Name: Post-inbedding immunogold Etikettering van Synaptic eiwitten in de hippocampus slice culturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: Leer ImmunoGold-labeling voor ultrastucturele lokalisatie van synaptische eiwitten in rattenhippocampus met behoud van structuur en antigeniteit. Deze methode verbetert het inzicht in synaptische functies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Matthew Florence bedanken voor de voorbereiding van de hippocampus slice culturen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van US National Institute on Aging en Alzheimer&#39;s Association te NZG.

1. Bevestiging Fixatieven zijn kankerverwekkend, draag handschoenen en omgaan met de fixeermiddelen in een zuurkast. Tenzij anders vermeld, zijn alle incubaties uitgevoerd op ijs en alle oplossingen worden gefiltreerd voor gebruik. Gebruik elektronenmicroscopie-grade reagentia. Dag 1 <ol><li class="jove_content"> Na experimentele omstandigheden (bijv. virale injectie, drugsbehandeling) moet het membraan met organotypische hippocampus plakken in een 60 x 15 mm polystyreen petrischaal met ijskoude 0,1 M fosfaatbuffer (Sorensen&#39;s fosfaatbuffer), pH 7,3. Voeg 1 - 2 ml 0,1 M fosfaatbuffer direct op de plakken te houden koud. </li></ol> Cruciale stap: Gebruik altijd vers bereid buffers en fixatieven. Controleer of de pH van de buffer binnen gewenste bereik. Een niet te doen zou kunnen beschadigen cellulaire structuren. <ol start="2"><li> Om de CA1 deelgebied van de slice te isoleren, gebruik dan eenwegwerpbistouri voorzichtig dwars het segment naast de DG, evenwijdig aan de CA1 cellaag (Figuur 1). Snijd vervolgens de resterende segment verticaal om de CA3 deelgebied en de subiculum verwijderen. Snij een hoek van het segment helpen om het bovenvlak van het weefsel. </li></ol> OPMERKING: Bij geen virale afgifte van eiwit van belang wordt vereist, het gehele weefsel slice kan worden vastgezet nadat de media verwijderd met een zachte spoelen ijskoude buffer. Dit wordt dan gevolgd door het uitsnijden van de CA1. Kritische stap: Houd de bovenzijde van het weefsel zodat goede snijden van de roosters later. <ol start="3"><li> Verwijder het weefsel van het membraan met de achterkant van de scalpel. Gebruik een Pasteur pipet om het weefsel voorzichtig naar een 12-well plaat die 0,1 M fosfaatbuffer. </li><li> Verwijder de buffer in de put van de plaat en voeg 500 &amp; mu; l - 1 ml ijskoude fixatief (pH 7,3) bestaande uit: 0,1% picrinezuur, 1% paraformaldehyde en 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer. Incubeer gedurende 2 uur bij 4 ° C. </li></ol> OPMERKING: Picrinezuur kunnen explosief zijn als het droog. Houd het bevochtigd met water in een goed gesloten verpakking bewaren. Bewaar op een droge en goed geventileerde plaats bewaren. <ol start="5"><li> Verwijder het fixeermiddel uit de put en spoelmonsters 3 keer (20 min elk) in 0,1 M fosfaatbuffer. </li><li> Incubeer gedurende 40 min in 1% looizuur (w / v) in 0,1 M maleaat buffer, pH 6,0. </li><li> Twee keer spoelen (20 min elk) in maleaat buffer. </li><li> Incubeer gedurende 40 min in 1% uranylacetaat (w / v) in maleaat buffer in het donker. Uranylacetaat is gevoelig voor licht en is radioactief. Dek het bekerglas af met Parafilm bij het oplossen en Bewaar ongebruikte buffer in het donker bij 4 ° C. </li><li> Twee keer spoelen (20 min elk) in maleaat buffer. </li><li> Incubeer gedurende 20 min in 0,5% platina chlooride (w / v) in maleaat buffer. </li><li> Twee keer spoelen (20 min elk) in maleaat buffer. Bewaar de monsters bij 4 ° C tot ze klaar voor verdere verwerking. </li></ol> 2. Uitdroging en Embedding Propyleenoxide is kankerverwekkend. Vermijd dampen door te werken met het in een zuurkast. Gebruik absoluut, 100% pure ethanol, dat geen spoor van water bevat. Verdun deze absolute ethanol bij verschillende concentraties produceren voor uitdroging. Dag 2 <ol><li> Incubeer gedurende 5 min in 50% ethanol en gedurende 5 min in 70% ethanol. </li><li> Incubeer gedurende 15 min in vers bereide 1% p-fenyleendiamine (PPD) in 70% ethanol. </li><li> Driemaal spoelen in 70% ethanol. </li><li> Incubeer gedurende 5 min in 80% ethanol en gedurende 5 min in 95% ethanol. </li><li> Incubeer in 100% ethanol tweemaal 5 min elk. </li><li> Bereid glazen flacons met schroefdop en zorg ervoor dat ze schoon en helemaal droog zijn. Overdracht plakjes om glazen flesjes enbenoem elke flacon eenvoudig en duidelijk. </li><li> Incubeer gedurende 5 min in 1:1 ethanol: propyleenoxide. </li><li> Incubeer in 100% propyleenoxide tweemaal 5 min elk. </li><li> Voeg hars (Epon) aan elk flesje een 1:1 mengsel met propyleenoxide maken. Meng