Monitoring Dendritische cel-migratie met behulp van

Het algemene doel van het volgende experiment is om de migratie van dendritische cellen naar de drainerende lymfeklier te visualiseren met behulp van niet-invasieve fluor-magnetische resonantie-imaging (MRI) in combinatie met conventionele protonen-MRI. Dit wordt bereikt door eerst dendritische cellen uit het murine beenmerg te prepareren en de volledig gedifferentieerde cellen te labelen met fluorrijke partikels. Tijdens de tweede stap worden de met fluor gelabelde cellen intracutaan toegediend in de achterpoten van een muis, om de efficiënte transmigratie van de toegediende cellen te waarborgen.

Vervolgens wordt het anatomische interessegebied in beeld gebracht met fluor- en proton-MRI, om de migratie van de dendritische cellen van de huid naar de drainerende lymfeklieren te monitoren. Uiteindelijk kan de migratie van dendritische cellen van de applicatieplaats naar de drainerende lymfeklier worden gevisualiseerd met fluor-MRI. Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van andere celtrackingsmethoden, zoals die waarbij ijzeroxide-nanodeeltjes vereist zijn, is dat koolstofgebonden fluor vrijwel afwezig is in alle levende organismen.

Dit levert volledig achtergrondvrije beelden en een volledige celselectiviteit op na het in vivo toepassen van fluoride-gelabelde cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van de immunologie, zoals wat de invloed is van moleculaire kandidaten op de migratie van dendritische cellen in vivo. De methode wordt gedemonstreerd door technicus Yulia Kovski en Helma VIIs, een senior wetenschapper uit mijn laboratorium, op dag 10 van de beenmerg-dendritische celcultuur.

Activeer de dendritische cellen met LPS gedurende 24 uur. Label de dendritische cellen tijdens deze periode tevens met één millimolaire fluorrijke perfluor-15-kroon-5-etherdeeltjes; om te bevestigen dat de dendritische cellen succesvol zijn gelabeld, worden de fysisch-chemische eigenschappen van de cellen gecontroleerd met behulp van flowcytometrie. De met fluor gelabelde cellen worden hier weergegeven als rode events op de forward- en sideward scatter plot, en de niet-gelabelde cellen worden weergegeven als blauwe events.

Plaats vervolgens een C 57 black six-muis in een houder en vul daarna een tuberculinespuit van 0,5 milliliter, voorzien van een naald van 26,5 gauge, met fluorescentielabelled dendritische cellen in een volume van 50 tot 100 µL. Voer de naald nu voorzichtig in de bovenste huidlagen van elk achterpootje van het dier in om de cellen intracutaan toe te dienen. Plaats het dier na het anesthetiseren in buikligging op het muisbed van de MRI-scanner voor kleine dieren.

Nadat het dier op de beeldhouder is vastgezet en de verbindingen met het monitoringsysteem zijn gemaakt, verplaatst u de houder naar het midden van de proton-fluor RF-spoel om de juiste positionering van het dier en de scanner te bevestigen. Dit dient tevens voor de latere planning van de geometrie van de beeldplakken. Neem scout-beelden op in drie standaardoriëntaties met behulp van snelle beeldacquisitiemethoden met een lage resolutie in de software van de MR-scanner.

Stel de RF-spoel af op de protonresonantiefrequentie en op de fluorresonantiefrequentie. Gebruik de afstemmonitor van de MR-scanner voor dieren om de karakteristieke impedantie van de spoel af te stemmen op 50 ohm. Stel vervolgens de benodigde automatische systeeminstellingen in, waaronder shimming om de homogeniteit van het magnetisch veld te optimaliseren, systeemfrequentieaanpassingen om de RF af te stemmen op de specifieke LA-frequentie van het MR-systeem voor protonen en de referentieversterking.

Om de RF-amplitude aan te passen, stelt u een turbo rare 3D-protocol in voor de protonscan, met een TR van 1500 milliseconden en TE van 53 milliseconden, een matrix van 400 bij 200 bij 200 en een rare-factor van 16. Pas het gezichtsveld aan met behulp van de scout-beelden. Start vervolgens de scan.

