Name: Lengte van telomeren en telomerase activiteit; Een Yin en Yang van celsenescentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Leer een kosteneffectieve qRT-PCR-methode om telomeerlengte en telomerase-activiteit te meten in meerdere weefsels. Deze techniek helpt onderzoekers bij het bestuderen van celveroudering en leeftijdsgerelateerde ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Telomeren Lengte Protocol 19 <ol><li> DNA isolatie </li></ol> De meeste DNA isolatiemethoden worden gebruikt. Onze Lab geeft de voorkeur aan Qiagen DNeasy Kit (# 69506) voor bloed bronnen. Afhankelijk van de bron van DNA, zoals buccale of andere bronnen, kan een andere isolatiemethode worden gebruikt. <ol start="2"><li> Primers: </li></ol> Alle primers zijn verdund tot een voorraad concentratie van 100pmoles/μl in PCR kwaliteit water en bewaard bij -20 ° C totdat ze nodig waren. Werkvoorraden van primers worden vers en opgeslagen bij 20 ° C gedurende een korte tijd (enkele maanden.) Standaard primers werden gebruikt voor telomeren en β-globine, SCG, zoals beschreven in O&#39;Callaghan et al.. 20 . Primer sequenties: Telo 1: 5&#39;-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 &#39; Telo 2: 5&#39;-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 &#39; SCG 1: 5&#39;-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 &#39; SCG 2: 5&#39;-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 &#39; Opmerking: Primers worden verdund tot een werkconcentratie van 10pmoles/μl, voorafgaand aan het toevoegen aan reactiemix. <ol start="3"><li> Seriële verdunning van genomisch DNA: </li></ol> Seriële verdunningen van genomisch DNA voor Telo en Single Copy Gene (SCG) zijn gemaakt om een ​​standaard curve Ct waarde voor de test genereren. De genomische DNA gebruikt werd geëxtraheerd uit lymfocyten uit bloedmonsters. Deze verdunningen worden gemaakt door verdunnen DNA met PCR klasse H 2 0 elke concentratie met een factor van 1,68 in de twee seriële verdunningen met dezelfde genomische DNA verkregen. De uitgangsconcentraties zijn geoptimaliseerd op basis van trial and error en moet worden aangepast als er andere reagentia, instrumenten, DNA van andere species, celtypen en SCG gebruikt. Opmerking: Seriële verdunning met genomisch DNA door voorzichtig te mengen en wachten tenminste 15 minuten tot een uur before die DNA voor de volgende verdunning. Elke verdunning vereist tijd voor genomisch DNA te distantiëren. Voor lange termijn opslag, aliquot seriële verdunningen in PCR strips voor opslag bij -80 ° C. Elke PCR-strip wordt ontdooid en een keer gebruikt om vries dooi cycli die DNA kunnen beschadigen. <ol start="4"><li> Reaction opstelling voor RT-PCR </li></ol> Instrument gebruikt: Roche480 Light Renner Reagens: Roche Light cycler SYBR-groen Verdun test-DNA monsters tot een eindconcentratie van 10 ng / ul. We testen concentratie behulp Nanodrop of qubit. We verder verdunnen het DNA van 10ng/μl naar finale 5ng/μl. Wij concentratie niet opnieuw te testen. Reactiecomponenten: <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> TELO </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td><td fo:width=".25in" rowspan="6"></td><td fo:width="1.5in"> SCG </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td></tr><tr><td> H 2 0 &lt;/ Td&gt; <td> 6 pl </td><td> H20 </td><td> 6 pl </td></tr><tr><td> Telo 1 </td><td> 0,2 pl </td><td> SCG 1 </td><td> 0,6 pl </td></tr><tr><td> Telo 2 </td><td> 1.8 ul </td><td> SCG 2 </td><td> 1.4 ul </td></tr><tr><td> Rxn mix </td><td> 10 gl </td><td> Rxn mix </td><td> 10 gl </td></tr><tr><td> DNA of seriële verdunning </td><td> 2 pi </td><td> DNA of seriële verdunning </td><td> 2 pi </td></tr></tbody></table> Opmerking: Master Mix zonder DNA en met een overmaat van 5% tot 10%. Zowel Telo en SCG tegelijkertijd