Name: Meten kationtransport van Na, K en H, K-ATPase in Xenopus Eicellen door atomaire absorptiespectrometrie: Een alternatief voor Radio-isotopen Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Leer kationtransport meten in Xenopus-eicellen via atomaire absorptiespectrometrie. Deze veilige methode vervangt radio-isotopenassays en kwantificeert P-type ATPase-activiteit voor iontransportonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken Ernst Bamberg (Max-Planck-Institut voor Biofysica, Frankfurt, Duitsland) voor genereuze ondersteuning tijdens de beginfase van methodeontwikkeling, Kazuhiro Abe (Kyoto University, Japan) voor talloze vruchtbare discussies en Dr. Michael Kohl (Analytik-Service, Woltersdorf, Duitsland) voor technische ondersteuning. De auteurs erkennen met dank de financiering door de Duitse Onderzoeksstichting DFG (Cluster of Excellence "Unifying Concepts in Catalysis"), die ook de Perkin Elmer AAnalyst 800-apparatuur (SFB 498) financierde.

<ol><li>Tavraz, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+plasma+membrane+targeting+or+protein+stability+by+certain+ATP1A2+mutations+identified+in+sporadic+or+familial+hemiplegic+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Impaired plasma membrane targeting or protein stability by certain ATP1A2 mutations identified in sporadic or familial hemiplegic migraine.</a> Channels (Austin). 3, 82-87 (2009).</li>
<li>Castillo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscape+of+the+reactions+governing+the+Na%2B+deeply+occluded+state+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+in+the+giant+axon+of+the+Humboldt+squid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Energy landscape of the reactions governing the Na+ deeply occluded state of the Na+/K+-ATPase in the giant axon of the Humboldt squid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 20556-20561 (2011).</li>
<li>Friedrich, T., Bamberg, E., Nagel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2CK%2B-ATPase+pump+currents+in+giant+excised+patches+activated+by+an+ATP+concentration+jump%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Na+,K+-ATPase pump currents in giant excised patches activated by an ATP concentration jump.</a> Biophys J. 71, 2486-2500 (1996).</li>
<li>Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Dempski, R. E., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+E2+state+stabilization+by+specific+alpha%2Fbeta-subunit+interactions+of+Na%2CK-+and++H%2CK-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional significance of E2 state stabilization by specific alpha/beta-subunit interactions of Na,K- and H,K-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 284, 3842-3854 (2009).</li>
<li>Dürr, K. L., Abe, K., Tavraz, N. N., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2P+state+stabilization+by+the+N-terminal+tail+of+the+H%2CK-ATPase+beta-subunit+is+critical+for+efficient+proton+pumping+under+in+vivo+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">E2P state stabilization by the N-terminal tail of the H,K-ATPase beta-subunit is critical for efficient proton pumping under in vivo conditions.</a> J. Biol. Chem. 284, 20147-20154 (2009).</li>
<li>Durr, K. L., Tavraz, N. N., Zimmermann, D., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Na%2CK-ATPase+and+H%2CK-ATPase+enzymes+with+glycosylation-deficient+beta-subunit+variants+by+voltage-clamp+fluorometry+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Na,K-ATPase and H,K-ATPase enzymes with glycosylation-deficient beta-subunit variants by voltage-clamp fluorometry in Xenopus oocytes.</a> Biochemistry. 47, 4288-4297 (2008).</li>
<li>Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+gastric+H%2CK-ATPase+activity+by+cations%2C+voltage+and+intracellular+pH+analyzed+by+voltage+clamp+fluorometry+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Control of gastric H,K-ATPase activity by cations, voltage and intracellular pH analyzed by voltage clamp fluorometry in Xenopus oocytes.</a> PLoS One. 7, e33645(2012).</li>
<li>Tavraz, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+functional+consequences+of+mutations+in+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+alpha2-subunit+causing+familial+hemiplegic+migraine+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Diverse functional consequences of mutations in the Na+/K+-ATPase alpha2-subunit causing familial hemiplegic migraine type 2.</a> J. Biol. Chem. 283, 31097-31106 (2008).</li>
<li>Lorenz, C., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li>
<li>Koenderink, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2CK-ATPase+mutations+in+familial+hemiplegic+migraine+lead+to+functional+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Na,K-ATPase mutations in familial hemiplegic migraine lead to functional inactivation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1669, 61-68 (2005).</li>
<li>Price, E. M. J., Lingrel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+in+the+Na%2CK-ATPase+alpha+subunit%3A+site-directed+mutagenesis+of+glutamine-111+to+arginine+and+asparagine-122+to+aspartic+acid+generates+a+ouabain-resistant+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships in the Na,K-ATPase alpha subunit: site-directed mutagenesis of glutamine-111 to arginine and asparagine-122 to aspartic acid generates a ouabain-resistant enzyme.</a> Biochemistry. 27, 8400-8408 (1988).</li>
<li>Richards, R., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+conformational+dynamics+of+membrane+proteins+in+situ+with+site-directed+fluorescence+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling.</a> J. Vis. Exp. (2627), e2627(2011).</li>
<li>Lafaire, A. V., Schwarz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+dependence+of+the+rheogenic+Na%2B%2FK%2B+ATPase+in+the+membrane+of+oocytes+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Voltage dependence of the rheogenic Na+/K+ ATPase in the membrane of oocytes of Xenopus laevis.</a> J. Membr. Biol. 91, 43-51 (1986).</li>
