Name: Lichte voorkeur Assay om Aangeboren en Circadiaanse Gereglementeerde Photobehavior studeren in Drosophila Larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Leer een licht-donker preferentietest voor Drosophila larven om aangeboren en circadiane fotogedrag te bestuderen. Deze methode meet lichtvoorkeur via een preferentie-index en is toepasbaar op andere sensorische modaliteiten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken onze collega&#39;s van het Departement Biologie, Universiteit van Fribourg voor vruchtbare discussies. Wij danken de Bloomington Stock Centrum voor het verstrekken vlieg voorraden. Dit werk werd financieel ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (PP00P3_123339) en de Velux Stichting SGS

1. Larvale Opfok <ol><li> Houd vliegen stammen of genetische kruisen in de massacultuur bij 25 ° C op maïsmeel medium onder een 12-uur licht-12-uur donker cyclus in een vlieg incubator uitgerust met licht en timer. </li><li> Verdun Backer gist in water om een vloeibare pasta (10 g gist Backer verdund met 3-4 ml gedestilleerd H2 O) vormen. Voeg een kleine druppel op de maïsmeel voedsel en dekking van de flesjes. Laten drogen gedurende ten minste een uur om volwassen vliegen voorkomen vasthouden aan de gistpasta. Om een ​​kleine druppel gist verdund in water op het oppervlak van het voedsel kan ovipositie verbeteren. Alternatief bakkersgist pasta, 20% azijnzuur (AcOH) (Sigma Aldrich, Zwitserland A6283-100ML) worden gebruikt. Hiervoor dip de punt van een Q-tip aan de oplossing en verspreiding op het maïsmeel voedseloppervlak. </li><li> Zet volwassen vliegen (minstens vier dagen oud, maar niet ouder dan tien dagen) in maïsmeel voedsel flacons. Doe voldoende volwassenen in elk flesje om voldoende larven te verkrijgen om de voorkeur te herhalentesten een paar keer en laat statistische vergelijking. Voor genetische kruisingen, we gebruiken meestal minimaal 20 vrouwen en 5-10 mannen per flesje, maar sommige lijnen vereisen meer vrouwen voldoende larvale nakomelingen te verkrijgen. </li><li> Bieden volwassenen om eieren te leggen voor 12 uur en overzetten naar nieuwe flesjes. Volwassenen kunnen in de ochtend en de avond worden overgedragen. Wij volwassenen dragen meestal zeven tot tien dagen en indien nodig neemt nieuwe volwassenen. </li><li> Houd het ei verzameling taken elke 12 uur in de incubator en laat groeien de larven bij 25 ° C, 12 uur licht-12-uur donker cyclus en 60% vochtigheid. Om te testen op circadiane onderdelen van het visuele gedrag verhuizing larven tot constante duisternis (DD) 48 uur na het verzamelen van de eieren (overeenkomend met twee-licht-donker cycli). Gebruik hiervoor een aparte incubator zonder licht, maar blijven alle andere omstandigheden, zoals temperatuur en vochtigheid identiek. Zorg ervoor dat de flesjes over te dragen aan de DD incubator net voor de overgang naar de donkere fase. Voordat we de flesjes nog met een andereER incubator gezet flacons in een kartonnen doos of wikkel de flesjes met aluminiumfolie om blootstelling aan licht tijdens de overdracht (verpakken in kartonnen doos of verpakking moet worden gedaan tijdens de &#39;lights-on fase &quot;voorafgaand aan de verschuiving tussen incubators) te voorkomen. Voorkomen dat de dieren uit elke blootstelling aan het licht na dit tijdstip tot experimenten starten. </li><li> Na 4 dagen (84-108 uur vanaf de eileg) verzamelen vroege L3 (voeden larven) op de tijdstippen worden getest (zie 4. Lichte voorkeur test, punt. 4.4.). </li></ol> 2. Test Setup <ol><li> Uitvoeren van experimenten in een donkere ruimte met een constante temperatuur en vochtigheidsgraad. </li><li> Om twee kwadranten van de petrischaal in de duisternis te houden, hebben betrekking op de deksel met zwarte tape en aluminiumfolie. Om dit te doen, markeer het midden van het deksel omtrek. Ook