worden uitgevoerd op dezelfde plaat met het volgende programma. Om te testen voor precisie, ten minste drie duplo van elk monster en de controle moet worden uitgevoerd. Variaties in de gebruikte primers kunnen hebben op de resultaten. Ons protocol is geoptimaliseerd om te werken als volgt op de Roche480 Light Renner en onze primers. Invrijwaart de oorspronkelijke denatureren 10 min 95 ° C denatureren Fiets 95 ° C 10 sec hold 60 ° C 5 seconden hold 72 ° C 11 seconden wacht en eenmalige acquisitie Herhaal 45-55 keer als nodig 2. Kwantitatieve Telomerase Detection (QTD) Protocol (Gebaseerd op QTD Kit door geallieerde Biotech, Inc Cat. No MT3012) Extract Voorbereiding <ol><li> Pellet cellen of weefsel. </li><li> Was eenmaal met 1x PBS. </li><li> Repellet en verwijder 1x PBS. * </li><li> Resuspendeer de celpellet in 200 ui 1 x lysisbuffer voor elke 10 5 -10 6 cellen of 40-100 mg weefsel. </li><li> Incubeer op ijs gedurende 30 minuten. </li><li> Spin down het monster bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. </li><li> Breng 160 pi van het supernatant naar een nieuwe buis en eiwitconcentratie te bepalen. </li><li> Aliquot en quick-bevriezing van de resterende extract op droog ijs / ethanol, bewaar bij -80 ° C. </li></ol> * In tzijn toestand telomerase in bevroren cellen of weefsels is stabiel gedurende tenminste een jaar. Wanneer ontdooid voor gebruik, resuspendeer de cellen onmiddellijk in 1 x Lysis Buffer. 2.1. Assay Controls Inactivatie control: Voor elk monster warmtebehandeling bijkomende garantie extract door incubatie bij 85 ° C gedurende 10 min voor telomerase-activiteit assay. Standaardcurve voor TSR control template: Voer Kwantitatieve Real-Time PCR met behulp van verdunningen van TSR, een oligonucleotide met een vergelijkbare sequentie telomere primers die bij de kit om een ​​standaardkromme te genereren. <ol><li> Bereid 01:05 seriële verdunningen van de voorraad TSR concentratie (0,5 Amoles / ul) met lyseerbuffer </li><li> Voer de telomerase detectie standaardtest met 1 pi van elke verdunning TSR, zoals de voorraadconcentratie. Deze verdunningen kunnen bij 4 ° C gedurende ten minste 2 weken opgeslagen. </li></ol> 2.2. Telomerase activiteit Assaybehulp QTD Real-Time PCR <ol><li> Voor elk monster, voeg het volgende toe aan een PCR-buis of dunwandige PCR-plaat (totaal volume 25,0 pi): <ul><li> 12,5 ui 2 x QTD Premix </li><li> 1.0 ul cel of weefsel extract </li><li> 11,5 ui PCR Qualified Water </li></ul></li><li> Meng goed </li><li> Programma Real-Time PCR Detection Systems volgens het onderstaande programma: - 25 ° C gedurende 20 min (telomerase reactie) - 95 ° C gedurende 10 min (PCR eerste activeringsstap) 35-40 cycli van: - 95 ° C gedurende 30 seconden (denaturatie) - 60 ° C gedurende 30 seconden (annealing) - 72 ° C gedurende 30 seconden (verlenging) </li><li> Plaats PCR buisjes in het PCR-apparaat en start het fiets-programma. </li><li> Verzamel de drempel cyclus of C T waarde na cycli afwerking. De drempel cyclus de cyclus waarbij een statistisch significante toename van ΔRn eerst wordt gedetecteerd. </li></ol> 2.3. Data Analysis <ol><li> Generatea standaard curve met behulp van de C T lezingen en vergelijk telomerase-activiteit. </li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De lengte van telomeren biedt een unieke cellulaire marker om de gestresste en veroudering cel bestuderen en biedt inzichten in de mechanismen van veroudering. Sinds haar rol in veroudering eerst was voorgesteld, hebben een veelheid van studies gedaan met betrekking tot de lengte van telomeren leeftijd, levensverwachting, leeftijd-gerelateerde ziekte, kanker, en stress. Al tientallen jaren, de gouden standaard van de lengte van telomeren metingen was terminal restrictiefragmentanalyse behulp Southern hybridisatie. Echte...