<li>Morth, J. P., Pedersen, B. P., Toustrup-Jensen, M. S., Sorensen, T. L., Petersen, J., Andersen, J. P., Vilsen, B., Nissen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+sodium-potassium+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the sodium-potassium pump.</a> Nature. 450, 1043-1049 (2007).</li>
<li>Toustrup-Jensen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C+terminus+of+Na%2B%2CK%2B-ATPase+controls+Na%2B+affinity+on+both+sides+of+the+membrane+through+Arg935%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The C terminus of Na+,K+-ATPase controls Na+ affinity on both sides of the membrane through Arg935.</a> J. Biol. Chem. 284, 18715-18725 (2009).</li>
<li>Morth, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+Na%2B%2CK%2B-ATPase+and+mapping+of+isoform+differences+and+disease-related+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the Na+,K+-ATPase and mapping of isoform differences and disease-related mutations.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 364, 217-227 (2009).</li>
<li>Yaragatupalli, S., Olivera, J. F., Gatto, C., Artigas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Na%2B+transport+after+an+intracellular+alpha-subunit+deletion+reveals+strict+external+sequential+release+of+Na%2B+from+the+Na%2FK+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Altered Na+ transport after an intracellular alpha-subunit deletion reveals strict external sequential release of Na+ from the Na/K pump.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15507-15512 (2009).</li>
<li>Meier, S., Tavraz, N. N., Durr, K. L., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarization-activated+inward+leakage+currents+caused+by+deletion+or+mutation+of+carboxy-terminal+tyrosines+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%7Balpha%7D+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarization-activated inward leakage currents caused by deletion or mutation of carboxy-terminal tyrosines of the Na+/K+-ATPase {alpha} subunit.</a> J. Gen. Physiol. 135, 115-134 (2010).</li>
<li>Vedovato, N., Gadsby, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+C-terminal+tyrosines+stabilize+occluded+Na%2FK+pump+conformations+containing+Na+or+K+ions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The two C-terminal tyrosines stabilize occluded Na/K pump conformations containing Na or K ions.</a> J. Gen. Physiol. 136, 63-82 (2010).</li>
<li>Chakavarti, B., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+separation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic separation of proteins.</a> J. Vis. Exp. (16), e758(2008).</li>
<li>Kamsteeg, E. J., Deen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+aquaporin-2+expression+levels+in+genotype+-phenotype+studies+in+nephrogenic+diabetes+insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Importance of aquaporin-2 expression levels in genotype -phenotype studies in nephrogenic diabetes insipidus.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 279, 778-784 (2000).</li>
<li>Koenderink, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+analysis+of+the+mutated+Na%2CK-ATPase+cation+binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological analysis of the mutated Na,K-ATPase cation binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 278, 51213-51222 (2003).</li>
<li>Gottardi, C. J., Caplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+requirements+for+the+cell-surface+expression+of+multisubunit+ion-transporting+ATPases.+Identification+of+protein+domains+that+participate+in+Na%2CK-ATPase+and+H%2CK-ATPase+subunit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular requirements for the cell-surface expression of multisubunit ion-transporting ATPases. Identification of protein domains that participate in Na,K-ATPase and H,K-ATPase subunit assembly.</a> J. Biol. Chem. 268, 14342-14347 (1993).</li>
<li>Mathews, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+and+functional+expression+of+the+mouse+and+frog+alpha-subunit+of+the+gastric+H%2B-K%2B-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Primary structure and functional expression of the mouse and frog alpha-subunit of the gastric H+-K+-ATPase.</a> Am. J. Physiol. 268, 1207-1214 (1995).</li>
<li>Horisberger, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+H%2CK-ATPase+beta-subunit+can+act+as+a+surrogate+for+the+beta-subunit+of+Na%2CK-pumps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The H,K-ATPase beta-subunit can act as a surrogate for the beta-subunit of Na,K-pumps.</a> J. Biol. Chem. 266, 19131-19134 (1991).</li>
<li>Guennoun-Lehmann, S., Fonseca, J. E., Horisberger, J. D., Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palytoxin+acts+on+Na%2B%2CK%2B-ATPase+but+not+nongastric+H%2B%2CK%2B-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Palytoxin acts on Na+,K+-ATPase but not nongastric H+,K+-ATPase.</a> J. Membr. Biol. 216, 107-116 (2007).</li>
<li>Horisberger, J. D., Guennoun, S., Burnay, M., Geering, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cation+stoichiometry+and+cation+pathway+in+the+Na%2CK-ATPase+and+nongastric+H%2CK-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci.%22%5BJournal%5D)">Cation stoichiometry and cation pathway in the Na,K-ATPase and nongastric H,K-ATPase.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci.. 986, 127-132 (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De beschreven methode om de hoeveelheid Rb+ (of Li+) te meten die in individuele Xenopus eicellen wordt opgenomen die Na+,K+- of H+,K+-ATPase tot expressie brengen, is een veelzijdige, flexibele en nauwkeurige techniek gebleken om de kinetische of thermodynamische parameters van transport voor kation-tegentransporterende P-type ATPasen1,4,5,7,8 te bepalen. Het is een veilige en betrouwbare alternatief voor radioactieve tracer flux assay...