markeren vier punten op de grens van het deksel met 90 ° van de scheiding tussen hen. Om het makkelijker te maken, trek je een 20 cm vierkant verdeeld in vier kwadranten van 10 cm lengte op eenvel papier of met behulp van een computer. Knip 10 cm vierkantjes van aluminiumfolie en zwarte tape (Figuur 1A). Hebben betrekking op twee tegenovergestelde kwadranten door lijmen een vierkant van aluminiumfolie, als eerste laag en zwarte tape op het, wees voorzichtig te breiden tot de grens van het deksel. In het verleden werden twee enigszins verschillende vormen van deze assays gebruikt. We gebruiken hier de &#39;kwart-plate &quot;-test, waarbij de petrischaal is verdeeld in vier gelijke kwartalen 10. In de alternatieve &quot;half-plate&quot; test de petrischaal is verdeeld helft (halve blootgesteld aan licht, half in het donker) 1,7,8. Tot op heden geen significante verschillen tussen de twee assays is gepubliceerd. </li><li> Lijm een ​​kwadrant vel zoals degene die gebruikt wordt voor het markeren van de deksels recht onder de lichtbron op tafel. Markeer de omtrek van een petrischaal gecentreerd op de kwadranten kruispunt. Gebruik de markeringen als referentie om de test plaat altijd plaats op dezelfde positie onder de lichtbron. </li><li> Installeer eenlamp, hetzij een eenvoudige witte gloeilamp (Phillips, Softtone 5W) of een LED-lamp (LED-lamp, 80012 Wit, Osram) boven de petrischaal met behulp van een ijzeren statief (Fisher Scientific, S47808). De hoogte zodanig dat de gehele testplaat homogeen wordt verlicht. We raden het gebruik van LED-lampen, omdat ze meer specifieke golflengten uitzenden dan conventionele gloeilampen. Bovendien LED&#39;s stoten minder warmte. </li><li> Pas lichtintensiteit met behulp van een fotometer (Milieu Meter PCE EM882). Om de gewenste lichtintensiteit van 350-760 lux te bereiken, beweegt de lamp omhoog of omlaag als nodig. Het aansluiten van de lamp op een regelbare voeding geeft meer flexibiliteit om intensiteiten veranderen zonder het verplaatsen van de lamp (Figuur 1B). </li></ol> 3. Platen Voorbereiding <ol><li> Maak 200 ml van 2,5% agar (Sigma-Aldrich, Zwitserland A5093-500G) met dubbel gedestilleerd water (Millipore). </li><li> Plaats petrischalen op een tafel (diameter van 90 mm;Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Oostenrijk) in rijen te laten gieten hete agarose. </li><li> Kook de agarose in een magnetron totdat de oplossing volledig transparant en vloeistof. Zorg ervoor dat vloeibare oplossing niet bubbels bevatten. LET OP: Transport zorgvuldig aan de tafel sinds de oplossing kan erg heet zijn! </li><li> Giet hete agarose in de petrischalen totdat het hele oppervlak homogeen bedekt is met een dunne laag van de oplossing, ongeveer twee tot drie millimeter voldoende. Wees er snel bij om agarose stollen voordat coating alle platen te voorkomen. Laat de platen afkoelen. WINKEL platen bij kamertemperatuur en gebruik ze alleen op dezelfde dag van bereiding. </li></ol> 4. Lichte voorkeur Test <ol><li> Werken onder rood licht in het experiment ruimte aan het licht invloed te voorkomen voordat de test aangezien Drosophila is niet in staat om rode golflengten van het licht waarnemen. Gebruik een rood lampje (Phillips, PFE712E * 8) gemonteerd in een lamp te verlichten tHij plaatst om te werken. </li><li> Handhaaf de temperatuur in alle experimenten bij 25 ° C. Controle kamertemperatuur met behulp van een verwarmer of koelinrichting indien nodig. </li><li> Neem wat eten van de flacons opgefokt voor twee-daagse cycli onder constante duisternis (vanaf hoofdstuk 1). Aangezien larven graven op het oppervlak van het voedsel, neemt de bovenste laag (ongeveer 5 mm diep) met een spatel (Fisher Scientific, 14-373-25A). Verdeel de levensmiddelen aan de buitenzijde van een petrischaal deksel, voeg wat water toe en meng voorzichtig met de