Post-inbedding immunogold Etikettering van Synaptic eiwitten in de hippocampus slice culturen
3 april 2013
De lokalisatie en distributie van eiwitten leveren belangrijke informatie voor het begrijpen van hun cellulaire functies. De superieure ruimtelijke resolutie van elektronenmicroscopie (EM) kan worden gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van een bepaald antigeen na immunohistochemie bepalen. Voor weefsels van het centrale zenuwstelsel (CNS), behouden de structurele integriteit behoud antigeniciteit is vooral moeilijk EM studies. Hier nemen we een procedure die is gebruikt om structuren en antigenen behouden in het CZS
Het algemene doel van deze procedure is om ImmunoGold-labeling uit te voeren om de ultrastructurele lokalisatie van synaptische eiwitten in CA een parametale neuronen in de hippocampus van ratten te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst het CA een-gebied van de organotypische snede te verwijderen, de bovenhoek bij te snijden om de juiste oriëntatie te onthouden en het in een osmiumvrij fixeermiddel op ijs te incuberen. De tweede stap is om het gefixeerde weefsel te dehydrateren en het te laten harden door het met hars te infiltreren.
Vervolgens worden ultradunne secties gesneden uit weefsels die in hars zijn ingebed en ze worden op nikkelroosters geplaatst. De laatste stap is om immunohistochemie uit te voeren op de secties. Uiteindelijk wordt immuno-elektronenmicroscopie gebruikt om de lokalisatie van eiwitten in de synaps te bepalen. Oké.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van synaptische plasticiteit te beantwoorden, zoals hoe lokalisaties van eiwitten binnen dendritische stekels kunnen helpen om hun rol in synaptische functie te begrijpen. Hoewel deze methode is geoptimaliseerd voor organotypische hippocampussneden, kan het ook enorm waardevol zijn voor andere neuronale preparaten, inclusief acute herfsneden en primaire neuronale culturen. Begin deze procedure door de organotypische hippocampussnede in een polystyreen petrischaal met vers ijskoud sorensen's fosfaatbuffer te plaatsen.
Voeg een extra een tot twee milliliter ijskoud buffer direct bovenop de sneden toe. Om het CA een-subveld van de snede te isoleren, gebruik een wegwerpschraper om voorzichtig door de snede te snijden naast de dentate gyrus, die parallel loopt aan de CA een-cel laag. Snijd vervolgens de resterende snede verticaal om het CA drie-subveld en de sulu te verwijderen.
Snijd vervolgens een hoek van de CA een-snede om de bovenkant van het weefsel te identificeren en verwijder voorzichtig het weefsel van de membraan met de achterkant van de schraper. Breng het weefsel voorzichtig over in een 12-wellsplaat met ijskoud sorensen's buffer. Verwijder de buffer en voeg 0,5 tot een milliliter ijskoud fixeermiddel toe met een pH van 7,3 verdund in sorensen's buffer zodat het de monster voldoende bedekt.
Incubeer vervolgens gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Na incubatie verwijdert u het fixeermiddel uit de well en wast u de monsters drie keer gedurende 20 minuten in ijskoud sorensen's buffer. Incubeer vervolgens het monster in 1% tanninezuur gewicht per volume in 0,1 molaar malaatbuffer bij een pH van 6,0.
Na 40 minuten spoelt u het tanninezuur weg door het monster twee keer gedurende 20 minuten in de malaatbuffer te wassen. Incubeer vervolgens het monster gedurende 40 minuten in 1% urinalacetaat in malaatbuffer urinalacetaat is lichtgevoelig en is radioactief. Handel dus voorzichtig en plaats het monster in het donker bij vier graden Celsius tijdens de incubatie.
Na de incubatie spoelt u de monsters twee keer gedurende 20 minuten in ijskoud malaatbuffer, bewerk vervolgens gedurende 20 minuten in 0,5% platinachloor in gevangenebuffer. Spoel ten slotte al het resterende platinachloor weg door twee keer gedurende 20 minuten te wassen. Bewaar elke gevangenebuffer de monsters in malaatbuffer bij vier graden Celsius totdat ze klaar zijn voor verdere verwerking.