Laad een enkelpuls FID-sequentie met een TR van ten minste 1000 milliseconden, open vervolgens de scanbewerking en stel de kern in op fluor in de bewerkingsmethode van de toolbox. Deselecteer de automatische referentieversterking via de go setup. Start de meting zonder de gegevens op te nemen om een MR-signaal in realtime weer te geven.

Pas de basisfrequentie aan om de fluor-spectrale piek op nul hertz in het acquisitievenster te centreren. Selecteer vervolgens 'apply basic frequency' en druk op 'stop now'. Clone het turbo rare 3D-protocol van de vorige protonscan.

Ga naar 'edit method' en deselecteer vervolgens de automatische referentieversterking, zoals zojuist getoond in 'edit scan'. Stel de fluor-kern in en wijzig vervolgens de matrix naar 1 28 bij 64 bij 64 en de 'rare factor' naar ten minste 40. Wanneer de scans zijn voltooid, trek je de muishouder terug uit de MR-scanner en gebruik je het weergavemenu om de fluor-beelden over de protonenbeelden heen te leggen.

Na het opofferen van de muis verwijdert u de poplitiale lymfeklier van belang en plaatst u deze in een NMR-buis van vijf millimeter die 100 µL 2% PFA bevat. Plaats de buis vervolgens in een fluor-spectroscopiespoel en beweeg de spoel naar het ISO-centrum van de magneet. Stem de RF-spoel af op de resonantiefrequentie van fluor en stem vervolgens, via de afstemmonitor van de dier-MR-scanner, de karakteristieke impedantie van de spoel af op 50 ohm binnen de shimming-toolbox.

Zet alle shim-parameters op nul en druk op toepassen. Laad vervolgens een single pulse FID-sequentie met een TR van ten minste 1000 milliseconden. Open edit scan en stel de kern in op fluor.

Start nu de sequentie met go setup, stel de basisfrequentie zo in dat de fluor-spectrale piek zich in het midden van het acquisitievenster op nul hertz bevindt en pas de basisfrequentie toe. Pas vervolgens de pulsattenuator opnieuw aan om het signaal te maximaliseren om een excitatie van 90 graden te bereiken. Druk op stop zodra het signaal maximaal is.

Stel slutतः in de bewerkingsmethode de gemiddelden in tussen 64 en 256, afhankelijk van het signaal, en gebruik vervolgens de optie 'go pipeline'. Start de acquisitie 18 tot 21 uur na intracutane applicatie. Fluoride-gelabelde dendritische cellen migreren naar de drainerende popliteale lymfeknoop.

De beweging van de dendritische cellen via de lymfegangen naar de drainerende pubale lymfeklier kan worden waargenomen door de proton anatomische beelden over de fluor dendritische cellen te leggen. Op de beelden worden de dendritische cellen weergegeven als een fluor MR-signaal in rood, terwijl de lymfeklieren en lymfegangen in grijstinten worden getoond in het proton anatomische MR-beeld. Om de mate van migratie van dendritische cellen naar de drainerende lymfeklieren te kwantificeren, worden de lymfeklieren geëxtraheerd en wordt fluor MRS uitgevoerd zoals zojuist gedemonstreerd; wanneer het fluor-signaal verkregen uit elke lymfeklier wordt vergeleken met het fluor-signaal verkregen uit verschillende aantallen dendritische cellen gelabeld met perfluoro 15-kroon-5-etherdeeltjes, zoals geïllustreerd door deze kalibratiecurve, kan voor dit representatieve experiment het aantal fluor-gelabelde dendritische cellen dat de drainerende lymfeklier bereikt, worden afgeleid.

Er kan worden geschat dat 7,5 × 10⁴ dendritische cellen die niet waren beladen met antigeen de linkerlymfeknoop bereikten, terwijl 3,6 × 10⁵ met antigeen beladen dendritische cellen de rechterlymfeknoop bereikten. Hoewel deze zaken inzicht kunnen bieden in de moleculaire mechanismen van immuuncelmigratie onder normale omstandigheden, kan dit ook worden toegepast in diermodellen, zoals die voor auto-immuunziekten. Bovendien strekken de implicaties van deze techniek zich uit tot het veld van de kankertherapie.

Alle geïdentificeerde moleculaire targets kunnen worden gebruikt om dendritische cellen te manipuleren voor tumortherapie.