We wilden een gevoelige, veilige en goedkope alternatief ontwikkelen voor radioactieve tracer-experimenten om de specifieke transportactiviteit van ionen-translocerende membraaneiwitten te onderzoeken om beperkingen te omzeilen met betrekking tot de toegang tot isotooplaboratoria, veiligheidsvereisten of het gebruik van kostbare radio-isotopen, die - zoals in het geval van lithium - zelfs niet beschikbaar kunnen zijn vanwege extreem korte vervaltijden. We waren vooral geïnteresseerd in het bepalen van de activiteit van de elektroneutral werkende gastrische H+,K+-ATPase, omdat het enzym geen stroom genereert en de activiteit daarom niet kan worden aangepakt door elektrofysiologische methoden. Aangezien Na+,K+- en H+,K+-ATPase Rb+ even efficiënt transporteert als K+ (en Li+ ook), zou de hoge gevoeligheid van de AAS-techniek voor rubidium of lithium een gevoelige detectie van transportactiviteit moeten vergemakkelijken. Atomaire absorptiespectrometers zijn gebruikelijke analytische apparaten, die wijd verspreid zijn in chemische laboratoria en toegankelijk zouden moeten zijn voor een groot aantal geïnteresseerde wetenschappers. Verder wilden we gebruik maken van het Xenopus oöcyt-expressiesysteem, dat grote enkele cellen gebruikt (ongeveer 1,0-1,5 mm diameter) die het mogelijk maken om een opmerkelijk lage cel-tot-cel-variabiliteit te bereiken met betrekking tot het eiwitexpressieniveau binnen een enkele batch. Een eenvoudige berekening demonstreert de haalbaarheid van de AAS-test: de detectielimiet (karakteristiek massa) voor rubidium met de THGA-AAS-techniek is 10 pg of 1,2·10-13 mol (Rb: 85,47 g/mol), voor lithium 5,5 pg of 7,9·10-13 mol (Li: 6,94 g/mol). Bij heterologe expressie van Na+,K+-ATPase in Xenopus oöcyten kunnen pompstromen van 100 nA worden bereikt (wat gelijk is aan ongeveer 6,2·1011 elementaire ladingen per seconde, of 1,03·10-12 mol s-1), wat resulteert in een transport van 6·10-6 C lading binnen 1 minuut. Aangezien het transport van een netto-lading overeenkomt met de opname van twee Rb+ ionen (vanwege de 3Na+/2K+ stoichiometrie), komt 100 nA stroom gedurende 1 minuut overeen met een opname van 1,2·10-10 mol Rb+. Dus zelfs bij een 1000-voudige verdunning (homogenisatie van een oöcyt met ongeveer 1 μl volume in 1 ml water), bevat een typische THGA-AAS-monster (20 μl) 2,4·10-12 mol Rb+ (of 204 pg), wat ver boven de detectielimiet ligt. Daarom kunnen zelfs transporteurs met meer dan 100-voudig lagere transportactiviteit of plasmamembraanexpressie worden getest met de techniek door de fluxtijd van het experiment geschikt aan te passen.
Aangezien de pompsnelheid gevoelig afhankelijk is van de temperatuur (typische activeringsenergieën voor Na+,K+-ATPase liggen in het bereik van 90 kJ/mol tot 130 kJ/mol1-3, wat resulteert in een ongeveer 30% toename van de omzetsnelheid bij een verandering van 20 °C naar 22 °C), is het verplicht om de fluxmetingen uit te voeren onder nauwkeurige temperatuurcontrole (airconditioning) met goed geëquilibreerde bufferoplossingen. Verder moeten oöcyten zorgvuldig worden geselecteerd met betrekking tot homogene grootte voor de expressie van een ionetransporteur. Met deze voorzorgsmaatregelen is het mogelijk om routinematig experimentele standaardfouten van minder dan 10 procent te bereiken met ongeveer 10 cellen per experimentele conditie. Met behulp van deze techniek waren we in staat om bijv. de schijnbare Rb+ affiniteiten van kationentransport4-6, de invloed van extra- en intracellulair pH7 en het effect van mutaties van residuen betrokken bij kationcoördinatie tijdens transport4,8 te bepalen. Een voordeel van de techniek is dat ionefluxen ook kunnen worden bepaald in combinatie met twee-elektrode spanningsklem van de oöcyten, wat aan de ene kant nauwkeurige controle van het membraanpotentiaal tijdens transport verzekert en aan de andere kant het mogelijk maakt om ioneflux te correleren met membraanstroom. Zo was het mogelijk om de 3Na+/2K+ stoichiometrie van de Na+,K+-ATPase (zie voorbeeldresultaten hieronder) te verifiëren en de spanningsafhankelijkheid van kationentransport van de gastrische H+/K+-ATPase7 te bepalen.