Telomeren zijn DNA hexameer (TTAGGG) sequenties gevonden aan de uiteinden van chromosomen herhalen. In elke cel replicatie, worden deze chromosoomeinden verkort. Als ze het te kort, kan chromosomen telomeren einde fusies, afwijkende recombinatie, en degradatie ondergaan. Dus voldoende lengte van telomeren onderhoud speelt een belangrijke rol in het chromosoom stabiliteit en celbescherming 38. Lengte van telomeren onderhoud is ook cruciaal voor genen gevonden in de buurt van de uiteinden van chromosomen, omdat DNA-replicatie kan niet doorgaan tot het einde van de chromosomen 1-2. Bijgevolg kan voorkomen telomeerverkorting cel stabiliteit. Talrijke studies hebben gemeld dat telomere length is gecorreleerd met de levensduur van een organisme en zieke toestand, zoals bij kanker 3-4, 5 diabetes en cardiovasculaire ziekte 6,7. Daarnaast zijn verkorte telomeren geassocieerd met overmatige stress of eenongezonde leefstijl 8, misschien door het bevorderen van vroegtijdige veroudering van cellen en dood 9. Anderzijds hebben sommige studies gevonden dat er geen significant verschil tussen de lengte van telomeren en levensduur en leeftijdsgebonden ziekte 39, 40, 41. Een van de cel aangeboren mechanismen van bescherming van telomere verkorting is door activering eigen enzym telomerase reverse transcriptase (TERT). Dit enzym en subeenheid telomerase RNA (TERC), een niet-coderende RNA, gebruiken de telomeer als sjabloon telomeer herhalingen toevoegen chromosoomuiteinden 10. Hoewel telomerase activiteit afwezig verschillende soorten cellen en andere mechanismen betrokken zijn bij telomerelengte onderhoud verhoogd telomerase-activiteit gecorreleerd met verhoogde telomeren. Telomerase activering is opgericht als een van de mechanismen waarmee cellen reageren op schade en benadrukken en te voorkomen dat voortijdige veroudering en dood. Bijvoorbeeld, meer telomeres werden aangetoond in een populatie van Ashkenazi Joden uitzonderlijke levensduur 11 mutaties van TERC of TERT aangetoond bijdragen tot fatale ziekte 12 en epigenetische regulatie van telomerase is aangetoond dat een effect van leeftijd-gerelateerde ziekte 13 hebben. Sinds de ontdekking, is de lengte van telomeren is voorgesteld als een biomarker voor de gezondheidstoestand in verschillende diermodellen en in mensen, maar deze vroege studies waren moeilijk te repliceren schaal omdat de gebruikte methode was vervelend, lang en duur. In 2002 en verder afgestemd in 2009, Cawthon voorgesteld en gedemonstreerd een nieuwe, accurate, snelle en eenvoudige PCR-gebaseerde protocol om de lengte van telomeren beoordelen en zijn rol verder te onderzoeken in de verschillende aspecten van de celbiologie, veroudering en ziekte 19. Het kiezen van de juiste telomeer meetmethode voor een studie is van essentieel belang. Momenteel zijn er verschillende methodes om telomere lengte meten, elk met zijn eigenen nadelen. Traditioneel wordt telomeerlengte gemeten middels Southern-blotanalyse van terminale restrictiefragmenten (TRF), die omvat: een. het verteren van het DNA met restrictie-enzymen die niet in telomeren herhalingen doen verlagen om TRF&#39;s te verkrijgen, b. Southern blot van deze TRF wordt gedaan door het bepalen van de gemiddelde lengte met een TRF telomere probe 14, 37. Hoewel deze werkwijze zeer nauwkeurig met een kleine variatiecoëfficiënt, is een directe maat en kan voordelig voor het meten van de distributie lengte, TRF analyse duur, arbeidsintensief en vereist minimum 3 ug DNA. Deze methode is ook ongevoelig voor korte telomeren en lengte bepaling kan worden verstoord door subtelomeric DNA, dat kan worden gedetecteerd door de probe door de (TTAGGG) n achtige sequenties Bevat 15, 42. Een andere zeer nauwkeurige methode bij het meten van de lengte van telomeren is Single telomeren Rek Lengte Analysis (STELA), een single molecule PCR-methode die vereist slechts een kleine hoeveelheid DNA. In deze werkwijze worden primers aan de G-rijke overhang herkennen eind chromosomen en te binden aan een unieke subtelomeric volgorde op een chromosoom, die de telomeer van een specifiek chromosoom versterkt. De resulterende versterking is dan gevisualiseerd door Southern Blot. Deze werkwijze heeft het voordeel dat zeer nauwkeurige en kan korte telomeren outlier sporen 16. Helaas, aangezien niet alle chromosomen G-rijke einden en een bruikbare subtelomeric sequentie telomere lengte kan alleen worden gemeten specifieke chromosomen en deze metingen niet de lengte van de telomeren in de cel 15 vertegenwoordigen. Een andere methode die is toegepast is het gebruik van Peptide Nucleic Acid (PNA) probes telomerelengte detecteren. Kwantitatieve Florescence in situ hybridisatie (Q-FISH) stelt ons in staat om telomeren visualiseren tijdens metafase, waar de staining van telomeren met een PNA probe in verhouding tot hun grootte maakt de vergelijking van telomeren tussen specifieke chromosomen. Deze