyten (dendritische cellen, neutrofielen) bestuderen en 3D videomicroscopie ontwikkelen image cel-cel interacties nader of meer fysiologische oppervlakken zoals epitheliale en endotheliale cellagen. Deze techniek maakt deel uit van de volgende generatie hulpmiddelen in de studie van gastheer-pathogeen interacties en zal helpen bij het genereren gedetailleerde ruimtelijke en temporele informatie over een breed scala van dynamische processen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Giststikstofbase zonder aminozuren </td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td> Adenine hemisulfaat zout </td><td> Sigma </td><td> A3159-25G </td></tr><tr><td> Agar technische (nr. 3) </td><td> Oxoid </td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G7021-1KG </td></tr><tr><td> SC-Ura dropout </td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> Sigma </td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td> Natriumcarbonaat </td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat </td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </td&gt; <td> Gibco </td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Life Technologies </td><td> 10106169 </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Lonza </td><td> BE17-605E </td></tr><tr><td> LysoTracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35 mm glas-schalen </td><td> PAA </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

live-cel video microscopie van pathogene schimmel fagocytose

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Fagocytische klaring van schimmels en micro-organismen meer in het algemeen worden geacht te bestaan ​​uit vier verschillende fasen: (i) migratie van fagocyten naar de plaats waar ziekteverwekkers zich bevinden; (ii) erkenning van pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) door pattern herkenningsreceptoren (PRRS), (iii) afblazen van micro-organismen gebonden aan het celmembraan fagocyt en (iv) verwerking van overspoeld cellen rijpen in fagosomen en digestie van de opgenomen deeltjes. Studies die fagocytose beoordelen in zijn geheel informatief 1, 2, 3, 4, 5 maar zijn beperkt omdat zij normaal niet het proces af te breken in migratie afblazen en fagosoom rijping, die verschillend kunnen worden beïnvloed. Bovendien zijn dergelijke studies beoordelen opname als een enkele gebeurtenis, niet als een continu dynamisch proces. We hebben recent ontwikkelde geavanceerde live-cell imaging technologieën, en hebben samen deze met genetische functionele analyse van zowelpathogeen en gastheer cellen om een ​​cross-disciplinair platform voor de analyse van aangeboren immuunsysteem cel functie en schimmel pathogenese te creëren. Deze studies hebben aangetoond vernieuwende aspecten van fagocytose die alleen kunnen worden waargenomen met behulp van systematische temporele analyse van de moleculaire en cellulaire interacties tussen menselijke fagocyten en schimmels en besmettelijke micro-organismen meer in het algemeen. Zo zijn we begonnen voor het volgende: (a) de bestanddelen van het celoppervlak voor elke fase van het proces van herkenning, afblazen en doden van schimmelcellen 1, 6, 7, 8, (b) hoe oppervlaktegeometrie beïnvloedt de efficiency van macrofaag opname en doden van gist en hyphale cellen 7, en (c) hoe engulfment leidt tot wijziging van de celcyclus en het gedrag van macrofagen 9, 10. In tegenstelling tot enkel tijdstip snapshots, levende cellen videomicroscopie maakt een grote verscheidenheid van gastheercellen en pathogenen worden bestudeerd continu sequenties over langere perioden, het verstrekken van ruimtelijke en temporele informatie over een breed scala aan dynamische processen, met inbegrip van celmigratie, replicatie en vesiculair transport. Hier beschrijven we in detail hoe u gastheer en schimmelcellen voor te bereiden, en om de video microscopie experimenten uit te voeren. Deze methoden kunnen een door de gebruiker gids voor toekomstige studies met andere fagocyten en micro-organismen.

