Lichte voorkeur Assay om Aangeboren en Circadiaanse Gereglementeerde Photobehavior studeren in

Het algemene doel van het volgende experiment is om het aangeboren en circadiane fotogedrag van drosophila-larven te testen aan de hand van een licht-donker voorkeurstest. Dit wordt bereikt door de experimentele larven eerst op te kweken onder gedefinieerde licht-donker condities om een initiële circadiane klok in de larven te vestigen. Vervolgens worden de larven overgezet naar constante duisternis, waardoor de circadiane klok van de larven vrij kan lopen.

Zodra het L3-voedingsstadium is bereikt, worden de larven verdeeld in groepen om hun lichtvoorkeur op verschillende circadiane tijdstippen te testen. De resultaten tonen een aangeboren en circadiane lichtvoorkeur aan, gebaseerd op de berekening van een voorkeursindex en een vergelijking tussen de tijdstippen en experimentele groepen. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de aangeboren en circadiane regulatie van lichtwaarneming en de verwerking van fotogedrag, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals olfactie, chemotaxis en thermotaxis.

Hetzelfde geldt voor aanpassingen voor leer- en geheugentests. De procedure zal worden gedemonstreerd door Alina en BMA aan de promovendi uit mijn laboratorium. Om eitjes te verzamelen, laat u gepaarde volwassen vliegen 12 uur lang leggen op verse voedingsbodems en brengt u ze vervolgens over naar nieuwe vials. Blijf de volwassen vliegen elke 12 uur overzetten volgens een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker.

Bewaar de eicollecties van 12 uur in de incubator. Kweek de dieren voor het experiment op tot het vroege L3-larvumstadium. Deze zijn voedingsklaar 84 tot 108 uur na de eifase.

Het correct instellen van de stadia van LAE is cruciaal voor het succes van het experiment. Vanaf het late derde stadium veranderde LAE het fotogedrag om de circadiane componenten van het visuele gedrag te testen. Plaats de verzamelde larven 48 uur voor de test en vlak voor de subjectieve dageraad van de larven in een kartonnen doos.

Plaats de doos vervolgens gedurende 48 uur in een incubator met constante duisternis; tot het experiment aanvangt, moeten deze larven ongestoord in hun toegewezen ruimte blijven. Bereid het deksel van een Petri-schaal van 9 cm voor met behulp van een vierkant van 20 cm dat is onderverdeeld in vier kwadranten als leidraad.

Lijm vierkanten aluminiumfolie van 10 centimeter op tegenovergestelde kwadranten en bedek deze met zwarte tape. Zorg ervoor dat de rand van het deksel wordt bedekt. Lijm vervolgens een vierkant van 20 centimeter, verdeeld in vier kwadranten, onder de lichtbron op de tafel.

Markeer de omtrek van een testschaaltje op het vel om als gids te dienen voor een consistente verplaatsing. Plaats een LED-lamp boven de Petri-schaal met behulp van een statief. Stel de hoogte zo in dat de gehele testplaat homogeen wordt verlicht.

Stel de lichtintensiteit op een testlocatie in op tussen de 350 en 760 luxe, door ofwel de hoogte van de lamp verder aan te passen of door een regelbare voeding te gebruiken. De experimentele ruimte moet worden verlicht met rood licht en moet dezelfde temperatuur hebben als de ruimte waar de dieren zijn opgekweekt. De vials werden twee dagen opgekweekt onder constante duisternis.

Verzamel de lava uit hun voeding met een spatel van de bovenste vijf millimeter van de voeding. Verdeel de voeding over de buitenkant van een Petrischaaldeksel. Voeg wat water toe aan de voeding en meng dit voorzichtig met de spatel.

Voeg met een penseel een druppel kraanwater toe aan een nieuw schaaltje. Breng de larven over naar de waterdruppel om ze te wassen. Verzamel de larven vervolgens met het natte penseel.

Selecteer uitsluitend de L3-larven in de vroege voedingsfase en vermijd L3-larven in de late dwalingsfase. Breng de geselecteerde larven over naar het midden van een testplaat. Voedende L3-larven hebben anterieure sferulen die openstaan en naar buiten uitsteken.

In een vingerachtige vorm. De posterieure sferen hebben elk drie openingen en vier groepen grote vertakte haren. De speekselklieren strekken zich uit tot het tweede abdominale segment.

Zodra 30 larven in het midden van de testplaat zijn geplaatst, wordt deze afgedekt met het geprepareerde deksel. Zet de LED-lamp aan. Start een timer en laat de larven vijf minuten lang vrij bewegen op de plaat.

Verwijder vervolgens snel het deksel en tel het aantal larven in de donkere en de lichte kwadranten. Het markeren van de positie van elke larve kan het tellen vergemakkelijken. Een snelle foto kan ook helpen; larven die een onduidelijke lichtvoorkeur vertonen, zoals larven die over de wanden kruipen of zich in de agar ingraven, moeten worden geteld als neutrale voorkeur en worden toegevoegd aan het totale aantal larven bij de berekening van de lichtvoorkeursindex.

Gooi na het tellen van de larven de plaat weg en gebruik een nieuwe testplaat voor het volgende experiment. Voer na 10 tot 15 trials per genotype de analyse uit volgens het protocol. De licht-donker voorkeur van Canton ES larven werd vergeleken op twee verschillende circadiane tijdstippen.

CT 0 en CT 12, subjectief gezien larven bij dageraad en schemering, werden gedurende 48 uur onder standaardomstandigheden gehouden en vervolgens drie dagen overgezet naar constante duisternis. Licht-donker testen bij 350 luxe onthulden dat de lichtgevoeligheid hoger was bij larven die op CT 0 werden getest in vergelijking met larven die op CT 12 werden getest. Met gebruik van deze formule was de voorkeur voor duisternis van CT 0 larven 0,52 vergeleken met 0,36.

De vergelijking van de indexen voor de CT 12-larven met behulp van een Wilcoxon-test levert een significante P-waarde van 0,023 op. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de lichtvoorkeur van trofoforenlarven bij verschillende circuits en tijdspunten voor dit doel kunt testen. U moet in staat zijn om stadium F3-ophidenlarven te entrainen, hun fotofobe gedrag te testen en de lichtvoorkeursindex te berekenen voor statistische vergelijking.