Name: Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Leer tijdverloopbeeldvorming van primaire preneoplastische epitheelcellen uit genetisch gemodificeerde muismodellen van borstkanker. Deze methode onthult hoe genetische letsels celgedrag beïnvloeden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Bofan Wu en christelijke Raithel bedanken voor technische bijstand en Michael Rieger voor zijn kennismaking met live-cell imaging. Ondersteund door NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Ministerie van Defensie W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) programma via de National Research Foundation van Korea gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Knaagdieren Barrier Facility Equipment) en NIH NCI 5P30CA051008 (Microscopie en Imaging en Animal Gedeelde bronnen).

<html> 1. Algemene Regeling <ol><li> Genereren primaire kweken van preneoplastische mammaire epitheelcellen melkklieren van genetisch gemanipuleerde en controle wild-type muizen. </li><li> Het mogelijk &#39;live-cell beelden elke 15 min met behulp van Volocity beeld acquisitie software (versie 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) voor maximaal 5 dagen. </li><li> Direct bekijken time-lapse beelden naar de timing en het mechanisme van epitheliale cellen kolonievorming, incidentie van apoptose, en fasering van morfologische veranderingen te beoordelen. </li><li> Converteer gegenereerd Volocity. TIFF stacks aan. JPG-bestanden met behulp van Metamorph Microscopie Automation &amp; Image Analysis Software (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) en naam van digitale beeldbestanden (DE Rename 2.1.6, <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get / Systeem / Bestand-management / DE-Rename.shtml</a> ) om de compatibiliteit met het Volgen van Tool Timm&#39;s (TTT mogelijk te maken,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html). </li><li> Met behulp van TTT, genereren lot van de cel kaarten voor het bepalen van de tijd tussen celdelingen (cel levensduur) en de patronen van de celdeling (symmetrische versus asymmetrische). </li><li> Analyseren kwantitatieve gegevens van stappen 3 en 5 om te bepalen of er statistisch significante verschillen tussen verschillende genetisch gemanipuleerde muis modellen en / of wild-type controles. </li></ol> 2. Generatie van primaire borstkanker epitheelcellen Cultures <ol><li> Bereid Compleet Media voor het isoleren van een borstklier epitheliale cellen na een variatie van instructies van de fabrikant (EpiCult-B Muis Medium Kit, Stemcell Technologies, Vancouver, BC). Combineer 450 ml Epi-Cult-B medium, 50 ml Epi-Cult B proliferatie supplement, 5% foetaal runderserum (FBS), 50 ug / ml penicilline / streptomycine (PenStrep) en 10 ng / ml epidermale groeifactor (EGF). </li><li> Dissociatie Media bereiden door het combineren van een deel van een 10x Collagenase / Hyaluronidase mengsel met 9 onderdelen Complete Media van 2,1. </li><li> Euthanaseren muis en onmiddellijk naar necropsie verricht. Plaats de muis op zijn rug op een piepschuim autopsie platform en zet alle vier de ledematen, zodat ventrale huid strak staat. Verzadig ventrale huid en haar, met inbegrip van die bovenop de ledematen, met 70% ethanol. Bloot # 2/3 (thorax) en # 4/5 (lies) melkklieren door een incisie door de huid (niet in de peritoneum) die in een Y-incisie verlengd door de mediale huid van elke voorste ledemaat en een omgekeerde Y incisie door de mediale huid van elke achterste ledematen. </li><li> Met behulp van stompe dissectie, de huid te scheiden van underlyingperitoneum, terug te trekken aan beide zijden van de huid totdat het strak en bevestig het aan de piepschuim necropsy platform met behulp van pinnen. Vanaf de buitenzijde, stompe dissectie met verstandig gebruik van Dissectie schaar om de intacte lies en / of thoracale borstklieren van onderliggende bindweefsel en spieren te isoleren. Plaats niet meer dan twee melkklieren in een 10 cm steriele petrischaal en naar weefselkweek kap. </li><li> In weefselkweek kap, onderzoeken klieren