Introductie tot de Microplaatlezer
De microplaatlezer is een veelgebruikt instrument dat het mogelijk maakt om veel monsters tegelijkertijd te meten, alsof er tegelijkertijd veel kleine experimenten worden uitgevoerd.
Dit apparaat wordt gebruikt in combinatie met multiwell-platen, zoals de 96-wellsplaat.
Ongeacht het type experiment dat met de microplaatlezer wordt uitgevoerd, worden standaardcurves vaak gebruikt om de waarde van experimentele monsters te bepalen, evenals positieve en negatieve controles.
Microplaatlezers zijn er in verschillende vormen, maten en instellingen. Veel microplaatlezers hebben multimodale mogelijkheden waardoor er veel verschillende tests kunnen worden uitgevoerd. Deze modaliteiten omvatten de mogelijkheid om verschillende soorten metingen uit te voeren, zoals absorptie-, fluorescerende en luminescente metingen.
Multiwell-platen zijn integrale componenten van de microplaatlezer en worden gebruikt om de monsters te houden die door de machine worden gemeten. Deze platen kunnen verschillende maten hebben, verschillende soorten putbodems en een verschillend aantal putjes hebben. Het type plaat dat wordt gebruikt, hangt af van de test.
De laadlade wordt gebruikt om de 96-wellsplaat in de machine te brengen.
Een computerinterface wordt meestal gebruikt om de plaatlezer te bedienen en de instellingen en parameters, zoals de golflengte en modus, te regelen. De plaatlezersoftware heeft een grafische gebruikersinterface van de plaat waarmee u kunt selecteren welke putjes met monsters zijn geladen.
Multikanaals pipetten worden vaak gebruikt om multi-well-platen te laden. De reservoirs bevatten de oplossingen voor de multikanaalspipet.
Putjes kunnen soms worden geladen met behulp van een standaard enkele kanaalpipet.
Steekproeven en standaarden worden geladen in duplicaat of triplicate om eventuele pipetfouten te compenseren. Hier ziet u een plaat die in triplicate is geladen.
De standaardcurve gebruikt monsters met bekende concentraties, die verschillende absorptiewaarden opleveren. Deze gegevens worden vervolgens gebruikt om een grafiek te maken waarin een lijn van beste pasvorm wordt gegenereerd.
De blanco wordt gebruikt om de mate van uw meting te bepalen die niet experimenteel relevant is en die te wijten is aan de buffers waarin uw monster wordt verdund of reagentia waaraan uw monster wordt blootgesteld. De waarden die uit deze metingen zijn verkregen, worden de “achtergrond” genoemd. De blanco bevat geen monster.
De positieve controle geeft aan of de test goed heeft gewerkt. Het geeft een goed resultaat. De negatieve controle is een controlevariabele waarbij geen meting/effect wordt verwacht. Het zou geen resultaat mogen opleveren..
Zodra de plaat is ingesteld, is het tijd om de monsters te laden. Om te voorkomen dat u de verkeerde monsters meet of de plaat verkeerd laadt, is het van cruciaal belang om de plaat correct te orienteren in de laadlade. Vergeet niet voorzichtig te zijn bij het laden van monsters in de lade, zodat u de lade niet in het apparaat duwt of uw uiteinden in het apparaat vangt.
Zodra de lade is geladen, worden parameters zoals de modus, golflengte en volgorde van het laden van de putjes ingesteld in de software voordat de plaat wordt gelezen.
Nadat de parameters zijn ingesteld, wordt de plaat gelezen en genereert de lezer een uitlezing van waarden in de software.
Zodra de plaat is gelezen, gebruikt u de gemiddelde waarde van de blanco monsters om de achtergrond van alle monsters af te trekken, inclusief de standaardcurve.
Na het lezen worden de bekende concentratiewaarden voor de standaarden uitgezet tegen hun respectieve gemeten waarden, absorptie in dit geval.
Wanneer de waarden zijn uitgezet, kan de lijn van beste pasvorm worden berekend met behulp van een lineaire regressie. Dit kan eenvoudig worden gedaan met behulp van een spreadsheetprogramma.
De bepalingcoëfficiënt, een statistische maat voor hoe goed de lijn de feitelijke datapunten voorspelt, moet tussen 0,90-0,99 liggen, waarbij 0,99 als de beste waarde wordt beschouwd en aangeeft dat de lijn perfect past bij de gegevens.