spatel. </li><li> Verzamel voeden L3 larven uit het voedsel. Zo licht de voorkeur zal worden getest, het kiezen alleen vroeg / voeden L3 larven is cruciaal omdat de negatieve phototaxis is verzekerd. Late / zwervende L3 larven of grote larve kruipen op het voedsel vermoedelijk al hun photobehavior ingeschakeld. Feeding L3 larven (negatieve phototactic) kan worden herkend omdat hun voorste spiracles zijn open en staken naar buiten in een vinger-achtige vorm. De achterste spiracles hebben drie openingen elk, en vier groepen van grote vertakte haartjes. De speekselklieren te breiden tot de tweede abdominale segment 11. Staging larve onder een microscoop is handig terwijl er geen wit licht worden gebruikt. Een rood licht, lamp is nodig om de larven te verlichten als enscenering onder stereoscopische microscoop voordat experimenten nodig. </li><li> Kort wassen larven in leidingwater en het verzamelen van vroeg-voederen derde instar larven (nog steeds in rood licht). Voor de overdracht van de larven naar de testplaat, neem de larven met een natte penseel en overtollig water zorgvuldig te absorberen met een papieren handdoek of een papieren filter. Niet droog larven te overdreven, omdat het de dieren zou kunnen schaden en beïnvloeden het gedrag. </li><li> Met behulp van de natte kwast voorzichtig overdracht van de larven te platen. Plaats een groep van ongeveer 30 larven in het midden van de plaat. Bedek de plaat met het deksel al voorbereid met de kwadranten en zet de plaat onder de lichtbron klaar voor experiment (zie sectie 2). </li><li> Schakel het witte licht lamp en start de timer. Laat de larve vrij bewegen op de plaat gedurende 5 minuten, dan is snel te verwijderen van de deksel en tel het aantal larven in het donker en in het licht kwadranten. Markeren van de positie van elke larve met een marker kan het tellen te vergemakkelijken. Als alternatief een foto van het bord nemen en tel a posteriori. Larven met een onduidelijke lichte voorkeur, zoals larven kruipen op de muren of gravende in agar moet worden beschouwd als neutraal voorkeur en gewoon worden opgenomen in het totale aantal larven wanneer het licht preferentie index wordt berekend. </li><li> Na het tellen, gooi de plaat met larven en vervangen door een nieuwe test bord voor het volgende experiment. Verzamel gebruikte platen in een autoclaaf plastic zak voor latere verwerking en verwijdering. </li><li> Zodra u een voldoende aantal experimenten een nieuwe genotype kan worden getest hebben uitgevoerd. 10-15 trials per genotype zijn voldoende voor de analyse. </li></ol> 5. Gegevens Analysis <ol><li> Voor het gemak van de overdracht van gegevens naar een datasheet als Excel (Microsoft) of Origin (Oorsprong Lab) op een computer voor verdere statistische analyse. Regelen in een kolom het aantal dieren in het donker, in een tweede kolom het aantal dieren in het licht kwadranten in het derde het totaal van dieren in de plaat (met inbegrip van &quot;neutraal&quot; larven). </li><li> Bereken de voorkeur index (PREF) voor de duisternis voor elk experiment met behulp van de volgende formule: PREF (duisternis) = (aantal larven in het donker - aantal larven in het licht) / totaal aantal larven </li><li> Vergelijk statistisch gezien een reeks gegevens met een passende analyse voor groepen. Hier gebruiken we een Wilcoxon test om statistisch twee groepen te vergelijken. Een ANOVA-test met multiple-vergelijking een Tukey post hoc test kan worden gedaan, indien de normale verdeling aanname wordt vervuld in een spruitstuk groep vergelijking. </li><li> Maak grafieken die duidelijk laten vergelijkingen tussen lijnen en tijdstippen langs de dagcyclus. We gebruik Origin Software (Origin Lab) om statistische significantie te testen en het genereren van geschikte grafieken, maar een andere statistische software kan nuttig zijn. </li></ol>