methode kan ook worden toegepast op cellen in interfase, hier de telomere lengte afzonderlijke chromosomen kan niet worden gedetecteerd, waardoor een beperking introduceert bij het ​​meten telomere lengte verouderend of zelden delende cellen 17. Flow FISH plaats daarvan maakt gebruik van flowcytometrie en is momenteel de meest gevoelige methode voor het meten van de lengte van telomeren van bloedcellen in de klinische setting, maar vereist hoogopgeleide technici 18. Momenteel is de standaard methode voor het meten van de gemiddelde lengte van telomeren in ons laboratorium maakt gebruik van de precisie, gevoeligheid, en het gemak van kwantitatieve real-time PCR. Deze methode is mogelijk voor het meten van de lengte van telomeren door de ontwikkeling van nieuwe primers die de synthese van primer-dimeer afgeleide producten, die anders zou in zo geproduceerd vermijdentandaard assay vanwege de herhalende karakter van de telomeren. Voor deze test wordt de meting van de lengte van telomeren vertegenwoordigd door de T / S-ratio, de telomeer repeat aantal kopieën aan single-copy gen nummer. Aangezien er een direct evenredig verband tussen de telomere lengte en het aantal telomere gemerkte primers binden aan het DNA tijdens de beginstadia van PCR, de T / S-verhouding is recht evenredig met de lengte van telomeren. De T / S-ratio wordt gemeten door het verschil in Ct vergelijken, het fractionele cyclus nummer waarop het monster is opgebouwd bloei een drempel overschrijdt die is meerdere standaarddeviaties boven de basislijn bloei, tussen monsters met telomeren primers en SCG primers 19. Deze methode is bekritiseerd voor zijn indirecte meting van de lengte van telomeren, wat kan leiden tot onnauwkeurige metingen, bijvoorbeeld in het geval van chromosoom duplicaties of copy number variations 15. Ook vergelijking van studies vaak difficult, maar standaard oligomeren zijn ontwikkeld om absolute telomerelengte 20 meten. Deze methode werd bevorderd op door Cawthon verbeterd, met behulp van een monochroom multiplex qPCR assay. In deze test werd de PCR uitgevoerd bij lagere temperaturen voor de eerste paar cycli primer-dimeer binding voorkomen en telomeer en controle-gen werden geanalyseerd in dezelfde PCR buis fout verder voorkomen. De verkregen telomere lengte metingen sterk gecorreleerd met telomere lengte, gemeten door Southern blot analyse van TRF en hadden hogere nauwkeurigheid 15, 19, 36. Momenteel qRT-PCR de enige geschikte methode voor het testen van grote aantallen individuen en vereist slechts een kleine hoeveelheid van DNA uit te voeren. Een cruciaal onderdeel van deze methode is uitgebreide kwaliteitscontrole maatregelen, zodat wanneer het goed is gedaan, kan deze methode waardevolle vergelijkende informatie over de lengte van telomeren bieden. Bovendien was deze methode aangepast voor gebruik buiten leukocyten voor het metentelomere length in verschillende weefsels 42. Bovendien, om verder inzicht in de biologie achter telomerelengte onderhoud en interacties tussen de twee tegengestelde effecten (effecten telomere verkorting tijdens replicatie en elongatie door telomerase enzym), we vergezeld de telomere lengte methode een extra test die telomerase-activiteit meet. Hiervoor gebruikten we een telomere Repeat Amplification Protocol, een in vitro assay. Kort gelyseerd, conserven, enzymatisch actieve cellen gesynthetiseerd telomeer herhalingen op een ondergrond met oligonucleotide telomerase, en de producten werden geamplificeerd met behulp van PCR in de aanwezigheid van SYBR Green. De resultaten werden vervolgens geanalyseerd door het vergelijken van monster en controle-Ct drempelwaarden. Omdat telomerase is een warmtegevoelig enzym, wordt een extra warmte behandelde controle uitgevoerd langs elk monster 21. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Terwijl het meten van de lengte van telomeren kan waardevol inzicht geven in de mogelijke rol van de lengte van telomeren in de pathofysiologie van veroudering en ziekte, de lengte van telomeren is geen statische eigenschap en meer informatie is nodig om telomeer functie te begrijpen. Telomerase-activiteit studies kan informatie over de lengte van telomeren regelmechanismen voegen. Bijvoorbeeld kan de gecontroleerde activering van telomerase telomere lengte celproliferatie handhaven doch ongecontroleerde activering van telomerase kan resulteren in kanker. Deze twee goedkope en ongecompliceerd methoden gecombineerd voorzag ons niet alleen met een sterker bewijs in de richting van een verband tussen de lengte van telomeren en mobiele stabiliteit, maar ook verder inzicht in de mogelijke mechanismen van telomeerverkorting en herstel. Met deze methoden hopen we de reactie van de cel om veroudering en verschillende staten van celproliferatie verder te ontrafelen met het uiteindelijke doel van een beter begrip van de centrale mechanistischms van celbiologie.