Met behulp van de lijn van beste pasvorm kunnen we de concentratiewaarden van experimentele monsters of controles in elke put berekenen door de absorptiewaarde in te vullen voor Y en vervolgens de vergelijking op te lossen voor X. Concentratiewaarden kunnen ook worden geschat door een lijn te trekken van de absorptiewaarde op de Y-as naar de beste pasvormlijn en vervolgens naar de X-as.
Veel soorten microplaatlezers meten absorptie, die wordt gedefinieerd als de logaritmische verhouding van licht dat op een object valt tot het licht dat door een object wordt doorgelaten.
De Bradford-test is een voorbeeld van een op absorptie gebaseerde microplaatlezertest, waarbij eiwitmonsters aan de plaat worden toegevoegd met de “Bradford” reagens. Deze verbinding bindt zich aan de eiwitten in het monster en veroorzaakt een verschuiving in de absorptie.
Bij fluorescentie-gebaseerde assays wordt een fluorofoor geactiveerd door een bepaalde golflengte van licht en veroorzaakt op zijn beurt excitatie van de fluorofoor, die licht uitstraalt bij een andere golflengte.
Wanneer u werkt met lichtgevoelige reagentia, zorg er dan voor dat u ze bedekt om fotobleking en het verpesten van het experiment te voorkomen.
Luminescente assays stralen licht uit via een chemische reactie en gebruiken vaak luciferase. Luciferase komt uit verschillende bronnen zoals vuurvliegjes. In een luciferasereactie wordt licht uitgestoten wanneer luciferase zuurstof, ATP en magnesium tegenkomt in een reeks reacties.
Luminescente assays hebben veel verschillende toepassingen. Een voorbeeld van deze toepassing is het meten en detecteren van reactieve zuurstofsoorten in kankers.
Andere toepassingen, die microplaatlezers gebruiken, omvatten high-throughput assays met 384- en 1536-wells. In deze assays worden platen geladen door een robot. Nee, niet dat soort robot. Een programmeerbare robot die extreem nauwkeurige monsterbehandeling automatiseert.
Je hebt net de
De microplaatlezer is een multimodaal instrument dat het mogelijk maakt om verschillende experimenten tegelijk uit te voeren en te meten. Microplaatle…
De microplaatlezer is een veelgebruikt instrument dat het mogelijk maakt om veel monsters tegelijkertijd te meten, alsof er tegelijkertijd veel kleine experimenten worden uitgevoerd.
Dit apparaat wordt gebruikt in combinatie met multiwell-platen, zoals de 96-wellsplaat.
Ongeacht het type experiment dat met de microplaatlezer wordt uitgevoerd, worden standaardcurves vaak gebruikt om de waarde van experimentele monsters te bepalen, evenals positieve en negatieve controles.
Microplaatlezers zijn er in verschillende vormen, maten en instellingen. Veel microplaatlezers hebben multimodale mogelijkheden waardoor er veel verschillende tests kunnen worden uitgevoerd. Deze modaliteiten omvatten de mogelijkheid om verschillende soorten metingen uit te voeren, zoals absorptie-, fluorescerende en luminescente metingen.
Multiwell-platen zijn integrale componenten van de microplaatlezer en worden gebruikt om de monsters te houden die door de machine worden gemeten. Deze platen kunnen verschillende maten hebben, verschillende soorten putbodems en een verschillend aantal putjes hebben. Het type plaat dat wordt gebruikt, hangt af van de test.
De laadlade wordt gebruikt om de 96-wellsplaat in de machine te brengen.
Een computerinterface wordt meestal gebruikt om de plaatlezer te bedienen en de instellingen en parameters, zoals de golflengte en modus, te regelen. De plaatlezersoftware heeft een grafische gebruikersinterface van de plaat waarmee u kunt selecteren welke putjes met monsters zijn geladen.
Multikanaals pipetten worden vaak gebruikt om multi-well-platen te laden. De reservoirs bevatten de oplossingen voor de multikanaalspipet.
Putjes kunnen soms worden geladen met behulp van een standaard enkele kanaalpipet.
Steekproeven en standaarden worden geladen in duplicaat of triplicate om eventuele pipetfouten te compenseren. Hier ziet u een plaat die in triplicate is geladen.
De standaardcurve gebruikt monsters met bekende concentraties, die verschillende absorptiewaarden opleveren. Deze gegevens worden vervolgens gebruikt om een grafiek te maken waarin een lijn van beste pasvorm wordt gegenereerd.