voor borstklieren lymfeklieren die zijn geïdentificeerd als kleine, welomschreven nodules met een geelachtige kleur. Verwijder lymfeklieren uit de omliggende klier met behulp van steriel scalpel en pincet. Mince borstweefsel in ~ 1 mm 3 blokjes met twee steriele scalpels, een in elke hand. </li><li> Place gehakt borstweefsel in 5 ml Dissociation Media, mix voorzichtig en neer te pipetteren 2-3 keer met een 10 ml pipet, en incubeer overnacht (tot ongeveer 16 hr) in een 37 ° C incubator met 5% CO 2 in een 50 ml conische buis met los deksel. </li><li> De volgende ochtend bereiden een koud mengsel van Balanced Salt Solution 1 deel Hanks &#39;(HBSS) die 2% FBS en 4 delen gebufferde ammoniumchlorideoplossing op rood bl viaood cellyse (HFAmCl) als koude HBSS aangevuld met 2% FBS (HF). Voorverwarmen trypsine-EDTA (0,25%), 5 mg / ml in Dispase Balanced Salt Solution Hank&#39;s Modified, 1 mg / ml DNase I, en Complete Media. </li><li> Verwijder de conische centrifugebuis met het borstweefsel uit de incubator en zachtjes pulseren vortex 2-3 sec tweemaal. Centrifugeer het buisje bij 450 xg gedurende 5 minuten (kamertemperatuur of 4 ° C), en verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de pellet in een minimum van 10 ml en centrifugeer HFAmCl bij 450 xg gedurende 5 minuten (kamertemperatuur of 4 ° C) en verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 3 ml trypsine-EDTA op de pellet en meng eerst met een 5 ml pipet en vervolgens met een P1000 micropipettor tot vezelig (1-3 min). Voeg 10 ml HF, centrifuge bij 450 x g gedurende 5 minuten (kamertemperatuur of 4 ° C) en verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 2 ml van 5 mg / ml Dispase en 200 ul 1 mg / ml DNase I van de pellet en meng met een P1000 micropipettor 1 minuut. Monster moet worden cloUdy maar niet draderig. Als vezelig, voeg 100 ul van DNase I en meng opnieuw. </li><li> Voeg 10 ml koud HF, spanning door een 40 pm celzeef en centrifugeer bij 450 xg gedurende 5 minuten (kamertemperatuur of 4 ° C) en verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de laatste pellet in Complete Media. Kwantificeren het totale aantal cellen (met een hemocytometer of Coulter Counter). Twee borstklieren opbrengst ongeveer 1 x 10 6 tot 1 x 10 7 cellen. Plaat primaire epitheliale cellen in een platbodem-6-well plaat met een dichtheid van 1,5 x 10 5 cellen per well. </li></ol> 3. Live-cell imaging <ol><li> Onmiddellijk na het uitplaten van de cellen stevig plaats de 6-well plaat op een microscooptafel in een 5% CO2 / verzadigde humidity/37 ° C temperatuur incubatiekamer. Pas de condensor voor Kohler verlichting en het centrum van de fasen. Voor de hier gepresenteerde experimenten, een omgekeerde Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Spinning Disc Confocalemicroscoopsysteem in groothoek fasecontrast mode met een 10x objectief gebruikt. </li><li> Open beeldacquisitie software, maken en een naam van een bibliotheek voor de time-lapse beelden, en op te slaan op een locatie met voldoende ruimte voor grote bestanden. De experimenten die hier gebruikt Volocity beeld acquisitie software (versie 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA). </li><li> Laat de plaat in de microscoop incubator equilibreren minimaal 15 minuten. Laat de lenzen aan stage-lens interferentie te voorkomen. Onder de &quot;Stage&quot; rubriek, selecteert u &quot;Calibrate Stage.&quot; Opnieuw op te pakken het brandvlak, set Z = nul onder de x, y, z tab en merk beeldvorming punten door te kiezen voor &quot;Add punt&quot; onder de &quot;Stage&quot; rubriek. Plaats punten in het midden van elk putje van de 6-well plaat voor beeldvorming als fasecontrast beeldvorming kan worden vervormd nabij de omtrek van kunststof putjes. Regelen punten in een vierkant in 4 x 4 gebied (650 um x 700 urn velden), elk met een kleine overlap (ongeveer 5%). Sla de geselecteerde punten onder &quot;Stage. &quot; </li><li> Onder &quot;Stage&quot; selecteer &quot;Make aandacht kaart&quot; en volg de instructies om de focus van elk punt. Stel beeldacquisitie