<table><tbody><tr><td>4.0 Ethicon Vicryl hechtmateriaal</td><td>Johnson Johnson</td><td>V633H</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type 1A van Clostridium hystolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>High-Pure PCR Product Purification Kit</td><td>Roche Applied Science</td><td>11732676001</td><td> </td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine Kit SP6/T7</td><td>Ambion</td><td>1340, 1344</td><td></td></tr><tr><td>Ouabain octahydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3125</td><td></td></tr><tr><td>Tricain (ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-remmer type III-O uit kippeneiwitje</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2011</td><td></td></tr><tr><td>SCH28080</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4443</td><td></td></tr><tr><td>AAnalyst 800</td><td>Perkin Elmer</td><td>0993-5256</td><td></td></tr><tr><td>WinLab32TM</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPhotometer</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000.012</td><td></td></tr><tr><td>Boorsilicaat capillairen</td><td>Science Products</td><td>GB150F-8P</td><td></td></tr><tr><td>Hematocrietbuizen 3.5"</td><td>Drummond Scientific</td><td>3 000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Hollow Cathode Lamp Lithium</td><td>Photron</td><td>P929LL</td><td></td></tr><tr><td>Hollow Cathode Lamp Rubidium</td><td>Photron</td><td>P945</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet Puller </td><td>Narishige</td><td>Model PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Oocyte Recording Chamber RC-10</td><td>Warner Instr.</td><td>W4 64-0306</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II injectiepomp</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen monsterbeker (1,2 ml)</td><td>Perkin Elmer</td><td>B0510397</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac - Concentrator model 5301</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.210</td><td> </td></tr><tr><td>THGA-buis</td><td>Perkin Elmer</td><td>B3000641</td><td></td></tr><tr><td>Turbo TEC-10CX Versterker</td><td>NPI Electronics</td><td>TEC-10CX</td><td></td></tr></tbody></table>

meten kationtransport van na, k en h, k-atpase in<em&gt; xenopus</em&gt; eicellen door atomaire absorptiespectrometrie: een alternatief voor radio-isotopen assays