gedurende 2 uur. Schud de flacons te rigoureus om te bellen die kunnen interfereren met inbedding te voorkomen. </li><li> Voeg hars een 3:1 mengsel met propyleenoxide, en meng gedurende 2 uur maken. </li><li> Overdracht naar 100% hars en incubeer O / N. </li></ol> Dag 3 <ol start="12"><li> Sandwich monsters tussen stroken ACLAR plastic en genezing gedurende 24 uur bij 60 ° C. </li></ol> 3. Snijden en montage op grids Dag 4 <ol><li> Snij semi-dunne (0,5 um) secties en vlek met 1% toluidineblauw + 1% borax de juiste oriëntatie van monsters te bepalen. </li><li> Snijd ultradunne secties (60 nm) en op nikkel roosters, een sectie per grid. </li></ol>4. Immunohistochemie Alle buffers en water worden gefilterd voor gebruik. Dag 5 <ol><li> Breng een druppel (~ 50 pi) van 1% Tween-20/phosphate buffer (T / PB), pH 7,5, op een schoon stuk Parafilm op een vlakke ondergrond. Voorzichtig ophalen rooster met schone pincet door de rand en drijven op de buffer, gedeelte neer en incubeer gedurende 10 minuten bij RT. </li><li> Afvoer overtollige vloeistof uit het net door het plaatsen gedeelte boven op papierfilter en drijven op 50 mM glycine in T / PB 15 minuten bij RT. </li></ol> Cruciale stap: Om te voorkomen dat overmatig &#39;carry-over&#39; van oplossingen van de ene oplossing druppel naar het volgende tijdens de incubaties, overtollige vloeistof weglopen door voorzichtig tegen de rand van het rooster op # 1 filtreerpapier tussen elke oplossing verandering. Verwijder ook een oplossing gevangen tussen de armen van de EM pincet houdt het net door zachtjes wicking met een langgerekte strook filtreerpapier tussen de tang armen terwijl ensuring de secties hoeven niet volledig uitdrogen. <ol start="3"><li> Droog het rooster met filtreerpapier en drijven op blokkeeroplossing die 2,5% BSA en 2,5% serum van het dier van het secundaire antilichaam in T / PB gedurende 30 min bij RT. </li><li> Incuberen met primair antilichaam (in T / PB) bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. De optimale tijd en temperatuur van incubatie en antilichaamconcentratie, moet experimenteel bepaald. </li><li> Was het net drie keer (2 min elk) met T / PB. </li><li> Incuberen met secundair antilichaam (1:20 anti-konijn of anti-muis gekoppeld aan 10 nm goud) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was het residu driemaal (2 min elk) met T / PB. </li><li> Postfix met 2% glutaaraldehyde in T / PB gedurende 5 minuten. </li><li> Was driemaal (2 min elk) T / PB en vervolgens driemaal (2 min elk) met gefilterd water. </li><li> Incuberen met 2% uranylacetaat in water gedurende 10 minuten. </li></ol> Terwijl het net vlekken, bereiden een CO 2-vrije kamer door placinga stuk Parafilm in het midden van een glazen petrischaal. Leg 4-6 pellets van NaOH in de schaal rond de Parafilm om CO2 te absorberen in de lucht. Houd de top gesloten enkele minuten. Gebruik een Pasteur pipet en zo snel mogelijk een kleine hoeveelheid lood citraatoplossing Reynolds de Parafilm in de glazen petrischaal. Open de bovenste net genoeg om het Pasteur pipet te voegen aan de herintroductie van CO 2 te beperken in de kamer. OPMERKING: Om loodcitraat Reynold&#39;s oplossing te maken, 100 ml gedeïoniseerd water te koken in een magnetron en koel in een luchtdichte container te laten. In een 50 ml maatkolf met stop, mix 1,33 g loodnitraat, 1,76 g natriumcitraat en 30 ml water gekookt door schudden gedurende 1 minuut. Dan tussenpozen schudden gedurende 30 minuten. Deze troebele oplossing, voeg 8 ml 1 M natriumhydroxide en langzaam draaien de kolf enkele keren. Oplossing zal duidelijk worden. Breng de oplossing tot 50 ml met het verhitte water. Bewaar de oplossing goed afgesloten. Als neerslag ontstaat weg te gooien en een nieuwe maken. <ol start="11"><li> In drie kleinere bekers te bereiden warme, vers gekookt gedeïoniseerd water. Was de uranylacetaat door dompelen het net in de eerste beker en voorzichtig draai hem rond voor 30 sec. Herhaal deze stap in de andere twee bekers. </li><li> Open de bovenkant van de glazen petrischaal net genoeg om het raster te plaatsen op de druppel loodcitraat oplossing Reynolds. Indien mogelijk, draag een masker terwijl je dit doet om de ademhaling op loodcitraat te voorkomen en om de vorming van neerslag te voorkomen. Incubeer gedurende 10 minuten. </li><li> Open de bovenste net genoeg om het rooster te verwijderen. Vermijd inademen van de loodcitraat. Was het net drie keer door dompelen achtereenvolgens in drie bekers met warme, vers gekookt gedestilleerd water. Laat het rooster drogen op een stukje filtreerpapier, sectie omhoog. Het monster kan nu de elektronenmicroscoop. </li></ol>