<ol><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).</li>
<li>Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+and+larval+photoreceptors+use+different+mechanisms+to+specify+the+same+Rhodopsin+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates.</a> Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).</li>
<li>Sprecher, S. G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+of+rhodopsin+expression+in+terminally+differentiated+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons.</a> Nature. 454, 533-537 (2008).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Diaz, N. N., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors%3A+unconventional+ways+of+seeing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors: unconventional ways of seeing.</a> Curr. Biol. 21, R25-R27 (2011).</li>
<li>Emery, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+CRY+is+a+deep+brain+circadian+photoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor.</a> Neuron. 26, 493-504 (2000).</li>
<li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293-300 (2005).</li>
<li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).</li>
<li>Gong, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Pairs+of+Neurons+in+the+Central+Brain+Control+Drosophila+Innate+Light+Preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference.</a> Science. 330, 499-502 (2010).</li>
<li>Lilly, M., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((smellblind%3A+a+gene+required+for+Drosophila+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">smellblind: a gene required for Drosophila olfaction.</a> Genetics. 124, 293-302 (1990).</li>
<li>Bodenstein, D. The postembryonic development of Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBodenstein%2C+D+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , John Wiley & Sons. 275-367 (1950).</li>
<li>Pittendrigh, C. S. Circadian systems: Entrainment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPittendrigh%2C+CS+%22Biological+Rhythms%22">Biological Rhythms</a>. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, Plenum. 95-124 (1981).</li>
<li>Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balance+of+Activity+between+LN%28v%29s+and+Glutamatergic+Dorsal+Clock+Neurons+Promotes+Robust+Circadian+Rhythms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila.</a> Neuron. 74, 706-718 (2012).</li>
<li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+light%3A+photobehavior+in+fruit+fly+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).</li>
<li>von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+visual+classical+conditioning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae.</a> Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De lichte voorkeur beschreven test maakt gebruik van de larvale aangeboren photobehavior. De test is eenvoudig vast te stellen, kunnen veel herhalingen tegen lage kosten en levert waardevolle informatie over licht sensing en verwerking. De experimentele paradigma maakt relatief snelle kwantificering van hoeveel mensen de voorkeur licht of donker. Een dergelijke voorkeur kan worden weergegeven als ruwe percentages of als alternatief als Preference Index (PREF). De PREF wordt uitgedrukt als het verschil van dieren die de ...