timing om 4 foto&#39;s per uur (elke 15 min) vast te leggen. Dit kan worden aangepast aan de eisen van de specifieke experiment. Sla de focus kaart onder &quot;Stage&quot;. </li><li> Klik met de rechtermuisknop op de rechterkant werkbalk &quot;Image Acquisition&quot; en sla de beeldvorming instellingen. Druk op de opnameknop om de beeldvorming te beginnen. Na 1 uur, controleer dan de focus van de foto&#39;s om te zien of aanpassing nodig is. </li><li> Monitor en blijven live beeldvorming gedurende 5 dagen, eindigt wanneer cellen confluent. </li></ol> 4. Direct Bekijken van Time-lapse beelden naar Timing en Mechanisme van Initial epitheelcellen Colony Vorming, incidentie van apoptose, en fasering van morfologische veranderingen beoordelen <ol><li> Directe weergave van time-lapse beelden kunnen uitvoeren met behulp van een compatibele video viewing software (bijv. <a href="http://www.real.com/" target="_blank">http:</a>/ / Www.real.com/ realplayer of andere freeware of in de handel verkrijgbare software). Afbeeldingen kunnen worden bekeken in. TIFF-indeling in deze stap of na conversie naar. JPG-bestanden (zie stap 5). </li><li> Om het mechanisme van de initiële kolonievorming te bepalen, te beginnen met een single-image stack gelijk aan een beeldvorming site op de plaat. In de eerste frames zullen cellen te zweven. Volg seriële beelden te bepalen wanneer de eerste epitheelcel hecht aan de plaat. Bij deze stap kan epitheelcellen worden geïdentificeerd en onderscheiden van fibroblasten door de meer kubische morfologie. Volg deze enkele epitheelcellen via seriële beelden en volg zijn lot gedurende de volgende 24 uur. Neem als het wordt omringd door extra epitheelcellen of ondergaat celdeling of apoptose. Als omgeven door epitheelcellen, kan het mechanisme van kolonievorming direct worden bepaald door het bekijken als de omringende cellen afkomstig zijn van drijvende cellen die vervolgens aggregeren met de eerste hechtende cellen (s) ofvan verdeling van de eerste hechtende cel. Noteer het aantal kolonies gevormd door celaggregatie versus celdeling tijdens de eerste 24 uur. </li><li> Het aantal eerste hechtende cellen die apoptose ondergaan gedurende een bepaalde periode te bepalen, volgt seriële beelden van het voorkomen van klassieke eigenschappen van apoptose ontwikkelen in een cel die is adherent ( <a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a> ), en het aantal apoptotische cellen die tijdens de gehele duur van de imaging of binnen bepaalde tijd frames opgenomen. </li><li> Tijd, epitheliale cellen in kweek wijzigt hun morfologie van een eerste kubische vorm naar een meer langwerpige uiterlijk overeen met EMT. Volg seriële beelden naar de dag / uur te bepalen na plating wanneer dit gebeurt. </li></ol> 5. Image File Wijziging <ol><li&gt; Door de Volocity software, exporteer de beeldbestanden naar TIFF stapels. Hier Metamorph Microscopie Automation &amp; Image Analysis Software (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) werd gebruikt om de TIFF-stack-bestanden te openen en ze werden vervolgens opgeslagen in Metamorph als single. JPG-afbeeldingen. </li><li> Wijzig de naam van het beeld mappen en bestanden op basis van de eisen voor Tracking Tool Timm&#39;s Gebruik een freeware programma als DE Rename 2.1.6 ( <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml</a> ) om bestanden te hernoemen in groepen. Maak een map met daarin alle mappen en bestanden van het experiment en de naam van de map (bv. </em&gt; EXPERIMENTNAME). </li><li> Maak een submap voor elk punt / positie waar de cultuur werd in beeld gebracht. Noem de submappen: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. De positie nummer moet 3 cijfers. Voorbeeld: 072511RN_p001. Plaats alle beeldbestanden van die individuele positie in de submap. </li><li> Voeg de tijdpunt (met 5 cijfers) en het kanaalnummer (want er is maar een helder veld kanaal, gebruik dan &quot;0&quot;) aan het eind van elke bestandsnaam in dit formaat: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg </li><li> Genereer