Hier laten we representatieve resultaten voor C. albicans opname door een murine macrofaag cellijn J774.1 gedurende 6 uur levende cellen videomicroscopie experiment. Figuur 1 is een representatief levende cellen videomicroscopie film geeft fagocytose van C. albicans by murine J774.1 macrofagen. Live-cell microscopie video maakt internalisatie van C. albicans te worden gevisualiseerd zonder de noodzaak om externe Candida kleuring. Tijdens deze experimenten C. albicans werd gekleurd met de pH-gevoelige kleurstof FITC (groen) wordt gedoofd tijdens verzuring van de macrofaag fagosoom en faciliteert de bevestiging dat Candida is geïnternaliseerd (figuur 1). Om verdere steun visualisatie van de ingenomen C. albicans, macrofagen werden gekleurd met de rode fluorescerende kleurstof LysoTracker rood NS-99, dat vlekken zure compartimenten en dient als niet-specifieke marker van fagosoom rijping.Figuur 2 is een foto van een levende cellen videomicroscopie experiment en illustreert de variatie in het aantal C. albicans ingenomen door individuele J774.1 macrofagen. In dit experiment 82% van J774.1 macrofagen overspoeld tenminste een C. albicans cel aan het einde van de 6 uur fagocytose assay. In figuur 3 is het aantal geïnternaliseerde C. albicans cellen per macrofaag beschreven. Het gemiddelde aantal C. albicans up per macrofaag genomen is 3,4, maar interessant macrofagen kunnen innemen tot 16 schimmelcellen. Figuur 4 is een reeks van stilstaande beelden van een representatief levende cellen videomicroscopie experiment geeft een macrofaag fagocyteren C. albicans cellen, hypha groei met de macrofagen en uiteindelijk macrofaag lysis. Figuur 4 illustreert dat videomicroscopie maakt analyse van gebeurtenissen na afblazen van doelwitcellen, dwz data worden gegenereerd voor de killing van macrofagen door C. albicans hyfen in verhouding tot het aantal en morfogenese van ingenomen doelcellen en hoe macrofaag doden betreft fagosoom rijping die bestudeerd kan worden in real time. Figuur 1. Live-cell microscopie video filmpje dat fagocytose van C. albicans by murine J774.1 macrofagen. Macrofagen zijn gekleurd met behulp van de rode fluorescerende kleurstof LysoTracker rode DND-99, en C. albicans worden gekleurd met FITC (groen). Macrofagen en C. albicans werden samen gekweekt gedurende 6 uur bij 37 ° C in volledige CO 2-onafhankelijke medium. Beelden werden vastgelegd met een min tussenpozen gedurende 6 uur. Macrofagen kunnen worden gezien tot oprichting van cel-cel contact met C. albicans, die vervolgens wordt gevolgd door opname van C. albicans in macrofaag fagosomen. Pijlen wijzen C. albicans voorafgaand aan afblazen door J774.1 macrofagen. Deze video laat ook zien dat FITC fluorescentie QuEnc ished volgende afblazen van C. albicans. Scale bar, 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">Klik hier om film te bekijken</a> . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> Figuur 2. Representatieve levende cellen videomicroscopie stilstaand beeld met variatie in het aantal C.albicans overspoeld door individuele macrofagen. Macrofagen (rood gekleurd met LysoTracker NS-99) werden samen gekweekt met FITC-gekleurde C. albicans (groen). Er variatie in het aantal C. albicans overspoeld (een getal naast een pijl geeft het aantal van C. albicans overspoeld), en met C. albicans morfologie (dwz gist verzen hypha). Schaal bar, 20 urn. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> Figuur 3. Grafiek met het aantal C. albicans ingenomen per J774.1 murine macrofagen eind 6 uur fagocytose assays. De gegevens stellen 2 onafhankelijke experimenten. Een totaal van 100 macrofagen werden geteld vanaf 3 velden van elk experiment, wat een totaal van 600 individuele macrofagen. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> Figuur 4. Een reeks beelden van een representatief levende cellen videomicroscopie experiment toont een macrofaag (M) en C. albicans (C) voorafgaand aan en tijdens herkenning (A, B) en tijdens en na opname (C, D). C. albicans hyfen blijven groeien binnen de macrofagen (E, F), wat kan resulteren in macrofaag lysis (G). Andere macrofagen worden gerekruteerd voor de site van breuk en poging om de vrijgekomen C. innemen albicans (H). Macrofagen zijn gekleurd met behulp van de rode fluorescerende kleurstof LysoTracker rode DND-99, en C. albicans worden gekleurd met FITC (groen). Merk op dat FITC kleuring wordt gedoofd na C. albicans opname door macrofagen J774.1 (C). Schaal bar, 10 urn.