Hier beschrijven we een gedrags test op basis van de larvale voorkeur voor donker (of licht). Larven reageren met een sterke en stereotiep photonegative respons tijdens foerageren fasen (L1 tot begin L3) 1. De test is bedoeld om de photophobic gedrag van de larve beoordelen en vergelijkt de lichte of donkere voorkeur een groep larven vrij bewegen in een petrischaal bedekt met agar. Dit gedrag assay geeft niet alleen informatie over de gevoeligheid, integratie en temporele plasticiteit van het visuele systeem, verschaft verder aanwijzingen hoe lichtgevoeligheid en wordt gecontroleerd door het circadiane systeem. De Drosophila larvale oog (ook wel Bowlig Organ; BO), is het belangrijkste orgaan voor lichte waarneming. Elk oog is samengesteld uit 12 fotoreceptoren (PR), acht PR drukken de groengevoelige rhodopsin6 (rh6) en vier PR drukken de blauwgevoelige rhodopsin5 (RH5) 2,3. Naast PR, also klasse IV multidendritic neuronen, die het larvale lichaam muur bedekken, zijn geïdentificeerd om te reageren op schadelijke lichtintensiteiten 4,5. Het is ook bekend dat de pacemaker neuronen gelegen in de centrale larvale hersenen uiten het lichtgevoelige eiwit Cryptochrome (Cry) dat fungeert als klok intrinsieke blauw licht sensor in de hersenen 6,7. Intrigerend photophobicity van wild type dieren toont een circadiane component op verschillende tijdstippen in de loop van de dag en nacht bij het testen met deze test. Reacties op licht van foeragerende L3 larve bleek sterker photophobicity bij zonsopgang en lagere photophobicity in de schemering tijdens tests voor licht-donker voorkeur 7. Interessant alleen Rh5-PR&#39;s zijn nodig voor licht vermijden, terwijl Th6-PR&#39;s zijn overbodig. Beide, Rh5-PR&#39;s en Th6-PR&#39;s zijn betrokken bij het ​​resetten van de moleculaire klok door licht 8. De Cry traject moet worden gecoördineerd met de andere licht-sensing paden naar een passende gedrags-output in de orkestrerenloop van de dag. Acetylcholine in PR speelt een essentiële rol in het licht vermijdingsgedrag alsmede meevoeren van de moleculaire klok. Het blokkeren van acetylcholine neurotransmissie van PR tot circadiane pacemaker neuronen reduceert de photophobic reactie in het licht-donker voorkeur test 8. Gebruikmakend van dezelfde test, hebben twee symmetrische paren van neuronen is onlangs geïdentificeerd aan het licht voorkeur van het derde larvale instar van Drosophila 9 schakelen. Deze twee paren van neuronen kunnen functioneren tijdens de late larvale stadia, wanneer dieren het voedsel om vermoedelijk te vinden een geschikte verpopping plaats. Echter, de vraag hoe de visuele pathways interactie en controle larvale visuele gedrag op een circadiane manier blijft grotendeels onbeantwoord. De lichte voorkeur assay maakt vergelijkingen tussen circadiane tijdstippen, vliegen lijnen en circadiane staat onder verschillende licht kwaliteiten. De test is eenvoudig voorbereid en goedkoop en is nuttig geweest eerder in verschillende labs te beschrijven en te bestuderen licht afgeleid gedrag in de larve.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5093-500G</td><td>2,5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Zwitserland </td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>633180</td><td>90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Oostenrijk</td></tr><tr><td>LED-lamp</td><td>OSARAM</td><td>80012 White</td><td>LED-lamp, 80012 White</td></tr><tr><td>Omgevingsmeter</td><td>PCE</td><td>PCE EM882</td><td>Lux, Temp, RH%</td></tr><tr><td>Thermostaatkast</td><td>Aqua Lytic (Liebherr)</td><td>ET636-6</td><td></td></tr><tr><td>Lichttimer</td><td>Timer T</td><td>6185.104</td><td>230V/50HZ (bekijk specificaties voor jouw land)</td></tr><tr><td>Universele thermostaat</td><td>Conrad</td><td>UT200</td><td></td></tr><tr><td>Bevochtiger</td><td>Boneco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zwarte tape</td><td>Tesa</td><td></td><td>5 cm </td></tr><tr><td>Lijm</td><td>Uhu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatorlamp</td><td>Phillips</td><td>Softtone</td><td>5W</td></tr><tr><td>Timerklok</td><td>Ziliss</td><td></td><td>Ziliss, Zwitserland</td></tr><tr><td>Excel Software</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Excel</td></tr><tr><td>Origin Software 8.5</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bakgist</td><td>Migros Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IJzeren steunstaaf 17X28CM</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47808</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283-100ML</td><td>20% azijnzuur verdund in H2O</td></tr><tr><td>Rode lichtlamp</td><td>Phillips</td><td>PFE712E*8C</td><td></td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-25A</td><td></td></tr><tr><td>Voeding</td><td>EA</td><td>EA PS 2042-06B</td><td>Optioneel</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Prix Coop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verwarming</td><td>GOON</td><td>NSB200C</td><td></td></tr><tr><td>Microgolfoven</td><td>Intertronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standaard vliegenvoer van maïsmeel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gedestilleerde water</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lichte voorkeur assay om aangeboren en circadiaanse gereglementeerde photobehavior studeren in<em&gt; drosophila</em&gt; larven

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Licht fungeert als milieu-signaal naar het gedrag van dieren op verschillende niveaus te controleren. De Drosophila larvale zenuwstelsel wordt gebruikt als een uniek model om fundamentele vragen over hoe licht informatie wordt verwerkt en gedeeld tussen snelle en circadiane gedrag te beantwoorden. Drosophila larven weer een stereotype vermijdingsgedrag bij blootstelling aan licht. Aan het licht afhankelijke gedrag vergelijkbaar eenvoudige licht-donker voorkeur tests kunnen worden toegepast onderzoeken. In gewervelde dieren en geleedpotigen de zenuwbanen betrokken bij het voelen en verwerken van visuele input gedeeltelijk overlappen met die verwerking fotische circadiane informatie. De interessante vraag hoe het lichtgevoelige systeem en circadiane systeem communiceren gedrag outputs gecoördineerd blijven grotendeels onontdekt. ​​Drosophila is een botsend biologisch model om deze problemen te benaderen, door een klein aantal neuronen in de hersenen en de beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen voor neuronale MANIPULatie. De gepresenteerde licht-donker voorkeur test laat het onderzoek van een reeks visuele gedragingen waaronder circadiane controle phototaxis.

Volgens het protocol dat hierboven beschreven, testten we licht-donker voorkeur in het vroege derde larvale stadium van wild type Canton-S vliegt op twee verschillende circadiane keer CT0 en CT12. Volwassenen zijn gefokt 12-uur licht-12-uur donker en verlaten om eieren te leggen voor 12 uur. Larven groeien de eerste twee dagen onder dezelfde licht-donker regime. Omdat we wilden circadiaanse modulatie onder constante omstandigheden (vrij lopen van de circadiane klok) te testen, werden larven vervolgens overgebracht naar ...

Hier beschrijven we een licht-donker voorkeur test voor Drosophila larven. Deze test geeft informatie over aangeboren en circadiane regulatie van licht sensing en verwerken photobehavior.

Lichte voorkeur Assay om Aangeboren en Circadiaanse Gereglementeerde Photobehavior studeren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om het aangeboren en circadiane fotogedrag van drosophila-larven te testen aan de hand van een licht-donker voorkeurstest. Dit wordt bereikt door de experimentele larven eerst op te kweken onder gedefinieerde licht-donker condities om een initiële circadiane klok in de larven te vestigen. Vervolgens worden de larven overgezet naar constante duisternis, waardoor de circadiane klok van de larven vrij kan lopen.Zodra het L3-voedingsstadium is bereikt, worden de larven verdeeld in groepen om hun lichtvoorkeur op verschillende circadiane tijdstippen te testen. De resultaten tonen een aangeboren en circadiane lichtvoorkeur aan, gebaseerd op de berekening van een voorkeursindex en een vergelijking tussen de tijdstippen en experimentele groepen. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de aangeboren en circadiane regulatie van lichtwaarneming en de verwerking van fotogedrag, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals olfactie, chemotaxis en thermotaxis.Hetzelfde geldt voor aanpassingen voor leer- en geheugentests. De procedure zal worden gedemonstreerd door Alina en BMA aan de promovendi uit mijn laboratorium. Om eitjes te verzamelen, laat u gepaarde volwassen vliegen 12 uur lang leggen op verse voedingsbodems en brengt u ze vervolgens over naar nieuwe vials. Blijf de volwassen vliegen elke 12 uur overzetten volgens een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker.Bewaar de eicollecties van 12 uur in de incubator. Kweek de dieren voor het experiment op tot het vroege L3-larvumstadium. Deze zijn voedingsklaar 84 tot 108 uur na de eifase.Het correct instellen van de stadia van LAE is cruciaal voor het succes van het experiment. Vanaf het late derde stadium veranderde LAE het fotogedrag om de circadiane componenten van het visuele gedrag te testen. Plaats de verzamelde larven 48 uur voor de test en vlak voor de subjectieve dageraad van de larven in een kartonnen doos.Plaats de doos vervolgens gedurende 48 uur in een incubator met constante duisternis; tot het experiment aanvangt, moeten deze larven ongestoord in hun toegewezen ruimte blijven. Bereid het deksel van een Petri-schaal van 9 cm voor met behulp van een vierkant van 20 cm dat is onderverdeeld in vier kwadranten als leidraad.Lijm vierkanten aluminiumfolie van 10 centimeter op tegenovergestelde kwadranten en bedek deze met zwarte tape. Zorg ervoor dat de rand van het deksel wordt bedekt. Lijm vervolgens een vierkant van 20 centimeter, verdeeld in vier kwadranten, onder de lichtbron op de tafel.Markeer de omtrek van een testschaaltje op het vel om als gids te dienen voor een consistente verplaatsing. Plaats een LED-lamp boven de Petri-schaal met behulp van een statief. Stel de hoogte zo in dat de gehele testplaat homogeen wordt verlicht.Stel de lichtintensiteit op een testlocatie in op tussen de 350 en 760 luxe, door ofwel de hoogte van de lamp verder aan te passen of door een regelbare voeding te gebruiken. De experimentele ruimte moet worden verlicht met rood licht en moet dezelfde temperatuur hebben als de ruimte waar de dieren zijn opgekweekt. De vials werden twee dagen opgekweekt onder constante duisternis.Verzamel de lava uit hun voeding met een spatel van de bovenste vijf millimeter van de voeding. Verdeel de voeding over de buitenkant van een Petrischaaldeksel. Voeg wat water toe aan de voeding en meng dit voorzichtig met de spatel.Voeg met een penseel een druppel kraanwater toe aan een nieuw schaaltje. Breng de larven over naar de waterdruppel om ze te wassen. Verzamel de larven vervolgens met het natte penseel.Selecteer uitsluitend de L3-larven in de vroege voedingsfase en vermijd L3-larven in de late dwalingsfase. Breng de geselecteerde larven over naar het midden van een testplaat. Voedende L3-larven hebben anterieure sferulen die openstaan en naar buiten uitsteken.In een vingerachtige vorm. De posterieure sferen hebben elk drie openingen en vier groepen grote vertakte haren. De speekselklieren strekken zich uit tot het tweede abdominale segment.Zodra 30 larven in het midden van de testplaat zijn geplaatst, wordt deze afgedekt met het geprepareerde deksel. Zet de LED-lamp aan. Start een timer en laat de larven vijf minuten lang vrij bewegen op de plaat.Verwijder vervolgens snel het deksel en tel het aantal larven in de donkere en de lichte kwadranten. Het markeren van de positie van elke larve kan het tellen vergemakkelijken. Een snelle foto kan ook helpen; larven die een onduidelijke lichtvoorkeur vertonen, zoals larven die over de wanden kruipen of zich in de agar ingraven, moeten worden geteld als neutrale voorkeur en worden toegevoegd aan het totale aantal larven bij de berekening van de lichtvoorkeursindex.Gooi na het tellen van de larven de plaat weg en gebruik een nieuwe testplaat voor het volgende experiment. Voer na 10 tot 15 trials per genotype de analyse uit volgens het protocol. De licht-donker voorkeur van Canton ES larven werd vergeleken op twee verschillende circadiane tijdstippen.CT 0 en CT 12, subjectief gezien larven bij dageraad en schemering, werden gedurende 48 uur onder standaardomstandigheden gehouden en vervolgens drie dagen overgezet naar constante duisternis. Licht-donker testen bij 350 luxe onthulden dat de lichtgevoeligheid hoger was bij larven die op CT 0 werden getest in vergelijking met larven die op CT 12 werden getest. Met gebruik van deze formule was de voorkeur voor duisternis van CT 0 larven 0,52 vergeleken met 0,36.De vergelijking van de indexen voor de CT 12-larven met behulp van een Wilcoxon-test levert een significante P-waarde van 0,023 op. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de lichtvoorkeur van trofoforenlarven bij verschillende circuits en tijdspunten voor dit doel kunt testen. U moet in staat zijn om stadium F3-ophidenlarven te entrainen, hun fotofobe gedrag te testen en de lichtvoorkeursindex te berekenen voor statistische vergelijking.

light-preference-assay-to-study-innate-circadian-regulated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven de procedures voor de registratie van de dagelijkse bewegingsactiviteit ritmes...