<ol><li>Faulk, W. P., Taylor, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunocolloid+method+for+the+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunocolloid method for the electron microscope.</a> Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).</li>
<li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-+and+affinity+probes+for+electron+microscopy%3A+a+review+of+labeling+and+preparation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques.</a> J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).</li>
<li>Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+to+optimize+post-embedding+single+and+double+staining+for+amino+acid+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).</li>
<li>Berryman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tannic+acid+on+antigenicity+and+membrane+contrast+in+ultrastructural+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).</li>
<li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+ultracryotomy+of+CNS+tissue+for+ultrastructural+and+immunogold+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses.</a> J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).</li>
<li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructual+localization+of+lysozyme+in+human+colon+eosinophils+using+the+protein+A-gold+technique%3A+effects+of+processing+on+probe+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution.</a> J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).</li>
<li>Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+osmium-free+method+of+epon+embedment+that+preserves+both+ultrastructure+and+antigenicity+for+post-embedding+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).</li>
<li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> Embo J. 28, 3027-3039 (2009).</li>
<li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li>
<li>Zhong, L., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+targets+calmodulin+and+lowers+the+threshold+for+the+induction+of+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation.</a> PloS one. 7, e41275(2012).</li>
<li>Horisberger, M., Vauthey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelling+of+colloidal+gold+with+protein.+A+quantitative+study+using+beta-lactoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin.</a> Histochemistry. 80, 13-18 (1984).</li>
<li>Bendayan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+potential+and+versatility+of+colloidal+gold+cytochemical+labeling+for+molecular+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology.</a> Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).</li>
<li>Racz, B., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+coflin+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of coflin in dendritic spines.</a> J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).</li>
<li>Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+the+immunogold+technique+in+quantitation+of+a+soluble+protein+in+ultra-thin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).</li>
<li>Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+antigen%2C+one+gold%3F+A+quantitative+analysis+of+immunogold+labeling+of+plasma+membrane+5%27-nucleotidase+in+frozen+thin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections.</a> Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 Forthcoming.</li>
<li>Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BImmunologic+analysis+of+families+with+complement+receptor+deficiency%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon.+Rinsho%22%5BJournal%5D)">[Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency].</a> Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).</li>
<li>Kehle, T., Herzog, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+protein-gold+complexes+and+cell+surfaces%3A+a+method+for+precise+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation.</a> Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).</li>
<li>Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JR+%22Electron+Microscopy%22">Electron Microscopy</a>. 30, Second Edition, Jones and Bartlett Publishers. (1992).</li>
<li>Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rat+brain+postsynaptic+density+fraction+contains+a+homolog+of+the+Drosophila+discs-large+tumor+suppressor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein.</a> Neuron. 9, 929-942 (1992).</li>
<li>Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSD-95+is+associated+with+the+postsynaptic+density+and+not+with+the+presynaptic+membrane+at+forebrain+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses.</a> J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).</li>
<li>Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+localization+of+B-50+phosphoprotein%3A+the+%28ACTH%29-sensitive+protein+kinase+substrate+involved+in+rat+brain+polyphosphoinositide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism.</a> Brain Research. 328, 381-385 (1985).</li>
<li>Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+phosphoprotein+B-50%2FGAP-43+in+neuronal+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim.+Pol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity.</a> Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).</li>
<li>Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaunsbach%2C+AA+%22Biomedical+Electron+Microscopy+Illustrated+Methods+and+Interpretations%22">Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations</a>. , Academic Press. 383-426 (1999).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