<table><tbody><tr><td>Quantitative Telomerase Detection </td><td>Allied Biotech</td><td>MT3012</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, Klaar-voor-gebruik hot start reactiemix voor SYBR Green I-gebaseerde real-time PCR met behulp van het LightCycler 480-instrument</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4707516</td><td></td></tr></tbody></table>

lengte van telomeren en telomerase activiteit; een yin en yang van celsenescentie

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Telomeren zijn DNA-sequenties herhaald aan het uiteinde uiteinden van de chromosomen die zijn divers in lengte en bij de mens kan een lengte van 15.000 baseparen bereiken. De telomeer dient als een bioprotectieve mechanisme van chromosoom attritie bij elke celdeling. Bij een bepaalde lengte, telomeren te kort om replicatie, een proces dat kan leiden tot chromosomale instabiliteit of celdood mogelijk. Lengte van telomeren wordt gereguleerd door twee tegengestelde mechanismen: verloop en rek. Natuurlijk verloop gebeurt als elke cel deelt. Daarentegen rek gedeeltelijk gemoduleerd door het enzym telomerase, die herhalende sequenties draagt ​​aan de uiteinden van de chromosomen. Op deze manier kan telomerase eventueel omkeren van een vergrijzing van de regeling en verjongt levensvatbaarheid van de cellen. Zijn cruciale elementen in het handhaven cel levensduur en worden gebruikt om cellulaire veroudering beoordelen. In dit manuscript zullen we een nauwkeurige, korte, verfijnd en goedkope methode om de lengte van telomeren beoordelen in meerdere weefsels te beschrijvens en soorten. Deze methode maakt gebruik van twee belangrijke elementen, de tandem herhaling van de telomere sequentie en de gevoeligheid van de qRT-PCR van differentiële kopie aantal geteste monsters te detecteren. Daarnaast zullen we een eenvoudige test om telomerase activiteit uitoefent als aanvullend backbone test telomeren beschrijven.

Een voorbeeld van een telomere lengte qRT-PCR wordt getoond in figuur 1. Links bovenpaneel voorziene monsters in rood en groen geven de plaats van de geteste onderwerpen de 96-well plaat. Op de bovenste rechter paneel, wordt de amplificatiecurve aangetoond. Elk vak wordt getest door twee assays (Telomere en Single Copy Gene), dat wordt uitgevoerd in drievoud. Vanwege de verschillende kopie aantallen DNA geproduceerd in de twee analyses van geselecteerde personen, het aantal cycli totdat de fluorescentie...

Een nauwkeurige, korte, verfijnd en goedkope methode wordt beschreven dat beoordeelt lengte van telomeren in meerdere weefsels en diersoorten met behulp van qRT-PCR. Daarnaast zullen we een eenvoudige test om telomerase activiteit uitoefent als aanvullend backbone test telomeren beschrijven.