een logbestand voor elke positie door eerst het downloaden van de gratis programma TTTlogfileconverter van de TTT website. Start het TTTlogfileconverter programma en selecteer het experiment map. Ingang een beeld interval (in seconden). Voor een foto genomen om de 15 minuten, voer 900 sec. Druk vervolgens op de groene geheime logbestanden te drukken. </li></ol> 6. Generatie van Cell Fate Kaarten van Single cellen met behulp van TTT <ol><li> Create een map met de naam TTTexport en een submap met de naam TTTfiles waar alle cell tracking gegevens worden opgeslagen volgens TTT software-instructies </li><li> Start het TTT-programma, selecteer de gebruiker initialen, en klik op &quot;Doorgaan.&quot; </li><li> Druk op de &quot;Set NAS,&quot; selecteer de gebruiker die aangemaakt &quot;TTTexport&quot; map en klik op OK. In de browser, selecteert u een experiment map, selecteert u een positie map en druk vervolgens op &quot;Load positie&quot; knop te drukken. </li><li> Stel oculaire factor &quot;10X&quot;. Laad het aantal benodigde beelden (het laden van alle afbeeldingen wordt aanbevolen voor de eerste keer). </li><li> In cel editor venster, selecteer &quot;Nieuw kolonie&quot; onder het menu Bestand. In het venster Film, drukt u op de &quot;Track cel&quot; of F2 om te beginnen met het bijhouden van een cel. </li><li> Identificeren van een cel in de Movie venster en gebruik de muis om de cursor te plaatsen op de cel. Een cirkel met het nummer van de cel dient na F2 is geklikt. Gebruik de &quot;0&quot; toets op het numerieke toetsenblok van het toetsenbord om de plaatsing van de cel en van tevoren te volgen naar de volgende afbeelding. De cursor naar de plaats van elke cel volgen door elk frame. Om een ​​track te wissen en terug te keren naar het vorige beeld drukt u op &quot;Del&quot; op het numerieke toetsenblok. Om vooruit te gaan zonder frames bijhouden van de cel pers &quot;3&quot;, en om terug te gaan zonder het bijhouden van druk op &quot;1&quot; op het numerieke toetsenblok. </li><li> Ter gelegenheid van een celdeling de &quot;Division&quot; knop te klikken in het venster Film. Om celdood markeren klikt u op de &quot;Cell death&quot; knop in het venster Film. Zodra een afdeling heeft plaatsgevonden, kan de dochtercellen worden bijgehouden in dezelfde cel lot kaart door met de rechtermuisknop te klikken op de cirkel het symbool van de aangewezen dochter cel in de Cell editor venster om te beginnen het volgen automatisch. </li><li> Druk op F10 om de boom te redden. Elke boom zal opslaan in de daarvoor bestemde uitgang vouwer (TTTExport). Om een ​​nieuw lot van de cel kaart starten, selecteert u &quot;Nieuwe kolonie&quot; onder het &quot;Bestand&quot; en vervolgens &quot;Open&quot; menu in de Cell editor venster. </li><li> Maak een tabel cel levensduur van gegevens na het verzamelen van &quot;Cell gegevens&quot; tab in het Cell editor venster. </li></ol> 7. Statistische analyses <ol><li> Gebruik een Student&#39;s t-test (indien vergelijken van twee genotypes) of ANOVA (indien vergeleken&gt; twee genotypen) om te bepalen of verschillen in parametrische data zoals het aantal initiële cel kolonies cel levens of uren tot het verschijnen van EMT verschillende genotypen zijn statistisch significant. Apoptotische frequentie kan worden vergeleken als het nummer / aantal cellen geplateerd met Student&#39;s t-test of ANOVA of Mann-Whitney of Kruskal-Wallis bij afgeleid als een percentage hechtende cellen. </li><li> Vermogensmeting proeven met gegevens van analyses van initiële experimenten te bepalen hoeveel experimentele duplo uitgevoerd en moeten lot van de cel kaarten gegenereerd voor elke herhaling adequate statistical stroom met behulp van beschikbare freeware (bijv. <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a> ). In de hier gepresenteerde experimenten, celculturen afgeleid van drie muizen per genotype voldoende waren om te bepalen of er statistisch significante verschillen in cel kolonievorming en cel levensduur bij specifieke genetische wijzigingen werden aangebracht. </li></ol>