De blanco wordt gebruikt om de mate van uw meting te bepalen die niet experimenteel relevant is en die te wijten is aan de buffers waarin uw monster wordt verdund of reagentia waaraan uw monster wordt blootgesteld. De waarden die uit deze metingen zijn verkregen, worden de “achtergrond” genoemd. De blanco bevat geen monster.
De positieve controle geeft aan of de test goed heeft gewerkt. Het geeft een goed resultaat. De negatieve controle is een controlevariabele waarbij geen meting/effect wordt verwacht. Het zou geen resultaat mogen opleveren..
Zodra de plaat is ingesteld, is het tijd om de monsters te laden. Om te voorkomen dat u de verkeerde monsters meet of de plaat verkeerd laadt, is het van cruciaal belang om de plaat correct te orienteren in de laadlade. Vergeet niet voorzichtig te zijn bij het laden van monsters in de lade, zodat u de lade niet in het apparaat duwt of uw uiteinden in het apparaat vangt.
Zodra de lade is geladen, worden parameters zoals de modus, golflengte en volgorde van het laden van de putjes ingesteld in de software voordat de plaat wordt gelezen.
Nadat de parameters zijn ingesteld, wordt de plaat gelezen en genereert de lezer een uitlezing van waarden in de software.
Zodra de plaat is gelezen, gebruikt u de gemiddelde waarde van de blanco monsters om de achtergrond van alle monsters af te trekken, inclusief de standaardcurve.
Na het lezen worden de bekende concentratiewaarden voor de standaarden uitgezet tegen hun respectieve gemeten waarden, absorptie in dit geval.
Wanneer de waarden zijn uitgezet, kan de lijn van beste pasvorm worden berekend met behulp van een lineaire regressie. Dit kan eenvoudig worden gedaan met behulp van een spreadsheetprogramma.
De bepalingcoëfficiënt, een statistische maat voor hoe goed de lijn de feitelijke datapunten voorspelt, moet tussen 0,90-0,99 liggen, waarbij 0,99 als de beste waarde wordt beschouwd en aangeeft dat de lijn perfect past bij de gegevens.
Met behulp van de lijn van beste pasvorm kunnen we de concentratiewaarden van experimentele monsters of controles in elke put berekenen door de absorptiewaarde in te vullen voor Y en vervolgens de vergelijking op te lossen voor X. Concentratiewaarden kunnen ook worden geschat door een lijn te trekken van de absorptiewaarde op de Y-as naar de beste pasvormlijn en vervolgens naar de X-as.
Veel soorten microplaatlezers meten absorptie, die wordt gedefinieerd als de logaritmische verhouding van licht dat op een object valt tot het licht dat door een object wordt doorgelaten.
De Bradford-test is een voorbeeld van een op absorptie gebaseerde microplaatlezertest, waarbij eiwitmonsters aan de plaat worden toegevoegd met de “Bradford” reagens. Deze verbinding bindt zich aan de eiwitten in het monster en veroorzaakt een verschuiving in de absorptie.
Bij fluorescentie-gebaseerde assays wordt een fluorofoor geactiveerd door een bepaalde golflengte van licht en veroorzaakt op zijn beurt excitatie van de fluorofoor, die licht uitstraalt bij een andere golflengte.
Wanneer u werkt met lichtgevoelige reagentia, zorg er dan voor dat u ze bedekt om fotobleking en het verpesten van het experiment te voorkomen.
Luminescente assays stralen licht uit via een chemische reactie en gebruiken vaak luciferase. Luciferase komt uit verschillende bronnen zoals vuurvliegjes. In een luciferasereactie wordt licht uitgestoten wanneer luciferase zuurstof, ATP en magnesium tegenkomt in een reeks reacties.
Luminescente assays hebben veel verschillende toepassingen. Een voorbeeld van deze toepassing is het meten en detecteren van reactieve zuurstofsoorten in kankers.
Andere toepassingen, die microplaatlezers gebruiken, omvatten high-throughput assays met 384- en 1536-wells. In deze assays worden platen geladen door een robot. Nee, niet dat soort robot. Een programmeerbare robot die extreem nauwkeurige monsterbehandeling automatiseert.
Je hebt net de
De microplaatlezer is een veelgebruikt instrument dat het mogelijk maakt om veel monsters tegelijkertijd te meten, alsof er tegelijkertijd veel kleine experimenten worden uitgevoerd.