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Terwijl kationtransport door de elektrogene membraantransporter Na+,K+-ATPase gemeten kan worden door middel van elektrofysiologie, is de elektroneutraal opererende gastrische H+,K+-ATPase moeilijker te onderzoeken. Veel transportassays gebruiken radio-isotopen om een voldoende signaal-ruisverhouding te bereiken, maar de noodzakelijke veiligheidsmaatregelen leggen strenge beperkingen op met betrekking tot blootstelling voor mensen of opzet van de assay. Bovendien wordt iontransport over celmembranen kritiek beïnvloed door het membraanpotentiaal, wat niet direct gecontroleerd kan worden in celcultuur of in proteoliposomenpreparaten. Hier maken we gebruik van de uitstekende gevoeligheid van atomaire absorptiespectrometrie (AAS) voor sporenhoeveelheden van chemische elementen om Rb+ of Li+ transport door Na+,K+- of gastrische H+,K+-ATPase in enkele cellen te meten. Met behulp van Xenopus eicellen als expressiesysteem, bepalen we de hoeveelheid Rb+ (Li+) die in de cellen wordt getransporteerd door monsters van enkele-eicel homogenaten te meten in een AAS-apparaat uitgerust met een dwars verwarmde grafietatomisator (THGA) oven, die wordt geladen vanuit een autosampler. Aangezien de achtergrond van onspecifieke Rb+ opname in controle eicellen of tijdens toediening van ATPase-specifieke inhibitoren zeer klein is, is het mogelijk om complexe kinetische assayschema's te implementeren die een groot aantal experimentele omstandigheden tegelijkertijd omvatten, of om de transportcapaciteit en kinetiek van locatie-specifiek gemuteerde transporters met hoge precisie te vergelijken. Bovendien, aangezien kationopname op enkele cellen wordt bepaald, kunnen de fluxexperimenten worden uitgevoerd in combinatie met twee-elektrode voltage-clamping (TEVC) om nauwkeurige controle van het membraanpotentiaal en de stroom te bereiken. Dit maakte het bijv. mogelijk om de 3Na+/2K+ transport stoichiometrie van de Na+,K+-ATPase kwantitatief te bepalen en voor de eerste keer om de spanningsafhankelijkheid van kationtransport door de elektroneutraal opererende gastrische H+,K+-ATPase te onderzoeken. In principe is de assay niet beperkt tot K+-transporterende membraaneiwitten, maar het kan evengoed werken om de activiteit van zware of overgangsmetaaltransporters aan te pakken, of opname van chemische elementen door endocytotische processen.

Kwantificering van Rb+ opname door K++- (of Rb+)-tegengetransporteerde P-type ATPases door AAS in de Xenopus een oöcyt-expressiesysteem maakt een betrouwbare bepaling van enzymkinetische parameters mogelijk.
Bepaling van de transportstoichiometrie van de Na+/K+-ATPase
Voor de electrogene Na+/K+-ATPase kunnen Rb+-fluxen worden bepaald in twee-elektrode voltage-clamp experime...

We beschrijven een methode om de activiteit van K+-countertransporterende P-type ATPasen te kwantificeren door heterologe expressie van de enzymen in Xenopus oöcyten en het meten van Rb+ of Li+ opname in individuele cellen door middel van atomaire absorptie spectrofotometrie. De methode is een gevoelige en veilige alternatief voor radio-isotoop flux experimenten waardoor complexe kinetische studies worden vergemakkelijkt.

Meten kationtransport van Na, K en H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicellen door atomaire absorptiespectrometrie: Een alternatief voor Radio-isotopen Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

De procedure maakt gebruik van kikkeroöcyten als in vivo expressiesysteem. Om de transportactiviteit van kalium-tegentransporterende P-type A, TP, ais of andere spoorelement-membraantransporters te kwantificeren, moet het transporteiwit eerst worden geëxprimeerd in Xenopus laevis oöcyten. Wek vervolgens kationopname op door de cellen te incuberen in een fluxoplossing die een bepaalde concentratie van het getransporteerde kation bevat, gedurende een vaste tijd en temperatuur.Voer het opname-experiment alternatief uit onder controle van het membraanpotentiaal met behulp van de twee-elektroden voltage-clamp techniek. Homogeniseer na het wassen van de cellen individuele oocyten in één milliliter Millipore-water. Meet vervolgens de monsters op een atomaabsoptiespectrofotometer die is uitgerust met een transversaal verwarmde grafietoven.Uiteindelijk kan tracerfluxanalyse via atomaire absorptiespectrometrie worden gebruikt om transport- of inhibitorkinetiek, de spanningsafhankelijkheid van transport en transportstoichiometrie te bepalen, en kan het uiteindelijk worden ingezet voor farmacologische screening. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een nauwkeurig, goedkoop e

measuring-cation-transport-nak-hk-atpase-xenopus-oocytes-atomic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In planta meting van nutriënten en toxische stroom is essentieel voor de studie van plantenvoeding en toxiciteit. Hier bespreken we protocollen met radiotracers voor de bepaling van influx en efflux in intacte plantenwortels, met behulp van kalium (K+) en ammoniak/ammonium (NH3/NH4+) stromen als voorbeelden. De voordelen en beperkingen van dergelijke technieken worden besproken.