<ol><li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li>
<li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li>
<li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+M+%22Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer%22">Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer</a>. Ip, M., Asch, B. , Kluwer Academic, Plenum Press. (2000).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li>
<li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li>
<li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+hematology%22%5BJournal%5D)">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li>
<li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li>
<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Kritische stappen Het is belangrijk dat melkklieren worden geoogst uit muizen van dezelfde leeftijd te controleren voor leeftijdsgerelateerde variabiliteit in mammaire epitheelcellen gedrag. Bij uitplaten van de cellen, moet hetzelfde aantal cellen worden uitgeplaat in elk putje voor elk experiment. Cellen moeten relatief dun als plateren zodat culturen worden niet confluent te snel waardoor het mogelijk meerdere individuele cellen volgen door seriële beelden. Het is essentieel dat de plaat in ...

Genetisch gemanipuleerde muismodellen zijn instrumenten te bestuderen en te begrijpen hoe verschillende genetische afwijkingen bijdragen aan het risico op het ontwikkelen van borstkanker. Bijvoorbeeld genetisch gemanipuleerde muizen aangetoond dat de combinatie van drie factoren: verlies van de volledige lengte borstkanker 1, early onset (BRCA1) gen in mammaire epitheelcellen, p53 tumor (TP53) germinale haploinsufficiëntie en mammaire epitheliale cel gerichte upgereguleerd oestrogeen receptor alpha (ERa) expressie resulteert in de ontwikkeling van borstkanker in 100% van BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse borsttumorvirus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetracycline transactivator (rtTA muizen met 12 maanden in vergelijking met de lagere percentages gerapporteerd in BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - muizen zonder ERa over-expressie (~ 50 - 60%) en BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre muizen zonder TP53 haploinsufficiëntie (&lt;5%) 1. Dynamic time-lapse beeldvorming van het gedrag van preneoplastische primaire mammaire epitheelcellen toont verschillen in celgedrag die minder gemakkelijk gewaardeerd statische weefselcoupes. Veranderingen in proliferatie en differentiatie worden waargenomen in primaire borstklieren cellen van menselijke BRCA1 mutatie dragers. 2 Oprichting van single-cell suspensies van primaire borstklier epitheliale cellen van normale en genetisch gemanipuleerde muizen worden gegenereerd door middel van enzymatische dissociatie van operatief verwijderde borstklierweefsel. 3 Time-lapse beelden worden bekeken op mechanisme en de timing van cel kolonie uiterlijk en de incidentie van morfologische veranderingen in cellen met inbegrip van epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) en apoptose te beoordelen. Genereren van lot van de cel kaarten, zijn kwantificering van de lengte van de tijd tussen celdelingen (cel levens), en de bepaling van de modellen van de celdeling vergemakkelijkt door het gebruik van single-cell tracking. TimmTracking Tool &#39;s (TTT) is publiekelijk beschikbare software wordt gebruikt om single-lot van de cel kaarten te genereren. Het nut in ophelderen mechanismen van cel lot is vastgesteld 4,5 onderzoeken normale hematopoietische stamcellen ontwikkeling 6-9 en het genereren van neuronen 10.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> EpiCult-B Basal Medium Mouse </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B proliferatieverdrag Supplementen Mouse </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td> recombinant humane epidermale groeifactor (rhEGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase / Hyaluronidase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td> Wegwerp Scapels </td><td> Veer </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Balanced Salt Hanks &#39;oplossing </td><td> StemCell Technologies </td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> Eenmmonium Chloride </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 urn celzeef </td><td> StemCell Technologies </td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> Penstrep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging kunnen worden gebruikt om het gedrag van gekweekte primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen uit verschillende genetisch gemanipuleerde muizen modellen van borstkanker te vergelijken. Zo kan tijd tussen celdelingen (cel levensduur), apoptotische aantal cellen, evolutie van morfologische veranderingen, en het mechanisme van kolonievorming worden gekwantificeerd en vergeleken cellen die specifieke genetische lesies. Primaire borstklier epitheliale celculturen worden gegenereerd uit melkklieren, zonder voelbare tumor. Klieren zijn zorgvuldig gereseceerd met duidelijke scheiding van aangrenzende spieren, worden lymfeklieren verwijderd, en single-cell suspensies van verrijkte borstklier epitheliale cellen worden gegenereerd door hakken borstweefsel gevolgd door enzymatische dissociatie en filtratie. Eencellige suspensies worden uitgeplaat en direct onder een microscoop in een incubator kamer voor levende cellen imaging. Zestien 650 um x 700 urn velden in een 4x4-configuratie van elk well van een 6-well plaat belicht worden elke 15 minuten gedurende 5 dagen. Time-lapse beelden worden onderzocht rechtstreeks cellulaire gedrag dat mechanisme en de frequentie van kolonievorming cellen kunnen bestaan ​​binnen de eerste 24 uur van het uitplaten van de cellen (aggregatie versus celproliferatie), incidentie van apoptose en fasering van morfologische veranderingen te meten. Single-cell tracking wordt gebruikt om lot van de cel kaarten voor het meten van individuele cel levens en het onderzoek van de celdeling patronen te genereren. Kwantitatieve gegevens worden statistisch geanalyseerd voor de evaluatie significante verschillen in gedrag gecorreleerd met specifieke genetische lesies.

