Giant liposoombereiding for Imaging en patch-clamp elektrofysiologie

Het algemene doel van deze procedure is om reuzen uni-lamellaire blaasjes te bereiden op een manier die compatibel is met de functionele integriteit van membraaneiwitten die in de blaasjesmembraan zijn opgenomen. Dit wordt bereikt door eerst lipiden of kleine liposomen af te zetten op een geleidend oppervlak zoals een ITO-gecoate glazen plaat. De tweede stap is om het oplosmiddel op gecontroleerde wijze te laten verdampen om een uniforme lipidefilm op het geleidende oppervlak te verkrijgen.

Vervolgens rehydrateer je de lipidefilm voorzichtig in een geschikte buffer en bereid je de elektroformatiekamer voor. De laatste stap is om een oscillerende spanning over de lipidefilm aan te brengen om reuzen unal Miller blaasjes te genereren. Uiteindelijk zullen de blaasjes worden afgebeeld om hun grootte en kwaliteit te bepalen en te vergelijken met blaasjes die zijn gevormd met behulp van een klassieke techniek.

Visuele demonstratie van dit protocol is nuttig omdat lipide-afzetting moeilijk te beheersen kan zijn, afhankelijk is van veel variabelen en het beste wordt bepaald door visuele inspectie. Verwijder voordat u met deze procedure begint, de lipiden uit de opslag bij min 20 graden Celsius of min 80 graden Celsius en warm ze op tot kamertemperatuur. Voer het experiment indien mogelijk uit in een inerte gasatmosfeer, zoals een handschoenenkast.

Bedek de lipiden vervolgens met droog argon of stikstofgas en minimaliseer in alle stappen de blootstelling aan lucht. Als de lipiden niet worden geleverd in een organisch oplosmiddel, suspendeer dan 0,3 milligram lipiden in chloroform of cyclo heaan bij 10 milligram per milliliter. Merk op dat door de fabrikant opgegeven concentraties meestal alleen nominaal zijn.

Gebruik ethanol om beide kanten van 2 25 millimeter bij 37,5 millimeter ITO-gecoate glazen platen schoon te maken. Voeg vervolgens 0,1 procent Texas Red DPPE toe aan de lipiden voor fluorescente beeldvorming. Meet de oppervlakteweerstand met een multimeter om te verifiëren dat de ITO-gecoate kant van de glazen platen omhoog wijst, wat wordt aangegeven door een weerstand van enkele honderden ohm.

Aspibeer de lipiden in een oplosmiddelbestendige spuit met de spuitnaald die de ITO-oppervlak niet raakt. Breng de lipide langzaam aan door de naald heen en weer te bewegen over de plaat. Bedek het oppervlak gelijkmatig en let op een regenboogglans op het glazen oppervlak.

Plaats de platen vervolgens snel in een vacuümdroger en pomp de kamer naar minder dan één tor vacuüm gedurende 0,5 tot één uur. Om eventuele restoplosmiddel te verwijderen. Laat het vacuüm vrij met inerte gas.

Breng een dunne laag siliconenvet aan op beide kanten van een siliconenpakking en plaats de pakking vervolgens op de plaat. Laat minimaal vijf millimeter van de onbedekte plaat blootliggen aan het ene uiteinde van de plaat. Hydrateer vervolgens elk putje zorgvuldig door een 27-gauge spuitnaald aan de rand van de pakking te plaatsen en langzaam buffer aan te brengen overvul elk pakkingputje met ongeveer 10% met drie millimolair bergen.

Zodra de lipiden zijn gehydrateerd, werk je snel door naar de resterende stappen. Aangezien lipidefilms beginnen te delamineren, verifieer je onmiddellijk de geleidende kant van de plaat met de multimeter. Breng vervolgens de tweede ITO-plaat geleidende kant naar de bovenkant van de pakking.

Zorg ervoor dat er minimaal vijf millimeter overhang buiten het pakkinggebied is en tegenover de eerste overhang, en druk zachtjes om een goede afdichting te garanderen. Reinig de twee overhangen met ethanol. Bevestig nu de ITO-plaatsandwich aan elektrische contacten zoals koperen staven of pakkingschuim.

Deze afbeelding toont een ontplofende weergave van de kamer en contactassemblage als referentie. Gedetailleerde plannen zijn te vinden in het tekstprotocol met behulp van een multimeter. Controleer of er geen elektrische short is tussen de contacten en of de contacten goed zijn verbonden met de ITO-oppervlakken.

Plaats vervolgens de elektroformatiekamer in een oven en verwarm de kamer 10 graden Celsius boven de hoogste smelttemperatuur van een van de aanwezige lipiden. Meet de afstand tussen de twee ITO-gecoate oppervlakken om de amplitude van de sinusgolf te bepalen. De amplitude van de sinusgolf moet ongeveer 0,7 volt RMS zijn. Voor elke millimeter afstand tussen de ITO-oppervlakken, breng je een 10 hertz sinusgolf aan gedurende 60 tot 90 minuten.

Verbind de generator met de elektroformatiekamer en bevestig de spanning met een multimeter. Na 60 tot 90 minuten elektroformatie zouden reuzen unal blaasjes zich moeten hebben gevormd. Gebruik een omgekeerde microscoop uitgerust met een filter kubus voor Texas Red kleurstof om de liposomen af te beelden.

De liposomen moeten bolvormig zijn, overwegend Ella zijn door het oog en vrij van defecten zoals snaren die aan de liposomen hangen. De voorgaande stappen behandelden de klassieke bereiding van reuzen liposomen uit zuivere lipiden. Een meer uitdagende bereiding met kleine liposomen wordt getoond.

Bereid als eerste een verzadigde kaliumcarbonaat-oplossing van 44% relatieve vochtigheid bij 20 graden Celsius. Gebruik een plastic yoghurt- en granola-container met een bovenste cup die is gemodificeerd met gaten in de bovenste cup. Plaats de verzadigde zout-oplossing en overtollig zout in een goed afsluitbare container met een binnenste plank.

Vervang de plank na het vullen en zorg ervoor dat de vloeistof vijf tot tien millimeter onder de plank staat. Plaats een vochtigheidssensor in een inkeping in de zijkant van de container. Reinig beide kanten van ITO-gecoate glazen platen met ethanol.

Gebruik de multimeter om te bepalen welke kant geleidend is en label de niet-geleidende kant met de naam van het monster. Smeer vervolgens beide kanten van een een of meervoudige houder siliconenpakking licht in. Plaats de geleidende kant van de plaat naar boven op de werkbank en breng de siliconenpakkingen aan op elke plaat waarop lipiden zullen worden aangebracht.

Zorg ervoor dat er minimaal vijf millimeter van de blootgestelde plaat aan één kant is om verbinding te maken met het elektroformatieapparaat. Ma