We beschrijven werkwijzen voor levende cellen videomicroscopie van<em&gt; Candida albicans</em&gt; Fagocytose door macrofagen. Met deze methoden kunt stadium-specifieke analyse van macrofaag migratie, erkenning, afblazen en fagosoom rijping en onthullen nieuwe aspecten van fagocytose.

Live-cel Video Microscopie van pathogene schimmel Fagocytose

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Het algemene doel van deze procedure is om een videomicroscopie-experiment met levende cellen uit te voeren om fagocytose van de humane schimmelpathogeen candida albicans te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst de candida albicans een nacht te kweken, zodat ze hun stationaire fase ingaan. De volgende stap is om J 7 74 macrofagen in 35 millimeter glazen beeldaschalen met glazen bodem te plaatsen en ze een nacht te kweken.De volgende dag worden candida albicans gekleurd met pH-gevoelige Zi en de zure organellen van de macrofagen worden gekleurd met liso tracker red. De laatste stap is om een video te maken van de fagocytose-assay waarbij de J 7 7 4 macrofagen worden gekweekt met de candida albicans. Uiteindelijk kan de resulterende video een fase Pacific-analyse van macrofaag migratie, herkenning, insluiting en FGA-zone rijping tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals immunocytochemie, is dat live videomicroscopie kan worden gebruikt om waargenomen verschillen op te splitsen in afzonderlijke stadia, zoals migratie, insluiting en fagosoombesturing, die mogelijk worden beïnvloed. Differentieel kan deze methode inzicht geven in de fagocytose van Canada Acan. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals andere pathogenen, fagocyten, inclusief dendritische cellen en neutrofielen.Deze kweek vereist geavanceerde voorbereiding van SC minus U agar platen. Ze kunnen gekoeld worden bewaard, begin met het strekken van candida albican serotype, een stam CI vier plus CLP 10 van glycerolvoorraden bewaard bij min 80 graden Celsius op een SC U agar plaat. Bewaar de plaat bij 30 graden Celsius totdat kolonies zich vormen, typisch 48 uur.Op dit punt kan de plaat worden bewaard bij vier graden Celsius totdat het klaar is om te worden gebruikt. Neem nu een enkele kolonie en kweek deze in vijf milliliter SCU of medium een nacht bij 30 graden Celsius op een slingerset ingesteld op 200 RPM. Dit zal stationaire fase candida albicans genereren.Voeg 10 microliter van de candida albicans overnachtcultuur toe aan 990 microliter PBS met pH 7,4 en voer een celtelling uit met behulp van een hemo cytometer om de candida albicans te visualiseren tijdens de fagocytose-assays. Kleur 100 miljoen candida gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker met Zi. Verwijder vervolgens de ongebonden fitzy door de candida albicans drie keer in PBS te wassen om de candida te centrifugeren bij 3000 keer G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en hersuspendeer het pellet in één milliliter PBS Reese.Suspendeer het uiteindelijke pellet in PBS met een concentratie van 1 miljoen cellen per microliter. Voor dit protocol, heb een kweek van J 7 7 4 0,1 macrofagen bereid in 75 centimeter vierkante weefselkweekkolven in gesupplementeerd DMEM bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide uit de kolf. Schap de macrofagen en breng ze over naar een 50 milliliter Falcon buis Centrif.Gebruik de macrofagen bij 600 keer G gedurende vijf minuten om een cel palet te verkrijgen. Verwijder het supernatant en hersuspendeer het pellet in 10 milliliter voorwaarme gesupplementeerd DM dmm. Tel nu de cellen met behulp van een hemo cytometer en plaats 1 miljoen cellen in een 35 millimeter glazen