Introductie tot de microplaatlezer

De microplaatlezer is een veelgebruikt instrument waarmee veel monsters gelijktijdig kunnen worden gemeten, alsof er veel minuscule experimenten tegelijkertijd worden uitgevoerd.

Dit apparaat wordt gebruikt in combinatie met multiwell-platen, zoals de 96-wells plaat.

Ongeacht het type experiment dat met de microplaatlezer wordt uitgevoerd, worden vaak standaardcurven gebruikt om de waarde van experimentele monsters te bepalen, evenals positieve en negatieve controles.

Microplate-readers komen voor in verschillende vormen, maten en configuraties. Veel microplate-readers beschikken over multimodale mogelijkheden, waardoor er veel verschillende assays kunnen worden uitgevoerd. Deze modaliteiten omvatten het vermogen om verschillende soorten metingen uit te voeren, zoals absorptie-, fluorescentie- en luminescentiemetingen.

Multiwellplaten zijn essentiële componenten van de microplate-reader en worden gebruikt om de monsters te bevatten die door het apparaat worden gemeten. Deze platen kunnen verschillende maten hebben, verschillende typen bodems van de wells en een verschillend aantal wells. Het type plaat dat wordt gebruikt, is afhankelijk van de assay.

De lade wordt gebruikt om de 96-wellplaat in het apparaat te plaatsen.

Doorgaans wordt een computerinterface gebruikt om de plate-reader te bedienen en de instellingen en parameters, zoals de golflengte en de modus, te beheren. De software van de plate-reader heeft een grafische gebruikersinterface van de plaat waarmee kan worden geselecteerd welke wells met monsters zijn gevuld.

Meerkanaals pipetten worden vaak gebruikt om multi-well platen te vullen. De reservoirs bevatten de oplossingen voor de meerkanaals pipet.

Wells kunnen soms worden gevuld met een standaard enkelkanaals pipet.

Monsters en standaarden worden in dubbeltoom of triplikaat geladen om rekening te houden met eventuele pipetteerfouten. Hier ziet u een plaat die in triplikaat is gevuld.

Voor de standaardcurve worden monsters met bekende concentraties gebruikt, die verschillende absorbentiewaarden opleveren. Deze gegevens worden vervolgens gebruikt om een grafiek te maken waarin een beste passing-lijn wordt gegenereerd.

De blanco wordt gebruikt om vast te stellen welk deel van uw meting niet experimenteel relevant is en wordt veroorzaakt door de buffers waarin uw monster is verdund of de reagentia waaraan uw monster is blootgesteld. De waarden die uit deze metingen voortvloeien, worden de "achtergrond" genoemd. De blanco bevat geen monster.

De positieve controle geeft aan of de assay correct heeft gewerkt. Deze geeft een positief resultaat. De negatieve controle is een controlevariabele waarbij geen meting/effect wordt verwacht. Deze zou geen resultaat mogen opleveren.

Zodra de plaat is klaargezet, is het tijd om de monsters te laden. Om te voorkomen dat de verkeerde monsters worden gemeten of de plaat verkeerd wordt geladen, is het essentieel om de plaat correct te oriënteren in de lade. Let er bij het laden van monsters in de lade op voorzichtig te zijn, zodat de lade niet met kracht in het instrument wordt geduwd en ledematen niet bekneld raken in het instrument.

Zodra de lade is geladen, worden parameters zoals de modus, golflengte en de volgorde van het vullen van de wells ingesteld in de software voordat de plaat wordt uitgelezen.

Nadat de parameters zijn ingesteld, wordt de plaat uitgelezen en genereert de reader een overzicht van waarden binnen de software.

Nadat de plaat is uitgelezen, wordt de gemiddelde waarde van de blanco-monsters gebruikt om de achtergrond af te trekken van alle monsters, inclusief de standaardcurve.

Na het uitlezen worden de bekende concentratiewaarden voor de standaarden uitgezet tegen hun respectievelijke gemeten waarden, in dit geval de absorbentie.

Wanneer de waarden zijn uitgezet, kan de beste passing-lijn worden berekend met behulp van een lineaire regressie. Dit kan eenvoudig worden gedaan met een spreadsheetprogramma.

De determinatiecoëfficiënt, een statistische maatstaf voor hoe goed de lijn de werkelijke datapunten voorspelt, moet tussen 0,90-0,99 liggen, waarbij 0,99 als de beste waarde wordt beschouwd en aangeeft dat de lijn perfect bij de gegevens past.

Met behulp van de beste passing-lijn kunnen we de concentratiewaarden van experimentele monsters of controles in elke well berekenen door de absorbentiewaarde in te vullen voor Y en vervolgens de vergelijking op te lossen voor X. Concentratiewaarden kunnen ook worden geschat door een lijn te trekken van de absorbentiewaarde op de Y-as naar de beste passing-lijn en vervolgens naar beneden naar de X-as.

Veel typen microplate-readers meten de absorbentie, wat gedefinieerd wordt als de logaritmische verhouding tussen het licht dat op een object valt en het licht dat door een object wordt doorgelaten.

De Bradford-assay is een voorbeeld van een microplate-reader-assay op basis van absorbentie, waarbij eiwitmonsters aan de plaat worden toegevoegd samen met het "Bradford"-reagens. Deze verbinding bindt aan de eiwitten in het monster, wat een verschuiving in de absorbentie veroorzaakt.

Bij assays op basis van fluorescentie wordt een fluorochroom geactiveerd door een bepaalde golflengte van het licht, wat op zijn beurt excitatie van het fluorochroom veroorzaakt, dat licht uitzendt bij een andere golflengte.

Zorg ervoor dat lichtgevoelige reagentia bedekt blijven wanneer u ermee werkt, om fotobleken en het mislukken van het experiment te voorkomen.

Luminescentie-assays zenden licht uit via een chemische reactie en maken vaak gebruik van luciferase. Luciferase is afkomstig uit diverse bronnen, zoals vuurvliegjes. In een luciferase-reactie wordt licht uitgezonden wanneer luciferase in een reeks reacties in contact komt met zuurstof, ATP en magnesium.

Luminescentie-assays hebben vele verschillende toepassingen. Een voorbeeld hiervan is het meten van de productie en detectie van reactieve zuurstofcomponenten in kankercellen.

Andere toepassingen waarbij microplate-readers worden gebruikt, omvatten high-throughput-assays met 384- en 1536-wells. Bij deze assays worden de platen geladen door een robot. Nee, niet dat soort robot. Een programmeerbare robot die extreem nauwkeurige monsterverwerking automatiseert.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over de microplaatlezer bekeken. In deze video hebben we laten zien wat een microplaatlezer is(A), hoe deze wordt gebruikt(B), hoe u dit instrument bedient(C), hoe microplaatlezergegevens moeten worden geïnterpreteerd en enkele toepassingen van een microplaatlezer(D). Bedankt voor het kijken.