Het meten van stromen van minerale nutriënten en toxische stoffen in planten met radioactieve tracers

Het eerste deel van dit artikel laat zien hoe mutante cellijnen te selecteren zijn die vesiculaire Na+/H+ uitwisselaars in hun plasmamembraan tot expressie brengen. Het tweede deel biedt protocollen gebaseerd op intracellulaire pH-metingen en snelle ionopname, die worden gebruikt om de ionselectiviteit en de kinetische parameters van deze uitwisselaars te bepalen.

Functionele karakterisatie van Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Warmtewisselaars van intracellulaire compartimenten met Proton-doden Selectie om ze te uiten op het plasmamembraan

Transporters in celmembranen maken differentiële segregatie van ionen over celmembranen of cellagen mogelijk en spelen een cruciale rol tijdens weefselfysiologie, herstel en pathologie. We beschrijven de ion-selectieve zelfrefererende micro-elektrode die de meting van specifieke ionfluxen bij enkele cellen en weefsels in vivo mogelijk maakt.

Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek

Dit protocol beschrijft het gebruik van de Ramsay assay vloeistofsecretie tarieven van geïsoleerde Malpighian (renale) tubuli van Drosophila melanogaster gemeten. Bovendien, het gebruik van een ionen-specifieke elektrode natrium en kalium concentraties te meten in de afgescheiden vloeistof, zodat berekening van transepitheliale ionenflux, wordt beschreven.

Gebruik van de Ramsay Assay Fluid Afscheiding en Ion Flux tarieven in de Meet<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Malpighian buisje

Dit artikel beschrijft een versterking van conventionele Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) waar Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) worden gebruikt in plaats van maleimide kleurstoffen, om structurele herrangschikkingen in ionenkanalen te onderzoeken. De procedure omvat Xenopus oocyt DNA injectie, RNA / fUAA coinjection, en gelijktijdige stroom en fluorescentie metingen.

Spanningsklem Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyten Met Fluorescerende Onnatuurlijke Aminozuren

Dit manuscript beschrijft de toepassingen van proton-Ionselectieve electroden en patch klemmen van methoden voor het meten van de activiteit van proton vervoerssystemen. Deze methoden zijn sommige beperkingen van technieken gebruikt bij het bestuderen van proton vervoersactiviteit, zoals matige gevoeligheid, resolutie van de tijd en onvoldoende intracellulaire milieu controle.

Toepassing van electrofysiologie meting op het bestuderen van de activiteit van Electro-neutrale Transporters

Hier presenteren we protocollen om te ontdekken van verbindingen actief bij GABAA -receptoren, van de binding aan de Fysiologie en farmacologie.

Methoden voor de ontdekking van nieuwe verbindingen moduleren van een Receptor Gamma - aminoboterzuur Typ een transmissie

A Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is aangepast aan de semihoge doorvoer screening van kleine molecuul myosine-remmers. Deze kinetische test wordt uitgevoerd in een 384-well microplaat Format met een totaal reactievolume van slechts 20 μL per put. Het platform moet van toepassing zijn op vrijwel elk ADP-producerende enzym.

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

Het huidige protocol benadrukt de toepassing van western blotting-techniek om de functies en activiteiten van neuronale K-Cl co-transporter KCC2 te bestuderen. Het protocol beschrijft het onderzoek naar KCC2-fosforylering op kinaseregelplaatsen Thr906/1007 via western blotting. Ook aanvullende methoden om KCC2-activiteit te bevestigen worden kort gemarkeerd in deze tekst.

Studie van de functies en activiteiten van Neuronale K-Cl Co-Transporter KCC2 met behulp van Western Blotting

Leer kationtransport meten in Xenopus-eicellen via atomaire absorptiespectrometrie. Deze veilige methode vervangt radio-isotopenassays en kwantificeert P-type ATPase-activiteit voor iontransportonderzoek.

Meten kationtransport van Na, K en H, K-ATPase in Xenopus Eicellen door atomaire absorptiespectrometrie: Een alternatief voor Radio-isotopen Assays (Video) | JoVE Journal

Meten kationtransport van Na, K en H, K-ATPase in

Meer video's verkennen