beeldaschaal met twee milliliter gesupplementeerd DMM-medium.Bewaar de schaal een nacht bij 37 graden Celsius en met 5% koolstofdioxide de volgende dag. Voorafgaand aan het beeldvormen, vervang het gesupplementeerde DMM-medium door twee milliliter voorwaarme koolstofdioxide onafhankelijk medium dat een micromolar Liso tracker red DND 99 bevat, en dezelfde supplementen als de dmm. De microscoopopstelling moet een omgekeerde stage en een omgevingskamer omvatten die is verwarmd tot 37 graden Celsius en excitatie-emissiefilters voor de gekozen kleurstoffen, namelijk fitzy en trixy.In dit voorbeeld wordt een toegepaste precision delta vision core gebruikt. Schakel eerst de microscoopverwarmer in zodat de controlekamer warm is tot 37 graden Celsius. Schakel vervolgens de microscoop en computer in en laad de beeldvormingssoftware, monteer de beeldaschaal op de microscoopstage en pas de focus aan om de J 7 74 0,1 macrofagen te vinden.Optimaliseer het uiterlijk van trixi en DIC-beelden door het percentage doorgelaten licht en de belichtingstijden aan te passen. Verwijder de beeldaschaal en voeg 3 miljoen fitsy gekleurde candida albicans toe aan de schaal. Noteer de tijd en plaats de schaal terug op de stage, optimaliseer indien nodig het uiterlijk van fitsy-beelden en stel de interessepunten in de beeldvormingssoftware in indien vereist.Begin nu met het beeldvormen wanneer alle punten scherp staan en de kanalen zijn geoptimaliseerd. Leg fitsy, trixi en DIC-beelden vast elke minuut gedurende zes uur. Dit is het meest cruciale stadium in de procedure.Er moet tijd worden genomen om de microscoop correct in te stellen. Als de films onder- of overbelicht zijn of als ze niet scherp staan, zullen ze onbruikbaar zijn en zal het experiment moeten worden herhaald. Deze representatieve video toont de opname van candida albicans door de muismacrofaagcellijn J 7 74 0,1.Tijdens een zes uur durend videomicroscopie-experiment met levende cellen werd de candida albicans in groen gekleurd met behulp van de pH-gevoelige kleurstof fitsi, die werd geblust tijdens acidificatie van de macrofaagfagosoom. Hierdoor werd bevestigd dat wanneer de candida werd geïnternaliseerd, de zure compartimenten van de macrofagen werden gekleurd met een rood fluorescerende kleurstof. Merk de variatie op in het aantal candida albicans dat door afzonderlijke J 7 74 0,1 macrofagen wordt ingeslikt in dit experiment, 82% van de J 7 74 0,1 macrofagen slikte binnen de zes uur minstens één candida albican cel in.Het gemiddelde aantal candida albicans dat per macrofaag werd opgenomen was 3,4, maar interessant genoeg konden macrofagen tot 16 schimmelcellen inslikken. De gegevens laten observatie toe van macrofagen en candida albicans vóór en tijdens herkenning en opname. Candida albicans hyer kan blijven gro

live-cell-video-microscopy-of-fungal-pathogen-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We laten zien, hoe twee-foton microscopie gebruikt voor de observatie van de dynamiek van neutrofiele granulocyten in de longen besmet terwijl ze fagocyteren pathogenen of produceren neutrofielen extracellulaire vallen (NET).

Directe observatie van fagocytose en de NET-vorming door neutrofielen in Infected longen met behulp van twee-foton microscopie

Er wordt een methode beschreven om levende pathogenen individueel te selecteren, te manipuleren en te beelden met behulp van een optische pincet gekoppeld aan een spinning disk-microscoop. De optische pincet biedt ruimtelijke en temporele controle over de organismen en plaatst deze naast gastheercellen. Fluorescentiemicroscopie legt dynamische intercellulaire interacties vast met minimale verstoring van de cellen.