Epitheliale en fibroblast cellen kunnen worden onderscheiden door celmorfologie. Epitheelcellen een kubische vorm (Figuur 1A-B) en vorm celkolonies (Figuur 1A). Fibroblasten, een type stromale cellen, een langwerpige morfologie (figuur 1C). Cellen werden afgerond en drijven bij het ​​begin van imaging (figuur 2A-D). Na bevestiging aan de plaat werden ze plat en toonde een kubische-type weergave (figuur 2E, H).</stron...

Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om te bepalen of genetische letsels die predisponeren voor borstkanker het gedrag van pijnappelklier plastic geheugencellen in primaire cultuur veranderen. Dit wordt bereikt door primaire mammaire epitheelcellen te isoleren uit genetisch gemanipuleerde muizen. Als tweede stap wordt live cell time-lapse beeldvorming gedurende vijf tot zeven dagen uitgevoerd, waarbij een film wordt gemaakt om het celgedrag te analyseren.Vervolgens wordt een softwareprogramma dat enkele cellen volgt, gebruikt om het gedrag van cellen te kwantificeren en te vergelijken die zijn geïsoleerd uit verschillende genetisch gemanipuleerde muismodellen van borstkanker. De resultaten tonen aan dat specifieke genetische letsels verschillend gedrag induceren in de preneoplastische geheugen. Epitheelcellen op basis van kwantitatieve gedragsanalyses uitgevoerd met behulp van single cell tracking.Hoewel deze methode inzicht kan geven in hoe verschillende genetische letsels het gedrag van preneoplastische mammaire epitheelcellen veranderen. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals preneoplastische, cellen van andere organen, kankercellen van alle organen, inclusief de studie van mogelijke therapie-geïnduceerde gedragsveranderingen, evenals vergelijkingen van stromacelgedrag uit normaal en kankerweefsel dat de procedure demonstreert. Vandaag zal Dr. Priscilla Firth, senior auteur van deze publicatie, en Pete Johnson, manager van het gezamenlijke centrum voor microscopie en beeldvorming aan het Lombardi Cancer Research Center aan de Georgetown University zijn.Het doden van een muis en onmiddellijk verdergaan met de necropsie. Plaats de muis rugwaarts op een styrofoam necropsieplatform en zet alle vier ledematen vast zodat de ventrale huid strak is. Verzadig de ventrale huid en haren, inclusief de huid op de ledematen met 70%ethanol.Bloot de tweede en derde en vierde en vijfde borstklieren met een middenlijn incisie door de huid. Verleng de incisie met twee Y-sneden door de mediale huid van de vier ledematen. Wees voorzichtig om niet het peritoneum binnen te gaan met behulp van een stompe dissectie.Scheiden de huid van het onderliggende peritoneum. Trek terug aan beide zijden van de huid totdat deze strak is en prik het vast aan het platform beginnend aan de buitenzijde. Gebruik de schaar om een stompe dissectie te maken die de intacte inale en/of thoracale borstklieren isoleert van het onderliggende bindweefsel en spier.Plaats een of twee borstklieren in een 10 centimeter Petri schotel en verplaats naar een weefselcultuur kap. Onderzoek nu de klieren op mammaire lymfeklieren. Kleine goed omschreven knobbeltjes met een gele kleur.Gebruik een scalpel en tang om ze van de omringende klier te verwijderen. Snijd het mammaire weefsel in millimeter grote blokjes met behulp van twee scalpels. Plaats het gehakte mammaire weefsel