In dit protocol hebben we aangenomen Phend en Weinberg methode voor de hersenen en het ruggenmerg weefsels om dendritische spines in rat hippocampale slice culturen te bestuderen. Dendritische spines in de hippocampus CA3-CA1 gebied zijn delicate structuren met een grote verscheidenheid aan eiwitten die een belangrijke rol spelen bij het reguleren van neuronale functies. De onderhavige methode biedt een evenwicht te bereiken verbeterde antigeniciteit met behoud van goede conservering ultrastructurele (Figuur 2A)...

<table><tbody><tr><td>60 x 15 mm polystyreen petrischaal</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Disposible scalpel</td><td>EXELINT</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Cellencultuur inserts</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>10 nm Geit-anti-konijn goud</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Neurogranin antilichaam</td><td>Millipore</td><td>AB5620</td><td></td></tr><tr><td>100% Picrinezuur</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19550</td><td></td></tr><tr><td>96% Paraformaldehyde</td><td>Acros Organics</td><td>AC41678-0030</td><td></td></tr><tr><td>25% Glutaraldehyde (EM-kwaliteit)</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetaat</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>p-Fenyleen-diamine</td><td>Sigma</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>Platinum (IV) chloride</td><td>Sigma</td><td>379840</td><td></td></tr><tr><td>Tanninezuur</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21710</td><td></td></tr></tbody></table>

post-inbedding immunogold etikettering van synaptic eiwitten in de hippocampus slice culturen

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immuno microscopie is een krachtig hulpmiddel om biologische moleculen te bestuderen op het subcellulaire niveau. Antilichamen gekoppeld aan elektron-dichte markers zoals colloïdaal goud kan onthullen de lokalisatie en distributie van specifieke antigenen in verschillende weefsels 1. De twee meest gebruikte technieken zijn pre-embedding en na inbedding technieken. In pre-embedding immunogoud-elektronenmicroscopie (EM) techniek, moet het weefsel worden gepermeabiliseerd om antilichaam kan binnendringen voordat het wordt ingebed. Deze technieken zijn ideaal voor het bewaren van organen, maar slechte penetratie van het antilichaam (vaak alleen de eerste paar micrometer) een aanzienlijk nadeel 2. De post-embedding labeling methoden kunnen voorkomen dat dit probleem, omdat de etikettering vindt plaats op delen van vaste weefsels waar antigenen zijn gemakkelijker toegankelijk. Over de jaren zijn een aantal wijzigingen verbeterde de post-embedding methoden immunoreactiviteit verbeteren en ultrastructuur behouden <sup&gt; 3-5. Tissue fixatie is een cruciaal onderdeel van EM studies. Fixatieven chemisch verknopen de macromoleculen om het weefsel structuren te vergrendelen. De keuze van fixatief beïnvloedt niet alleen structurele conservering maar ook antigeniciteit en contrast. Osmiumtetroxide (OSO 4), formaldehyde en glutaaraldehyde zijn de standaard fixatieven decennia, met inbegrip van het centrale zenuwstelsel (CNS) weefsels die vooral gevoelig voor structurele schade tijdens chemische of fysische bewerkingen. Helaas OSO 4 is zeer reactief en is aangetoond dat maskeren antigenen 6, resulterend in slechte en onvoldoende labeling. Alternatieve benaderingen van chemische fixatie te vermijden onder meer het bevriezen van de weefsels. Maar deze technieken zijn moeilijk en vereisen dure apparatuur. Om sommige van deze problemen aan te pakken en CZS etikettering Phend et al. verbeteren. vervangen OSO 4 met uranylacetaat (UA) en tannine acid (TA), en met succes bijkomende wijzigingen van de gevoeligheid van antigeen en structurele conservering hersenen en ruggenmerg weefsels 7 verbeteren. We hebben deze osmium-vrij na inbedding methode om ratten hersenweefsel en geoptimaliseerd de immunogoud etikettering techniek voor het opsporen en bestuderen synaptische eiwitten. We presenteren hier een methode om de ultrastructurele lokalisatie van synaptische eiwitten in rat hippocampale CA1 pyramidale neuronen te bepalen. We maken gebruik van organotypische hippocampus gekweekte plakjes. Deze schijfjes handhaven van de trisynaptic circuit van de hippocampus, en zijn dus vooral handig voor het bestuderen van synaptische plasticiteit, een mechanisme in brede kring te leren en geheugen ten grondslag liggen. Organotypische hippocampale plakken van postnatale dag 5 en 6 muizen / ratten worden bereid zoals eerder beschreven 8 en zijn bijzonder nuttig om acute knockdown of overexpressie exogene eiwitten. We hebben eerder gebruikt dit protocol om characterize neurogranin (Ng), een neuron-specifiek eiwit een kritische rol in het reguleren synaptische functie 8,9. We hebben ook gebruikt om de lokalisatie van ultrastructurele calmoduline (CaM) en Ca 2 + / CaM-afhankelijke proteïne kinase II (CaMKII) 10 karakteriseren. Zoals weergegeven in de resultaten, dit protocol zorgt voor een goede ultrastructurele behoud van dendritische spines en efficiëntie-etikettering van Ng te helpen karakteriseren te verspreiden over de rug 8. Bovendien is de hier beschreven procedure kan brede toepasbaarheid hebben bij het bestuderen van vele andere eiwitten betrokken bij neuronale functies.