Om immunohistochemie te beginnen, worden de gefixeerde CA een-gebieden eerst gedehydrateerd, in hars ingebed en gesneden om ultradunne secties van 60 nanometer op nikkelroosters te verkrijgen, zoals beschreven in het tekstprotocol voor deze video. Plaats vervolgens een druppel van 1% tween 20 fosfaatbuffer bij een pH van 7,5 op een stuk schoon paraform. Neem vervolgens voorzichtig de rooster met schone forcepsen en laat het op de buffer drijven met de sectie naar beneden. Incubeer zo gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na incubatie, tappen van overtollig vocht uit het rooster door de sectie zijwaarts omhoog op filterpapier te plaatsen.
Verwijder ook eventuele oplossing die tussen de armen van de EM-forcepsen is gevangen door voorzichtig te wijken met een stukje filterpapier terwijl u ervoor zorgt dat de secties niet volledig uitdrogen. Plaats vervolgens een druppel van 50 millimolair glycine op het parafilm en laat de roostersectie op de glycine-oplossing drijvend bij kamertemperatuur. Terwijl het monster gedurende 15 minuten incubeert, voegt u 2,5% serum van het dier van de secundaire antilichaam toe aan een 2,5% oplossing van BSA en plaats een druppel van dit mengsel op het parafilm.
Na de incubatie van 15 minuten, droogt u het rooster met filterpapier en laat u het drijvend op de blokkeeroplossing gedurende 30 minuten. Bereid bij kamertemperatuur de incubatiekamer voor door opgerolde Kim-doekjes langs de binnenkant van een schone plastic petrischaal te plaatsen. Plaats een stuk schoon param in het midden van de petrischaal en voeg vervolgens gefilterd water toe aan de Kim-doekjes.
Plaats vervolgens een druppel van de primaire antilichaamoplossing op het paraform en laat het monster erop drijven bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius. De optimale tijd en temperatuur van incubatie evenals de antilichaamconcentratie moeten experimenteel worden bepaald. Na incubatie met het primaire antilichaam, wast u het rooster drie keer gedurende twee minuten met 1% tween 20 fosfaatbuffer. Bewerk vervolgens met secundair antilichaam met één tot 20 anti-konijn of anti-US, gekoppeld aan 10 nanometer goud na een uur.
Was bij kamertemperatuur drie keer gedurende twee minuten met 1% tween 20 fosfaatbuffer. Bewerk vervolgens het monster in gebufferde 2% glutaaraldehyde gedurende vijf minuten. Verwijder overtollig gluar-aldehyde door drie keer te spoelen met 1% tween, 20 fosfaatbuffer en vervolgens drie keer met gefilterd water, elk twee minuten spoelen.
Na het spoelen, incubeer het rooster gedurende 10 minuten in 2% urinalacetaat. Bereid tijdens de incubatie een CO2-vrije kamer voor door een stuk paraform in het midden van
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op de lokalisatie van synaptische eiwitten in piramidale neuronen van de CA1-regio van de hippocampus van ratten met behulp van ImmunoGold-labeling en elektronenmicroscopie. De procedure is erop gericht zowel de structurele integriteit als de antigeniciteit in weefsels van het centrale zenuwstelsel te behouden.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunohistochemie
Achtergrond
- Het begrijpen van de eiwitlokalisatie is cruciaal voor het ontrafelen van cellulaire functies.
- Elektronenmicroscopie biedt een superieure ruimtelijke resolutie voor het bestuderen van subcellulaire structuren.
- Het behouden van de antigeniciteit in CNS-weefsels tijdens EM-studies is uitdagend.
- Deze studie maakt gebruik van een specifieke procedure om deze uitdagingen aan te pakken.
Doel van de studie
- Om de ultrastructurele lokalisatie van synaptische eiwitten te bepalen.
- Om het begrip van synaptische functies in de hippocampus te vergroten.
- Om ImmunoGold-labeling op een nieuwe manier toe te passen voor CNS-weefsels.
Gebruikte methoden
- Verwijdering van de CA1-regio uit organotypische coupes.