Het gebruik van een optische val voor de Studie van gastheer-pathogeen interacties voor Dynamic live cell imaging

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Hier laten we zien hoe beeldcytometrie kan worden gebruikt voor kwantificering van pathogene schimmels in samenhang met gastheercellen in kweek. Deze techniek kan worden gebruikt als alternatief voor CFU opsomming.

Gebruik van Afbeelding Cytometry voor kwantificering van pathogene schimmels in associatie met gastheercellen

We beschrijven hoe om te visualiseren macrophage- C. neoformans (Cn) interacties in real time, met bijzondere nadruk op het proces van niet-lytische exocytose middels digitale lichtmicroscopie. Met deze techniek individueel geïnfecteerde macrofagen kunnen worden bestudeerd om verschillende aspecten van dit verschijnsel bepalen.

Visualiseren Non-lytische Exocytosis van Cryptococcus neoformans Van Macrofagen behulp Digital Light Microscopy

Hier beschrijven we een microscoopgebaseerde techniek om de vroege cascades van gebeurtenissen tijdens fagocytose van pathogenen zoals de schimmels Candida albicans en deeltjes die groter zijn dan 0,5 µm, waaronder zymosan en IgG-gecoate kralen, te visualiseren en te kwantificeren.

Het visualiseren van de vroege stadia van Phagocytosis

Hier beschrijven we een protocol om antifungale activiteit van primaire menselijke immuuncellen te beoordelen in real-time met behulp van fluorescente Aspergillus reporter conidia in combinatie met live-cell video microscopie en flowcytometrie. Gegenereerde data inzicht in gastheer Aspergillus cel-interacties zoals fungicide werking, fagocytose, celmigratie remming van de schimmelgroei.

Live-Imaging van antischimmelactiviteit door Human Primary neutrofielen en monocyten in reactie op<em&gt; A. fumigatus</em

Plant defensinen spelen een belangrijke rol in de verdediging van de plant tegen ziekteverwekkers. Voor effectief gebruik van deze antischimmel peptiden als antischimmel gemachtigden, begrijpen hun vervoerswijzen actie (MOA) is van cruciaal belang. Hier, wordt een live-cel beeldvorming beschreven om te bestuderen van kritieke aspecten van de MOA van deze peptiden.

Live-cel beeldvorming van schimmel cellen om modi van binnenkomst en Subcellular Localisatie van antischimmel Plant defensinen te onderzoeken

Vitale fluorescerende kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor Live-celbeeldvormings analyses in moderne schimmel celbiologie. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-/exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels.

Toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor het beeldvorming van filamenteuze schimmels in levende cellen

Het mechanisme geassocieerd met fagocytose bij Leishmania-infectie blijft slecht begrepen. Hier beschrijven we methoden om de vroege gebeurtenissen te evalueren die plaatsvinden tijdens leishmania-interactie met de gastheercellen.

Onderzoek naar de fagocytose van Leishmania met behulp van confocale microscopie

Dit manuscript beschrijft een geoptimaliseerd inoculatieprotocol dat gebruik maakt van losse maïsbladomhulsels voor reproduceerbare cytologische, fysiologische en moleculaire studies van maïsinteracties met schimmelpathogenen van planten. De bladomhulsels vergemakkelijken real-time observatie van cellulaire interacties tussen de levende plant en de schimmel in niet-gefixeerde weefsels.

Losse maïsomhulsels voor levende beeldvorming van infectie door schimmelpathogenen van bladmaïs

Leer live-cel video microscopie voor fagocytose van Candida albicans door macrofagen. Deze methode analyseert migratie, herkenning, opname en fagosoomrijping in real-time voor immunologisch onderzoek.

Live-cel Video Microscopie van pathogene schimmel Fagocytose

Meer video's verkennen