in een 50 milliliter conische buis met vijf milliliter dissociatiemedium.Meng het voorzichtig en incubeer het een nacht. Houd de dop los de volgende dag. Isolateer en kweek de primaire epitheelcellen.Onmiddellijk na het platen van de cellen. Plaats de zes welplaat veilig op een microscooptafel binnen een incubatiekamer. Laat de plaat minimaal 15 minuten gelijkwaardig zijn.Pas de condensator aan voor Kohler verlichting en centreer de faseringenen. Open de beeldverwervingssoftware zoals velocity en maak een bibliotheek aan voor de time-lapse beelden en sla het op naar een locatie met voldoende ruimte voor grote bestanden. Laat de lenzen zakken om interferentie tussen de tafel en de lenzen te voorkomen.Onder de tafelkop, selecteer kalibreer tafel, herverwerf het focale vlak stel Z gelijk aan nul onder de X, Y, Z tab. En markeer beeldvormingspunten door punt toevoegen te selecteren onder de tafel. Plaats beeldvormingspunten in het midden van elke wel.Phase contrast beeldvorming kan vervormd zijn nabij de rand van plastic wels. Schik punten in een vierkant in vier bij vier velden met elk ongeveer 5% overlapping. Sla de geselecteerde punten op onder de tafel.Onder de tafel selecteer focus kaart maken en volg de prompt om de focus van elk punt in te stellen. Stel vervolgens de beeldverwervingstijden in zodat het de juiste aantal foto's per uur vastlegt. Sla nu de focus kaart op onder de tafel.Ga verder door op de rechterkant van de werkbalk op beeldverwerving te klikken. Sla vervolgens de beeldvormingsinstellingen op. Druk op de opnameknop om het beeldvormingsproces te starten na een uur, controleer de focus van de beelden om te zien of er enige aanpassing nodig is.Bewaak en continueer de live beeldvorming gedurende vijf dagen wanneer de cellen confluent worden. Het is cruciaal om de verkregen digitale beelden te bewaken en de focus kaart vaak aan te passen gedurende de eerste 24 uur omdat de cellen zich daarna ten minste twee keer per dag aan de plaat zullen hechten. Controleer of de cellen scherp staan en of de culturen niet besmet zijn.Om het mechanisme van initiële kolonievorming te bepalen, begin met een enkele beeldstapel die een beeldvormingssite op de plaat vertegenwoordigt. In de eerste frames zullen de cellen zweven, epitheliale en fibroblastcellen kunnen worden onderscheiden door celmorfologie. Epitheelcellen hebben een kubusvormige vorm en vormen celkolonies.Fibroblasten, een type stromacel, hebben een langwerpige morfologie. Volg de seriële beelden om te bepalen wanneer de eerste epitheliale cel zich aan de plaat hecht. In dit stadium kunnen epitheliale cellen worden geïdentificeerd en gedifferentieerd van fibroblasten door hun meer kubusvormige morfologie.Volg deze enkele epitheliale cel door seriële beelden en volg zijn lot gedurende de daaropvolgende 24 uur. Maak een aantekening als de cel wordt omringd door aanvullende epitheliale cellen, ondergaat celdeling of ondergaat apoptose Als omringd door epitheliale cellen, kan het mechanisme van kolonievorming worden bepaald als van de aggregatie van omringende of van celdeling. Noteer het aantal kolonies gevormd door celaggregatie versus celdeling gedurende de eerste 24 uur om het aantal initieel hechtende cellen dat apoptose ondergaat gedurende een specifieke tijdsperiode te bepalen.Volg de seriële beelden voor