- Trimmen en incuberen van het weefsel in een osmiumvrije fixatief.
- Dehydratie en harsinfiltratie van het gefixeerde weefsel.
- Snijden van ultradunne secties en uitvoeren van immunohistochemie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle preservatie van structuren en antigenen in het CZS.
- De lokalisatie van synaptische eiwitten werd effectief bepaald.
- Immunoelektronenmicroscopie bood gedetailleerde inzichten in de synaptische architectuur.
- De methodologie kan worden toegepast op verdere studies naar eiwitlokalisatie.
Conclusies
- De gehanteerde procedure is effectief voor het bestuderen van synaptische eiwitten in het CZS.
- ImmunoGold-labeling in combinatie met EM vergroot het begrip van synaptische functies.
- Deze aanpak kan toekomstig onderzoek in de neurowetenschappen faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode maakt een nauwkeurige ultrastructurele lokalisatie van synaptische eiwitten in hippocampale neuronen mogelijk, wat bijdraagt aan doelwitvalidatie bij de ontdekking van geneesmiddelen voor neurowetenschappen. Door zowel de ultrastructuur als de antigeniciteit in CZS-weefsels te behouden, levert het betrouwbare gegevens op voor mechanische risicoreductie van synaptische targets. De aanpak helpt bij het begrijpen van de eiwitdistributie binnen dendritische stekels, wat hypotheses over synaptische functie en plasticiteit informeert die relevant zijn voor neuropsychiatrische en neurodegeneratieve indicaties.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de precieze subcellulaire lokalisatie van synaptische eiwitten te bepalen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe visualisatie van de antigeenverdeling in dendritische stekels en synapsen.
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door eiwitlokalisatie te koppelen aan de synaptische architectuur en functie.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream antilichaamgebaseerde screening en target-engagementstudies.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt assay-standaardisatie mogelijk via reproduceerbare ultrastructurele preservatie en kwantitatieve distributie van gouddeeltjes.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt platformhergebruik voor diverse neuronale preparaten, waaronder acute coupes en primaire culturen.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de getrouwheid van ziekterelevante systemen door trisynaptische circuits in organotypische hippocampus-slices te preserveren.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de afstemming van translationele biomarkers door correlatie tussen eiwitlokalisatie en synaptische fenotypen mogelijk te maken.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling via ultrastructurele validatie van target-engagement in CZS-weefsel.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelwit-hypotheses tot preklinische validatie, waardoor een iteratieve verfijning van synaptische proteindoelwitten op basis van ultrastructurele gegevens mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door de lokalisatie van eiwitten binnen dendritische compartimenten vast te stellen.
- Screening: Maakt assays gereed voor gebruik via gestandaardiseerde weefselpreparatie en kwantitatieve immunogold-uitlezingen.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen, zoals genormaliseerde radiale afstand, om de eiwitdistributie tussen verschillende condities te vergelijken.
- Translational Research: Verbindt discovery met preklinische continuïteit via behouden hippocampale circuits en synaptische ultrastructuur.
- Enterprise Reuse: Creëert een herbruikbare capaciteit voor de validatie van CNS-targets in meerdere neuronale modellen en eiwitklassen.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitvalidatie door mechanistische ambiguïteit in de functie van synaptische eiwitten te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid door osmiumvrije fixatie en gestandaardiseerde immunogoudlabeling.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door ultrastructureel bewijs van doelwitinteractie te leveren in fysiologisch relevant weefsel van het centraal zenuwstelsel.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van synaptische doelwitten mogelijk op basis van gevalideerde gegevens over subcellulaire lokalisatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in elektronenmicroscopie, immunohistochemie en neuroanatomie.
- Afhankelijk van een ultramicrotoom, infrastructuur voor inbedding in hars en toegang tot een transmissie-elektronenmicroscoop.
- Vereist standaardisatie tussen de teams voor histologie, beeldvorming en data-analyse.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan verschillende neuronale preparaten en eiwitdoelen.
- Bevat praktische beperkingen zoals een lage doorvoer en gespecialiseerde hantering van uranylacetaat en loodcitraat.