Lengte van telomeren en telomerase activiteit; Een Yin en Yang van celsenescentie

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Het algemene doel van deze procedure is om een korte, nauwkeurige en goedkope methode te bieden voor het bepalen van de telomeerlengte en de telomeeractiviteit in meerdere weefsels en soorten. Dit wordt bereikt door eerst genomisch DNA te isoleren voor de bepaling van de telomeerlengte met behulp van kwantitatieve real-time PCR. De tweede stap is het isoleren en lyseren van cellen uit hetzelfde weefsel in een buffer die de telomerasefunctie behoudt, om vervolgens de telomerase kwantitatief te meten met behulp van real-time PCR.Uiteindelijk worden zowel de bepaling van de telomeerlengte als de detectie van telomerase-activiteit gebruikt om de relaties tussen telomeerlengte en cellulaire senescentie, mogelijke mechanismen van telomeerverkorting en herstelreacties op veroudering en toestanden van celproliferatie te onderzoeken. Ik maakte voor het eerst kennis met deze methoden toen ik op zoek was naar een snelle en eenvoudige manier om telomeerlengtes en telomerase-activiteit te meten. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose van ouderdomsgerelateerde ziekten en vroegtijdige dood, omdat het rapporteert over de celstatus, wat een weerspiegeling is van de conditie van organen en de algehele lichamelijke gesteldheid.Deze procedure zal worden gedemonstreerd door dhr. Ur Bogo, een technicus in mijn laboratorium. Begin deze procedure door DNA uit het bloed van het subject te isoleren met de Qiagen DNE-kit, die in de laatste stap specifiek is geformuleerd voor bloedbronnen. Elueer het DNA in PCR-waardig water en meet de concentratie met een spectrophotometer.Bereid vervolgens de voorraad-PCR-primers voor zoals beschreven door OC Callahan et al voor het single copy gene of SCG-controle en voor de telomeren door deze te verdunnen tot 100 picomoles per microliter. Terwijl de primers rehydrateren, bereidt u met PCR-water seriële verdunningen van het geïsoleerde DNA. Begin met het verdunnen van het voorraad-DNA met PCR-water tot een maximale concentratie van 6,1 nanogram per microliter voor telomeer-reacties en 1,8 nanogram per microliter.Laat voor SCG-reacties de verdunning minimaal 15 minuten staan voordat u doorgaat naar de volgende. Bereid na 15 minuten de volgende verdunning voor volgens de hier getoonde tabel. Herhaal dit voor elke vermelde verdunning.Stel vervolgens de PCR-reacties op in een standaard PCR-plaat. Elk monster, samen met de SCG-controles, wordt in triplikaat uitgevoerd. Voeg eerst zes µL PCR-water toe aan elke put en voeg daarna 10 µL van het cyber green-reactiemengsel toe.Voeg vervolgens de primers in de hier getoonde hoeveelheden toe aan de respectieve wells. Verdun daarna een aliquot van elke primerstock tienvoudig met PCR-water, zodat de uiteindelijke concentratie 10 picomoles per microliter is. Voeg tenslotte twee microliter van het serieel verdunde DNA toe aan de respectieve wells en dek de plaat af met een adhesieve plastic vel om de inhoud af te sluiten.Plaats de plaat vervolgens in het real-time PCR-apparaat. Stel daarna een programma in op de Roche four 80 light cycler, beginnend met een denaturatiestap van 10 minuten bij 95 °C, gevolgd door cycli van 95 °C gedurende 10 seconden, 60 °C gedurende vijf seconden en 72 °C gedurende 11 seconden.Voer voor in totaal 50 cycli na elke cyclus cyber green-metingen uit. Start vervolgens het programma zodra de thermocycler klaar is. Stel de CT-lijn in aan het begin van de exponentiële curve en noteer de cycluswaarden op het moment dat elk monster de drempellijn overschrijdt.Bereken vervolgens de ratio van de cyclusaantallen tussen de telomeer- en de single-copy-genmonsters. Omdat het telomeer meerdere regio's heeft die in elke cyclus zullen amplificeren, zullen de CT-waarden van het telomeer lager zijn dan die van het single-copy-gen, wat resulteert in een ratio van minder dan één. Bereken tot slot de telomeerlengte op basis van het werk van Terry et al., waarbij één telomeer per single-copy-gen ratio-eenheid gelijkstaat aan een gemiddelde telomeerlengte van 4.270.Voor het meten van de telomerase-activiteit in leukocyten wordt de kwantitatieve telomerase-detectie