Dit apparaat wordt gebruikt in combinatie met multiwell-platen, zoals de 96-wellsplaat.
Ongeacht het type experiment dat met de microplaatlezer wordt uitgevoerd, worden standaardcurves vaak gebruikt om de waarde van experimentele monsters te bepalen, evenals positieve en negatieve controles.
Microplaatlezers zijn er in verschillende vormen, maten en instellingen. Veel microplaatlezers hebben multimodale mogelijkheden waardoor er veel verschillende tests kunnen worden uitgevoerd. Deze modaliteiten omvatten de mogelijkheid om verschillende soorten metingen uit te voeren, zoals absorptie-, fluorescerende en luminescente metingen.
Multiwell-platen zijn integrale componenten van de microplaatlezer en worden gebruikt om de monsters te houden die door de machine worden gemeten. Deze platen kunnen verschillende maten hebben, verschillende soorten putbodems en een verschillend aantal putjes hebben. Het type plaat dat wordt gebruikt, hangt af van de test.
De laadlade wordt gebruikt om de 96-wellsplaat in de machine te brengen.
Een computerinterface wordt meestal gebruikt om de plaatlezer te bedienen en de instellingen en parameters, zoals de golflengte en modus, te regelen. De plaatlezersoftware heeft een grafische gebruikersinterface van de plaat waarmee u kunt selecteren welke putjes met monsters zijn geladen.
Multikanaals pipetten worden vaak gebruikt om multi-well-platen te laden. De reservoirs bevatten de oplossingen voor de multikanaalspipet.
Putjes kunnen soms worden geladen met behulp van een standaard enkele kanaalpipet.
Steekproeven en standaarden worden geladen in duplicaat of triplicate om eventuele pipetfouten te compenseren. Hier ziet u een plaat die in triplicate is geladen.
De standaardcurve gebruikt monsters met bekende concentraties, die verschillende absorptiewaarden opleveren. Deze gegevens worden vervolgens gebruikt om een grafiek te maken waarin een lijn van beste pasvorm wordt gegenereerd.
De blanco wordt gebruikt om de mate van uw meting te bepalen die niet experimenteel relevant is en die te wijten is aan de buffers waarin uw monster wordt verdund of reagentia waaraan uw monster wordt blootgesteld. De waarden die uit deze metingen zijn verkregen, worden de “achtergrond” genoemd. De blanco bevat geen monster.
De positieve controle geeft aan of de test goed heeft gewerkt. Het geeft een goed resultaat. De negatieve controle is een controlevariabele waarbij geen meting/effect wordt verwacht. Het zou geen resultaat mogen opleveren..
Zodra de plaat is ingesteld, is het tijd om de monsters te laden. Om te voorkomen dat u de verkeerde monsters meet of de plaat verkeerd laadt, is het van cruciaal belang om de plaat correct te orienteren in de laadlade. Vergeet niet voorzichtig te zijn bij het laden van monsters in de lade, zodat u de lade niet in het apparaat duwt of uw uiteinden in het apparaat vangt.
Zodra de lade is geladen, worden parameters zoals de modus, golflengte en volgorde van het laden van de putjes ingesteld in de software voordat de plaat wordt gelezen.
Nadat de parameters zijn ingesteld, wordt de plaat gelezen en genereert de lezer een uitlezing van waarden in de software.
Zodra de plaat is gelezen, gebruikt u de gemiddelde waarde van de blanco monsters om de achtergrond van alle monsters af te trekken, inclusief de standaardcurve.
Na het lezen worden de bekende concentratiewaarden voor de standaarden uitgezet tegen hun respectieve gemeten waarden, absorptie in dit geval.
Wanneer de waarden zijn uitgezet, kan de lijn van beste pasvorm worden berekend met behulp van een lineaire regressie. Dit kan eenvoudig worden gedaan met behulp van een spreadsheetprogramma.
De bepalingcoëfficiënt, een statistische maat voor hoe goed de lijn de feitelijke datapunten voorspelt, moet tussen 0,90-0,99 liggen, waarbij 0,99 als de beste waarde wordt beschouwd en aangeeft dat de lijn perfect past bij de gegevens.