Het testen van de locomotorische activiteit te circadiaanse ritmes Studie en parameters Sleep in Drosophila</em

Drosophila-larven zijn lichtgevoelig en reageren op veranderingen in het omringende licht. Deze video beschrijft een test die hun vermogen om licht te vermijden test, de zogenaamde light spot assay. Het aanbevolen protocol laat zien hoe u de test instelt met een led met blauw licht en laat zien hoe u het gedrag van het dier kunt registreren als reactie op de ontmoeting met het licht.

Light Spot Assay: een methode om drosophila-fototactisch gedrag te onderzoeken

This video demonstrates the rearing of Drosophila melanogaster under specific light conditions to study the role of Bruchpilot proteins in neurotransmitter release and the resulting modulation of synaptic activity.

Synaptic Modulation in Drosophila After Exposure to Prolonged Light

Dit protocol beschrijft een hoogdoorlaattest voor het testen van ei-legvoorkeuren van Drosophila melanogaster met een nauwkeurigheid per enkel dier. Deze test biedt een eenvoudige, efficiënte en schaalbare platform om genen en circuitonderdelen te identificeren die een eenvoudig besluitvormingsproces controleren.

High Throughput Assay to-eierleggende Voorkeuren van de individuele onderzoeken<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Het doel van dit protocol is om de ex vivo Drosophila larvale hersenen cultuur, geoptimaliseerd voor het controleren van de circadiane moleculaire ritmes met langdurige fluorescentie time-lapse beeldvorming. De toepassing van deze methode op farmacologische testen wordt ook besproken.

Eencellige resolutie fluorescentie leven beeldvorming van Drosophila circadiane klokken in larvale hersenen cultuur

Dit protocol introduceert een lichtvlek test om Drosophila larvale phototactische gedrag te onderzoeken. Bij deze test wordt een lichtvlek opgewekt als licht stimulatie en wordt het proces van het vermijden van larvale licht door een op infraroodlicht gebaseerd beeldvormings systeem vastgelegd.

Licht spot-gebaseerde assay voor analyse van Drosophila larval phototaxis

Hier beschrijven we hoe we Drosophila kunnen synchroniseren met een circadiane dag. Dit is de eerste en belangrijkste stap die nodig is voor het bestuderen van biologische ritmes en chronobiologie.

Circadiane Entrainment van Drosophila Melanogaster

Dit protocol beschrijft hoe een eenvoudige volwassen Drosophila-gedragsobservatiekamer te maken en hoe high-definition foto's / video's van de morfologie of het gedrag van verschillende soorten fruitvliegen in de observatiekamer te maken door middel van relatief eenvoudige en betaalbare methoden.

Een aanpasbaar high-definition beeldvormingssysteem voor gedragsstudies van drosophila-volwassenen

We presenteren een protocol om bi-stabiele fotopigmenten elektrofysiologisch te karakteriseren: (i) het benutten van de ladingsverplaatsingen binnen de fotopigmentmoleculen na fotonabsorptie en hun enorme hoeveelheid in de fotoreceptoren, en (ii) het benutten van de absorptie-spectraverschillen van rhodopsine en metarhodopsine fotopigmenttoestanden. Deze protocollen zijn nuttig om te screenen op mutaties die bi-stabiele fotopigmentsystemen beïnvloeden.

Elektrofysiologische methoden voor het meten van fotopigmentniveaus in Drosophila-fotoreceptoren

Dit artikel presenteert methoden voor optogenetische manipulatie in Drosophila melanogaster, waarbij CsChrimson en GtACR2 worden gebruikt om specifieke neuronen te activeren en tot zwijgen te brengen. Er worden vier experimenten beschreven om optogenetica te gebruiken om thermotactisch en smaakgedrag te onderzoeken, en inzicht te geven in de onderliggende neurale mechanismen die deze processen beheersen.

Gedragstesten voor optogenetische manipulatie van neurale circuits in Drosophila melanogaster

Leer een licht-donker preferentietest voor Drosophila larven om aangeboren en circadiane fotogedrag te bestuderen. Deze methode meet lichtvoorkeur via een preferentie-index en is toepasbaar op andere sensorische modaliteiten.

Lichte voorkeur Assay om Aangeboren en Circadiaanse Gereglementeerde Photobehavior studeren in

Meer video's verkennen