van Allied Biotech gebruikt. Begin de metingen door 10⁵ tot 10⁶ perifere bloedcellen te verzamelen en deze te spoelen in PBS. Pelleteer ze vervolgens bij 500 ×g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet daarna in 200 µL van de 1x lysisbuffer uit de assaykit en incubeer dit gedurende 30 minuten op ijs.Centrifugeer na incubatie de monsters gedurende 30 minuten bij 12.000 ×g bij 4 °C. Om het celdebris te pelletteren, brengt u 160 µL van het resulterende supernatant over in een nieuw buisje en vriest u het overgebleven supernatant snel in in een bad van ethanol en droogijs voordat u dit bewaart bij -80 °C voor herhaald gebruik. Bepaal vervolgens de proteïneconcentratie van het supernatant met een standaard BCA-assay.Bereken voor elk verzamelde monster de hoeveelheid eiwit die nodig is voor de assay, op basis van het werkbereik van de telomerase-kit. Aangezien telomerase een hittegevoelig enzym is, moet de helft van elk monster hitte-inactiveren voor gebruik als negatieve controle door incubatie bij 85 °C gedurende 10 minuten. Bereid vervolgens de kwantitatieve standaardcurve door seriële verdunning van de stockoplossing.Verdun de voorraadoplossing van TSR-oligonucleotiden vijf keer in een verdunning van één op vijf met lysisbuffer. TSR-oligonucleotiden hebben een identieke sequentie als telomeer-primers en hebben een bekende concentratie. Stel vervolgens de mastermix samen, bestaande uit 12,5 µL van de twee x kwantitatieve telomerase-detectie premix en 11,5 µL PCR-waardig water per monster, en meng deze.Pipetteer vervolgens 24 µL van de mastermix in elke gebruikte buis. Zodra de mastermix is verdeeld, voegt u één µL van elk template toe aan de wells, bestaande uit ofwel de standaard, een hittegeactiveerd monster of een regulier monster. Seal de plaat vervolgens met een adhesieve plastic folie en meng de monsters door middel van vortexen.Plaats ze vervolgens in het real-time PCR-detectiesysteem. Stel het PCR-programma zo in dat het begint bij 25 °C voor 20 minuten. Gedurende deze tijd zal de telomerase-reactie plaatsvinden.Volg dit met 95 °C gedurende 10 minuten voor de initiële PCR-activatiestap. Voer vervolgens 40 cycli uit van 95 °C gedurende 30 seconden, 60 °C gedurende 30 seconden en 72 °C gedurende 30 seconden om de telomeermodellen te amplificeren die tijdens de 20 minuten bij 25 °C zijn toegevoegd.Voer slutтельно het programma uit en verzamel de drempelcycluswaarden voor elk monster. Genereer vervolgens een standaardcurve met behulp van de CT-waarden en gebruik deze om de telomerase-activiteit te berekenen in de getoonde monsters.Hier zijn de realtime PCR-resultaten van een 65-jarige proefpersoon. Het telomeergene, weergegeven door de helderrode lijnen, bereikt zijn exponentiële curve na ongeveer 27 cycli. De tweede set lijnen representeert de amplificatie van het single-copy gen, dat slechts één kopie in het genoom heeft en daarom minder kopieën heeft dan de telomeermonsters die door de rode lijnen worden weergegeven.Daarnaast bereikt het single-copy gen zijn exponentiële curve na ongeveer 31 cycli. De bruine lijnen stellen de standaardcurve voor, gebaseerd op een seriële verdunning van bekende monsterconcentraties. De standaardcurve voor de logaritme van de concentratie versus de drempelwaarden wordt hier weergegeven.Een rechte lijn bevestigt dat de seriële verdunning nauwkeurig is gemeten en geladen. De resultaten van de real-time PCR-analyse worden vervolgens gebruikt om de telomeerlengte te schatten. Eén eenheid van de ratio tussen telomeer en enkelvoudige genkopie is gelijk aan een gemiddelde telomeerlengte van 4, 270 baseparen in leukocyten; uit deze gegevens volgt een ratio van 0,87, wat overeenkomt met een gemiddelde van 3, 715 baseparen en een gemiddelde lengte is voor iemand van deze leeftijd.Met behulp van de resultaten van de kwantitatieve real-time PCR-assays kan de relatie tussen de telomeeractiviteit en de ratio tussen het aantal telomeer- en enkelvoudige genkopieën worden verduidelijkt. Deze grafiek laat een sterk verband tussen de twee assays zien. Na de ontwikkeling van deze techniek konden onderzoekers op het gebied van veroudering celveroudering bestuderen in modelorganismen, patiëntenpopulaties en orgaansystemen.