time-lapse-imaging-primary-preneoplastic-mammary-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source: Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1, Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Institute of Biological Sciences, University of Brasília, 2Department of Basic Psychological Processes, Institute of Psychology, University of BrasíliaThis video demonstrates the procedure for tracking tumor progression in vivo by...

Bioluminescent Imaging of Breast Tumor Progression in a Female Mouse Model

We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op...

Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst

Activering van latente mutaties met adenovirus-Cre in de borstklier ductale systeem een ​​klinisch relevante metastatische borstkanker. Opneming van een YFP promotor maakt het volgen van distale metastatische tumorcellen. Dit model is nuttig om latente metastase, anti-tumor immuniteit, en voor het ontwerpen van nieuwe immunotherapieën behandeling van borstkanker bestuderen.

Initiatie van gemetastaseerd borstcarcinoom door Targeting van de Ductaal Epitheel met adenovirus-Cre: A Novel transgeen muismodel van de Breast Cancer

Primaire celcultuur met behulp van intact weefsel organoids biedt een modelsysteem dat de meercellige in vivo micro-omgeving nabootst. We ontwikkelden een serum-vrij primaire borst epitheel weefselkweek model dat gemengde celkweek geslachten en exposities gedifferentieerde morfologie bestendigt, zonder enzymatische weefsel verstoring. Borst organoids blijven nog gedurende&gt; 6 maanden.

Niet-enzymatische, Serum-vrije Tissue Culture van Pre-invasieve borstlaesies voor Spontane Generatie van Mammospheres

Een orthotope borstkanker primaire tumor model en chirurgische verwijdering van de primaire tumor de muis het leven uit te breiden tot spontane metastase genereren beschreven. De tumorgroei en progressie worden gecontroleerd en gekwantificeerd luciferase fluorescentiebeeldvorming.

Een orthotope Muis Model van Spontane uitzaaiing van borstkanker

Het doel van dit protocol is om een nieuwe borstkanker modellerings aanpak te beschrijven op basis van de intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus in muizen borstklieren. Deze aanpak maakt zowel cel-type-en orgaan-specifieke manipulatie van oncogene gebeurtenissen op een tijdelijk gecontroleerde manier mogelijk.

Het modelleren van borstkanker via een Intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus in de muis borstklier

Dit werk presets een geavanceerd protocol om nauwkeurig te beoordelen tumor laden door detectie van groene fluorescerende eiwitten en bioluminescentie signalen, alsmede de integratie van kwantitatieve moleculaire detectie techniek.

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

Dit protocol beschrijft een nieuw mammabeeldvormingsvenster met een vervangbaar deksel (R.MIW). Intravitale microscopie na implantatie van de R.MIW maakt longitudinale en meerdaagse beeldvorming van de gezonde en zieke borstklier mogelijk met een cellulaire resolutie tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia.

Longitudinale intravitale microscopie met behulp van een mammabeeldvormingsvenster met vervangbaar deksel

De hier beschreven intravitale beeldvormingsmethode maakt gebruik van collageen tweede harmonische generatie en endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H om een niet-invasieve tumormicro-omgeving te segmenteren in tumor-, stromale en vasculaire compartimenten voor diepgaande analyse van 4D intravitale beelden.

Een labelvrije segmentatiebenadering voor intravitale beeldvorming van de micro-omgeving van borsttumoren

Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige techniek voor de intravitale beeldvorming van de borstklier van de zogende muis door middel van laserscanning, confocale en multifotonenmicroscopie.

Intravitale subcellulaire microscopie van de borstklier

Het manuscript beschrijft een methodologie voor het opzetten en longitudinaal monitoren van spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumoren, die vatbaar is voor interventie in alle stadia van de metastatische cascade.

In vivo Beeldvorming om spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumorcellen te meten

Leer tijdverloopbeeldvorming van primaire preneoplastische epitheelcellen uit genetisch gemodificeerde muismodellen van borstkanker. Deze methode onthult hoe genetische letsels celgedrag beïnvloeden.

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker (Video) | JoVE Journal

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

Meer video's verkennen