Figuur 2B toont een voorbeeld van de verdeling van de endogene moleculen in Ng dendritische uitsteeksels van hippocampale CA1 pyramidale neuronen. Nikkel roosters met ultradunne (60 nm) weefsels die CA1 gebied van de hippocampus (zoals weergegeven in figuur 2A) werden bedekt met 1% T / PB, 50 mM glycine, vervolgens geblokkeerd met 2,5% BSA en 2,5% serum voorafgaand aan incubatie met anti Ng-antilichaam. Na wassen met T / PB werden grids vervolgens bedekt met anti-konijn secundair antili...

De lokalisatie en distributie van eiwitten leveren belangrijke informatie voor het begrijpen van hun cellulaire functies. De superieure ruimtelijke resolutie van elektronenmicroscopie (EM) kan worden gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van een bepaald antigeen na immunohistochemie bepalen. Voor weefsels van het centrale zenuwstelsel (CNS), behouden de structurele integriteit behoud antigeniciteit is vooral moeilijk EM studies. Hier nemen we een procedure die is gebruikt om structuren en antigenen behouden in het CZS te bestuderen en synaptische eiwitten karakteriseren rat hippocampale CA1 pyramidale neuronen.

Post-inbedding immunogold Etikettering van Synaptic eiwitten in de hippocampus slice culturen

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Het algemene doel van deze procedure is om ImmunoGold-labeling uit te voeren om de ultrastructurele lokalisatie van synaptische eiwitten in pyramidale neuronen van de CA1-regio in de hippocampus van ratten te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de CA1-regio van de organotypische slice te verwijderen, de bovenhoek af te knippen om de juiste oriëntatie te onthouden en deze op ijs te incuberen in een osmiumvrij fixeermiddel. De tweede stap is om het gefixeerde weefsel te dehydreren en te laten uitharden door het te infiltreren met hars.Vervolgens worden ultradunne coupes gesneden uit in hars ingebed weefsel, die vervolgens op nikkelnetjes worden geplaatst. De laatste stap is het uitvoeren van immunohistochemie op de weefselcoupes. Uiteindelijk wordt immuno-elektronenmicroscopie gebruikt om de lokalisatie van eiwitten in de synaps te bepalen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de synaptische plasticiteit, zoals de vraag hoe de lokalisatie van eiwitten binnen dendritische stekels kan bijdragen aan het begrip van hun rol in de synaptische functie. Hoewel deze methode is geoptimaliseerd voor organotypische hippocampuscoupes, kan deze ook

post-embedding-immunogold-labeling-synaptic-proteins-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit rapport toont een techniek voor mechanische isolatie van individuele levensvatbare neuronen te behouden bevestigd presynaptische boutons. Vibrodissociated neuronen hebben de voordelen van een snelle productie, een uitstekende farmacologische controle en een betere ruimte-clamp zonder invloed van naburige cellen. Deze methode kan gebruikt worden voor beeldvorming van synaptische elementen en patch-clamp opname.

Vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren Brain Slices synaptische transmissie en Image presynaptische Terminals Study

This video demonstrates the procedure for staining fixed rat brain slices containing biocytin-filled interneurons. The protocol includes incubation with avidin-biotin complex (ABC), staining with HRP and chromogenic substrate, preserving structures with osmium tetroxide, and embedding the tissue in resin for imaging.

Labeling of Biocytin-Filled Interneurons in Rat Hippocampal Slices for Visualization

Source: Schönherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

Source: McLeod, F., et al. Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates a method for visualizing synaptic markers in hippocampal brain slices using confocal immunofluorescence analysis. The slices are immunostained with primary antibodies targeting presynaptic and postsynaptic markers, followed by fluorophore-conjugated secondary antibodies. The labeled markers are then visualized using confocal microscopy to evaluate the synaptic...

Microscopic Analysis of Synapses in Mouse Hippocampal Slices Using Immunofluorescence

We geven een gedetailleerd protocol voor inductie van lange termijn potentiëring van de CA1 regio van de hippocampus en de daaropvolgende isolatie van nucleaire verrijkte fracties uit de tetanized gebied van het segment. Deze benadering kan worden gebruikt om activiteit te bepalen afhankelijk kerneiwit invoer cellulaire modellen van leren en geheugen.

Isolatie van CA1 Nuclear verrijkte fracties van hippocampus Slices om te studeren activiteit-afhankelijke nucleaire import van Synapto-nucleaire Messenger Eiwitten

Deze video-artikel beschrijft experimentele procedures om langetermijnplasticiteit en de daarmee geassocieerde processen zoals synaptische tagging, capture en cross-tagging in de CA1-piramideneuronen te bestuderen met behulp van acute hippocampus-sneden van knaagdieren.

Onderzoek van Synaptic Tagging / Capture en Cross-capture met Acute hippocampus Plakjes van Knaagdieren

De postembedding immunogold-methode is een van de meest effectieve manieren om hoogwaardige analyses van de subcellulaire lokalisatie van specifieke moleculen te leveren. Hier beschrijven we een protocol om glutamaatreceptoren bij retinale lintsynapsen kwantitatief te analyseren.

High-Resolution Kwantitatieve immunogoud Analyse van membraanreceptoren op het netvlies Ribbon Synapses

Dit artikel illustreert hoe de expressie van neurotransmitterreceptoren kan worden gekwantificeerd en het patroon geanalyseerd op synapsen met geïdentificeerde pre- en postsynaptische elementen door een combinatie van virale transductie van optogenetische hulpmiddelen en de freeze-fracture replica immunolabeling techniek.

Gecombineerde optogenetische en Freeze-fractuur Replica immunokleuring Input-specifieke Regeling van glutamaatreceptoren in de Mouse amygdala Onderzoek

Dit protocol geeft een werkwijze voor de morfologische herstel van neuronen patched tijdens elektrofysiologische opnames via biocytine vullen en immunohistochemische latere nabewerking. We laten zien dat dikke-biocytine gevuld secties die werden gekleurd en afgedekt kunnen worden restained met een tweede primair antilichaam dagen of maanden later.

Immunokleuring van biocytine gevuld en Verwerkte secties voor Neurochemische Markers

Synaptic vesikel endocytose is gedetecteerd door de lichte microscopie van pHluorin gefuseerd met synaptic vesikel eiwit en elektronenmicroscopie van vesikel opname.

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

Een protocol voor het nauwkeurig identificeren en analyseren van synapsen in hippocampal plakjes met immunofluorescentie wordt in dit artikel beschreven.

Evaluatie van SYNAPS dichtheid in Hippocampal knaagdier hersenen plakjes

Leer ImmunoGold-labeling voor ultrastucturele lokalisatie van synaptische eiwitten in rattenhippocampus met behoud van structuur en antigeniteit. Deze methode verbetert het inzicht in synaptische functies.

Post-inbedding immunogold Etikettering van Synaptic eiwitten in de hippocampus slice culturen

Meer video's verkennen