telomere-length-telomerase-activity-yin-yang-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Telomerase wordt tot expressie gebracht in de neonatale hersenen en ook in verschillende regio's van de volwassen hersenen. We presenteren een niet-toxische, tijdbesparende TRAP-assay voor de analyse van telomerase-activiteit in verschillende regio's van de muizenhersenen en voor het detecteren van verschillen in telomerase-activiteit tussen mannelijke en vrouwelijke muizenhersenen.

Telomerase activiteit in de verschillende regio&#39;s van de hersenen van muizen: Non-Radioactive Telomerase Herhaal Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomeren en telomerase spelen essentiële rollen bij veroudering en tumorigenese. Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe je twee muis-induceerbare telomerase knock-in allelen kunt genereren en hoe je ze kunt gebruiken in de studies van weefseldegeneratie/regeneratie en kanker.

Gebruik makend van Muriene Induceerbaar Telomerase Allelen in de Studies van weefseldegeneratie / Regeneration en Kanker

In dit artikel wordt een gedetailleerd protocol voor het kwantificeren van telomere lengte met behulp van een gewijzigde terminal restrictie fragment analyse besproken die snelle en efficiënte directe meting van telomere lengte biedt. Deze techniek kan toegepast worden op een verscheidenheid aan celbronnen van DNA voor het kwantificeren van telomere lengte.

Aangepaste Terminal Restriction Fragment Analyse voor het kwantificeren van telomere lengte met behulp van in-gel hybridisatie

Hier beschrijven we in detail het protocol voor het kwantificeren van de telomeerlengte met behulp van niet-radioactieve chemiluminescente detectie, met een focus op de optimalisatie van verschillende prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetestkit, zoals bufferhoeveelheden en sondeconcentraties.

Optimalisatie van prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetest

Hier presenteren we een protocol voor het meten van de relatieve telomeerlengte (TL) met behulp van de monochrome multiplex kwantitatieve polymerasekettingreactie (MMqPCR) assay. De MMqPCR-test is een herhaalbare, efficiënte en kosteneffectieve methode voor het meten van TL uit menselijk DNA in populatiestudies.

Monochrome Multiplex kwantitatieve PCR-telomeerlengtemeting 

Inspanningen om de katalytische subeenheid van telomerase isoleren, tert, in voldoende hoeveelheden voor structurele studies, is voldaan met beperkt succes voor meer dan een decennium. Hier presenteren we methoden voor de isolatie van het recombinante Tribolium castaneum TERT...

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

De ECIS / Taxi-systeem is een geautomatiseerde, real-time test die cellulaire chemotaxis meet. In deze assay cellen bewegen onder een laag van agarose om tot een doel elektrode. Cellulaire beweging wordt gemeten door het optreden van resistentie tegen wisselstroom 0.

Meting van Cellulaire Chemotaxis met ECIS / Taxis

Vaak gebruikt, zijn zeer toegankelijk methoden voor de behandeling van cel migratie en invasie in vitro beschreven. De eerste methode is de cel wondsluiting assay die celmotiliteit meet. De tweede methode is de transwell migratie en invasie assay die de chemotactische en invasieve vermogen van cellen beoordeelt.

In vitro cel-migratie en invasie assays

DNA-methylatie is in staat om stabiele niveaus van genregulatie te handhaven, evenals dynamische veranderingen in genregulatie mogelijk te maken als reactie op verschillende stimuli. We beschrijven technieken die het mogelijk maken om gen-specifieke veranderingen in DNA-methylatie en de invloed van deze veranderingen op genregulatie te bestuderen.

Correleren Gen-specifieke DNA-methylatie Wijzigingen met Expression en transcriptionele activiteit van de astrocyten<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Leer een kosteneffectieve qRT-PCR-methode om telomeerlengte en telomerase-activiteit te meten in meerdere weefsels. Deze techniek helpt onderzoekers bij het bestuderen van celveroudering en leeftijdsgerelateerde ziekten.

Lengte van telomeren en telomerase activiteit; Een Yin en Yang van celsenescentie

Meer video's verkennen