Met behulp van de lijn van beste pasvorm kunnen we de concentratiewaarden van experimentele monsters of controles in elke put berekenen door de absorptiewaarde in te vullen voor Y en vervolgens de vergelijking op te lossen voor X. Concentratiewaarden kunnen ook worden geschat door een lijn te trekken van de absorptiewaarde op de Y-as naar de beste pasvormlijn en vervolgens naar de X-as.
Veel soorten microplaatlezers meten absorptie, die wordt gedefinieerd als de logaritmische verhouding van licht dat op een object valt tot het licht dat door een object wordt doorgelaten.
De Bradford-test is een voorbeeld van een op absorptie gebaseerde microplaatlezertest, waarbij eiwitmonsters aan de plaat worden toegevoegd met de “Bradford” reagens. Deze verbinding bindt zich aan de eiwitten in het monster en veroorzaakt een verschuiving in de absorptie.
Bij fluorescentie-gebaseerde assays wordt een fluorofoor geactiveerd door een bepaalde golflengte van licht en veroorzaakt op zijn beurt excitatie van de fluorofoor, die licht uitstraalt bij een andere golflengte.
Wanneer u werkt met lichtgevoelige reagentia, zorg er dan voor dat u ze bedekt om fotobleking en het verpesten van het experiment te voorkomen.
Luminescente assays stralen licht uit via een chemische reactie en gebruiken vaak luciferase. Luciferase komt uit verschillende bronnen zoals vuurvliegjes. In een luciferasereactie wordt licht uitgestoten wanneer luciferase zuurstof, ATP en magnesium tegenkomt in een reeks reacties.
Luminescente assays hebben veel verschillende toepassingen. Een voorbeeld van deze toepassing is het meten en detecteren van reactieve zuurstofsoorten in kankers.
Andere toepassingen, die microplaatlezers gebruiken, omvatten high-throughput assays met 384- en 1536-wells. In deze assays worden platen geladen door een robot. Nee, niet dat soort robot. Een programmeerbare robot die extreem nauwkeurige monsterbehandeling automatiseert.
Je hebt net de
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a microplate reader and how does it work?
A microplate reader is an instrument that simultaneously measures many samples using multiwell plates, such as 96-well plates. It performs multiple miniature experiments at once by detecting different types of measurements including absorbance, fluorescence, and luminescence. The computer interface controls settings like wavelength and mode to automate sample analysis across all wells.
Q2: Why are standard curves used in microplate reader assays?
Standard curves determine experimental sample values by using samples with known concentrations that yield different absorbance values. A line of best fit is generated from this data, allowing unknown sample concentrations to be calculated or estimated. The coefficient of determination should be between 0.90-0.99 to ensure the line accurately predicts actual data points.
Q3: What role do controls play in microplate reader experiments?
Blanks determine background measurement not related to the experiment, using buffers or reagents without samples. Positive controls confirm the assay worked properly by yielding expected results. Negative controls show no measurement or effect should occur. Together, these controls validate assay accuracy and identify any experimental errors or contamination.
Q4: How should samples be loaded into a microplate for accurate results?
Samples and standards are loaded in duplicate or triplicate to account for pipetting errors. Multichannel pipettes are often used for efficient loading, though single-channel pipettes work for individual wells. Proper plate orientation in the loading tray is critical to prevent measuring wrong samples. Exercise caution when loading to avoid forcing the tray or catching extremities in the instrument.
Q5: What are the different measurement types available on multimodal microplate readers?
Multimodal microplate readers can perform absorbance measurements, which detect light transmitted through samples; fluorescence measurements, where a fluorochrome is excited by light and emits at a different wavelength; and luminescence measurements, which detect light from chemical reactions like luciferase. Light-sensitive reagents must be kept covered to prevent photobleaching and preserve experiment integrity.
Q6: How is background subtraction performed after reading a microplate?
After the plate is read, the average value of blank samples is calculated and subtracted from all sample measurements, including the standard curve. This removes background noise caused by buffers or reagents not related to the experiment. Background subtraction ensures that measured values reflect only the experimental signal of interest.
Q7: What are common applications of microplate readers in research?
Microplate readers quantify protein levels, measure gene expression, and detect metabolic processes such as reactive oxygen species production in cancer research and calcium flux. High-throughput assays using 384- and 1536-well plates employ programmable robots for automated, precise sample handling. These applications enable rapid analysis of thousands of samples simultaneously.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:42
Components of a Microplate Reader
1:53
Using a Microplate Reader with a 96-well Plate
5:30
Applications
7:24
Summary
Videos from this collection: