Name: High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Leer een snelle, kosteneffectieve methode voor high-throughput screening van transcriptieregulatoren met behulp van een zelfgemaakte dual-gloed luciferase assay in 293T-cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken John Darga van de MGH DNA Core voor de bereiding van de DNA-screening bibliotheek. Christopher Chigas van Perkin Elmer voorzien onschatbare steun voor onze Wallac 1420 lichtmeter. Steven Ciacco en Martin Thomae van Agilent steun verleend voor de Bravo robot. Wij danken Ron Johnson en Steve Titus bij de NIH voor royaal verstrekken van hun dual-gloed luciferasetest protocol.

Voor een experimentele overzicht, zie figuur 1. 1. Bereid Reporter plasmiden die de Alpha-Synuclein Promoter Regelelementen van het alfa-synucleine gen (Figuur 2) omvatten ongeveer 10 kb, van de stroomopwaartse NACP (niet-A beta component van amyloïde peptide) dinucleotide herhalingssequentie 1,2 tot intron 2 3. We nemen een deel van deze regio onze reporter construct. Wij vonden dat de plasmiden die intron 2 vereist speciale procedures voor de groei, zoals hieronder beschreven. De luciferase plasmiden, pGL4.10 en pGL4.75 (figuur 3), zijn commercieel verkrijgbaar van Promega en kan worden vermeerderd met behulp van conventionele moleculaire biologie protocollen. <ol><li> Versterken de 2 componenten van het alfa-synucleïne promotor in afzonderlijke PCR&#39;s met het recept in tabel 1 en de primers in Tabel 2. </li><li> Verify PCR-producten op een agarose gel en schoon met de Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen), en geëlueerd in 50 pl TE (Tris-EDTA). Bewaar de geëlueerde 0,9 kb fragment bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. </li><li> Digest het gehele volume van het 3,4 kb PCR-fragment, en 5 ug pGL4.10 met SacI en XhoI. Behandel de vector met Kalf Darm alkalisch fosfatase (Roche) en gel te zuiveren met behulp van de PureLink Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen). </li><li> Ligeren fragment en de vector met T4 DNA ligase (NEB). Reinig de voltooide reactie met behulp van de PCR PureLink Micro kit (Invitrogen), eluting in 10 pi TE-buffer. </li><li> Transformatie 2 pi van de gereinigde, ligatiereactie in 20 ui ElectroMAX Stbl4 competente cellen (Invitrogen) en elektroporatie volgens de instructies van de fabrikant. Schud in een 30 ° C incubator bij 225 rpm gedurende 90 minuten. Spread 2 volumes op LB-platen bevattende 100 mg / ml ampicilline en incubeer bij 30 ° C gedurende 2 dagen. </li><li> Met behulp van een tandenstoker, selecteer 4-6 kleine kolonies voor enting in 2 ml van TB (Terrific Broth). Groeien deze miniprep culturen in een 30 ° C shaker O / N. </li><li> Zuiver plasmide-DNA van 1,5 ml van elk miniprep cultuur met behulp van de PureLink HiPure Plasmid Miniprep kit (Invitrogen). </li><li> Digest de minipreps met BamHI en Electrophorèse op een agarosegel. De correcte kloon moet fragmenten van 2,8 kb en 4,9 kb produceren. </li><li> Restreak de resterende miniprep cultuur van de juiste kloon op een verse LB (Luria Broth) plaat en groeien bij 30 ° C gedurende 2 dagen. </li><li> Selecteer een kleine kolonie en te enten een 1,5 ml TB zuursel. Schud O / N bij 30 ° C. Laat de starter cultuur groeien tot verzadiging. </li><li> Verdun de gehele starter cultuur in 150 ml voorverwarmd TB en schudden bij 30 ° C gedurende 2 dagen. Alvorens over te gaan naar de volgende stap, gebruik 1,5 ml van deze cultuur voor een extra miniprep en de spijsvertering te bevestigen dat de kloon niet muteren tijdens replicati<html> op. </li><li> Zuiver plasmide DNA van de resterende cultuur met behulp van de PureLink HiPure Plasmid Maxiprep kit (Invitrogen). Verwachte opbrengsten van deze intermediaire plasmide zijn 50-150 mg per 150 ml van de cultuur. </li><li> Ontdooi de 0,9 kb fragment in stap 1.2 bevroren. Herhaal stap 1.3 tot 1.12 de 0,9 kb fragment te kloneren in de intermediaire plasmide digestie plaats met Kpnl en Sacl. Ligeer, transformeren, selecteren en kweken voor maxipreps als hierboven. Digestie met BamHI moet fragmenten van 5,8 kb en 2,8 kb opleveren. Dit is het plasmide dat wordt gebruikt voor het scherm. </li></ol> 2. Bereid 293T cellen, reporterplasmiden en Bibliotheek DNA voor Screening 293T cellen worden geënt in 96-well uitgeplaat en de volgende dag. Reporter plasmiden en DNA bibliotheek worden verdund in 96-wells platen. We verkregen platen van transfectie-grade bibliotheek DNA uit het DNA Kern van het Massachusetts General Hospital (krijgen = &quot;_blank&quot;&gt; dnacore.mgh.harvard.edu). Dit protocol transfects een bibliotheek plaat in 2 identieke platen van 293T-cellen (Figuur 1), zou dus 2 platen van cellen gezaaid voor elke bibliotheek plaat worden gescreend. Opmerking: Kweek cellen in medium zonder fenol rood of antibiotica, zoals deze functies de luciferase assays en verhogen toxiciteit tijdens transfectie, respectievelijk. <ol><li> Voor elke plaat bibliotheek te screenen, resuspendeer getrypsiniseerd 293T cellen tot een concentratie van 1,5 x 10 5 cellen / ml in DMEM met 14% FBS. Giet in een steriele reservoir (Axygen). </li><li> Plaats het reservoir 2 heldere bodem en 96 putjes (Corning), en een doos filter pipetpunten (Agilent) op de robot dek. Pipetteer 100 ul cellen in elk putje van twee platen, een dichtheid van 1,5 x 10 4 cellen per putje. </li><li> Centrifugeer de cellen platen bij 50 xg gedurende 2 minuten, met lage helling snelheden van waarborgenceldichtheid gedurende elk putje. Incubeer bij 37 ° C en 10% CO2 O / N. </li><li> Verdun de vuurvlieg en Renilla reporterplasmiden tot 5 ng / ul in serumvrij medium. Combineer de verdunningen in een verhouding van 05:03 tot vuurvlieg Renilla plasmide (in volume) in een 15 ml conische buis. </li><li> Pipet de gecombineerde plasmiden in elk putje van een 96-well plaat, doseren 17 ul per bibliotheek plaat, plus 2-10 ul overtollige, in elk putje. </li><li> Verkrijgen transfectie-grade DNA-bibliotheek platen zoals hierboven en verdun tot 13,3 ng / ul met endotoxine-vrij water. Het minimale volume per putje moet 28 pl. </li></ol> 3. Voer Transfecties Op dag 2 van het scherm, worden reporterplasmiden en bibliotheek DNA getransfecteerd in 293T-cellen. <ol><li> Voor elke bibliotheek plaat, meng 107.5 pl RT Optifect (Invitrogen) met 4,3 ml serumvrij medium (1:40 verdunning) in een polystyreen buis. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, enn afzien 44 pi (per bibliotheek plaat) in elk putje van een 96-well, polystyreen V-bodem plaat (Greiner). </li><li> Plaats de plaat van verdunde Optifect, reporterplasmiden (Stap 2.5), bibliotheek DNA&#39;s (Stap 2.6), en een doos met pipet tips over de robot dek. </li><li> Aspireren 17 ul van reporterplasmiden, 43 pl verdund Optifect, en 26 ul van DNA-bibliotheek, het invoegen van een 5 pl luchtspleet tussen elke aspiratie. De bibliotheek DNA moet als laatste worden opgezogen om kruisbesmetting te voorkomen. Doseer de inhoud van de tips in een nieuwe polystyreen met V-vormige plaat, mengen, deksel, en zet opzij voor 20 min om lipide / DNA-complexen te vormen. Als transfecteren meerdere bibliotheek platen, vervang dan de pipet tips en bibliotheek plaat, en herhaal. </li><li> Ontdek de Optifect / DNA mengsel bord en plaats het op de robot dek met 2 pitten van 293T-cellen. Met behulp van een enkele doos van pipet tips, aspireren 80 ul van de Optifect: DNA mengsel en langzaam afzien 40 pi op elke plaat van cellen. Als transonverminderd meerdere bibliotheek platen, herhaal voor alle Optifect: DNA platen. Bedek cellen. </li><li> Centrifugeer de cellen platen bij 1200 xg gedurende 30 minuten. Bedek en ga terug naar de incubator. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 4-6 uur. Tijdens deze incubatie bereid vers medium door het mengen van 12 ml DMEM met 10% FBS en 10 ug / ml ciprofloxacine (Cellgro) voor elke bibliotheek getransfecteerde plaat. Giet verse media in een steriele reservoir. </li><li> Plaats 2 dozen van robot tips, een enkele plaat van cellen, het reservoir met vers medium, en een verspilling reservoir op de robot dek. Aspireren 100 ul van de media uit de cellen en afzien in het afval reservoir gedeeltelijk gevuld met 70% ethanol. Met verse tips, aspireren 100 ul vers medium en langzaam afgeven op de cellen. Herhaal dit voor alle platen van cellen. </li><li> Terug platen in de incubator gedurende 48 uur. </li></ol> 4. Voer Dual-luciferasetests Op dag 4 van het scherm, devuurvlieg en Renilla luciferasetests worden uitgevoerd. Opmerking: de dual-luciferase assay vereist de sequentiële toevoeging van 2 assay buffers, 3X vuurvlieg testbuffer en 3x Renilla testbuffer, zoals beschreven in Tabel 3 Firefly en Renilla luciferasen niet uitgescheiden, waardoor cellen worden gelyseerd voor het meten van luciferase-activiteit. . Firefly assay buffer lyseert cellen en zorgt substraat voor de vuurvliegluciferase; Renilla proefbuffer lest de vuurvlieg signaal en voorziet substraat voor de Renilla luciferase. <ol><li> Voor elke bibliotheek plaat, bereiden 8 ml 3X vuurvlieg proefbuffer uit voorraad oplossingen zoals beschreven in Tabel 3, en afzien van 82 ul in elk putje van een 96-well-V-vormige plaat. </li><li> Voor elke bibliotheek plaat, ook bereid 12 ml 3X Renilla testbuffer en verdeel 122 pl in elk putje van een 96-well V-vormige plaat. Gereserveerd zowel devuurvlieg en Renilla assay buffers. </li><li> Plaats een doos met pipet tips, een afvalreservoir, en 2 pitten van cellen (getransfecteerd van dezelfde bibliotheek plaat) op de robot dek. </li><li> Aspireren 60 ul van de media van elke plaat en gooi het afval reservoir gedeeltelijk gevuld met 70% ethanol. Afdekplaten en zet apart. Als transfecteren meerdere bibliotheek platen, herhaal voor alle sets van platen. </li><li> Plaats 2 dozen van pipet tips, de plaat van 3X vuurvlieg assay buffer, en een set van platen staan ​​op de robot dek. </li><li> Aspireren 40 pl 3X vuurvlieg assay buffer en voeg deze toe aan de eerste plaat van cellen, grondig mengen. Omschakelen naar een nieuwe pipet tips, herhaal voor de tweede cel plaat. Plaats cellen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten tot lysis te voltooien. Als transfecteren meerdere bibliotheek platen, vervang dan de dozen van tips en celplaten, en herhaal. </li><li> Record luminescentie uit elk putje van elke cel plaat op een lichtmeter, opname voor 1 sec per well. Terug platen de robotdek. </li><li> Plaats 2 dozen van pipet tips, de plaat van 3X Renilla assay buffer, en een set van platen staan ​​op de robot dek. </li><li> Aspireren 60 ul van 3X Renilla assay buffer, en voeg deze toe aan de eerste plaat van cellen, grondig mengen. Overschakelen naar een nieuwe doos van pipet tips, herhaal voor de tweede cel plaat. Als transfecteren meerdere bibliotheek platen, herhaal voor alle sets van celplaten. </li><li> Record luminescentie van alle platen op een lichtmeter, het opnemen van elk goed voor 1 sec als hierboven. Gooi platen. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Bereken de vuurvlieg: Renilla luminescentie ratio (&quot;F: R-verhouding&quot;) voor elk putje door het verdelen van de graven van vuurvlieg signaal door de graven van Renilla signaal. </li><li> Bereken de inductie waarde door deling van het F: R verhouding van elk putje van de gemiddelde F: R verhouding van de plaat, de hoogste en laagste 25% van de putjes. </li><li> Het gemiddelde van de inductie waarden over replicavoor een enkele getransfecteerde bibliotheek plaat. Genen induceren of onderdrukken van alfa-synucleïne meer dan drie plooien worden beschouwd als &quot;hits&quot; in dit scherm en zijn onderhevig aan verdere validatie en secundaire beeldschermen. </li></ol>

<ol><li>Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+allelic+variation+at+the+NACP-Rep1+repeat+upstream+of+the+%CE%B1-synuclein+gene+%28SNCA%29+on+transcription+in+a+cell+culture+luciferase+reporter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).</li>
<li>Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+intra-allelic+variation+at+NACP-Rep1+in+the+alpha-synuclein+gene%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene.</a> 113 (5), 426-431 (2003).</li>
<li>Scherzer, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+transcription+factors+directly+regulate+the+Parkinson%27s+disease-linked+gene+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene α-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).</li>
<li>Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Synuclein+in+Lewy+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">α-Synuclein in Lewy Bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li>
<li>Pankratz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-analysis+of+Parkinson%27s+disease%3A+identification+of+a+novel+locus%2C+RIT2%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2.</a> Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).</li>
<li>Satake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+common+variants+at+four+loci+as+genetic+risk+factors+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).</li>
<li>Simón-Sánchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+reveals+genetic+risk+underlying+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).</li>
<li>Polymeropoulos, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+the+alpha-synuclein+gene+identified+in+families+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease.</a> Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).</li>
<li>Ibáñez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causal+relationship+between+a-synuclein+gene+duplication+and+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).</li>
<li>Chartier-Harlin, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-Synuclein+locus+duplication+as+a+cause+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).</li>
<li>Singleton, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-Synuclein+locus+triplication+causes+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease.</a> Science. 302 (5646), 841 (2003).</li>
<li>Ahn, T. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-Synuclein+gene+duplication+is+present+in+sporadic+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease.</a> Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).</li>
<li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+USA%22%5BJournal%5D)">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li>
<li>Montigny, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+influencing+high-efficiency+transfection+of+bacterial+artificial+chromosomes+into+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells.</a> Biotechniques. 35, 796-807 (2003).</li>
<li>Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+genomes+which+express+chloramphenicol+acetyltransferase+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).</li>
<li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+ORC6%2C+a+Component+of+the+Yeast+Origin+Recognition+Complex+by+a+One-Hybrid+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System.</a> Science. 262, 1870-1874 (1993).</li>
<li>Dejardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Proteins+Associated+with+Specific+Genomic+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci.</a> Cell. 136, 175-186 (2009).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouseGenome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome.</a> Nature. 488, 116-120 (2012).</li>
<li>Fan, F., Wood, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+assays+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent assays for high-throughput screening.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).</li>
<li>Hampf, M., Gossen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+combined+Photinus+and+Renilla+luciferase+quantification+compatible+with+protein+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays.</a> Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).</li>
<li>Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+PTC124+activity+in+cell-based+luciferase+assays+of+nonsense+codon+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).</li>
<li>Pearlberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screens+using+RNAi+and+cDNA+expression+as+surrogates+for+genetics+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells.</a> Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).</li>
</ol>

Dit werk werd ondersteund door de royalty&#39;s verkregen door vergunningverlenende BacMamreagents (Amerikaans octrooi 5.731.182).

Alpha-synucleïne is betrokken bij de ziekte van Parkinson (PD) als component van Lewy lichamen 4, intracellulaire inclusies beschouwd pathognomonische voor de ziekte. Tal van genoom-brede associatie studies hebben single nucleotide polymorfismen gekoppeld aan alfa-synucleïne met een verhoogd risico voor sporadische PD 5,6,7. Hoewel minder algemeen dan sporadische PD, kan familiale PD ook worden veroorzaakt door mutaties in alfa-synucleine 8, en dubbel en triplicatie van de alfa-synucleïn...

De mogelijkheid om belangrijke genetische regulerende elementen en de factoren die inwerken op hen te identificeren is fundamenteel voor de exploratie van talrijke biologische processen. Echter, het identificeren van factoren die de expressie van genen reguleren in zeldzame soorten cellen, zoals specifieke neuronale populaties, kan een uitdaging zijn. Hier presenteren we een protocol voor het identificeren van nieuwe transcriptionele regulatoren van alfa-synucleïne (SNCA), een gen geassocieerd met de ziekte van Parkinson en uitgedrukt in dopaminerge neuronen in de substantianigra pars compacta regio van de middenhersenen. We doen dit met behulp van een high-throughput, dual-luciferase, in vitro reporter scherm om alfa-synucleïne expressie deconstrueren in 293T-cellen. De alfa-synucleïne promoter wordt eerst gekloneerd in een reporter plasmide dat het vuurvlieg luciferase gen. Een commercieel verkrijgbaar plasmide dat het Renilla luciferase onder controle van een constitutief actieve promoter fungeert als een interne controle. These reporter constructen worden co-getransfecteerd in 293T-cellen in microtiterplaten met plasmiden uit een DNA-expressie-bibliotheek, zodat elk putje getransfecteerd met een plasmide bibliotheek. Na 48 uur werd luciferaseactiviteit voor elke reporter achtereenvolgens gemeten met een dual-glans assay. De relatieve expressie van alfa-synucleïne voor iedere bibliotheek gen wordt afgeleid door de verhouding van vuurvlieg: Renilla luciferaseactiviteit in elk putje (F: R verhouding) na plaat gebaseerde normalisatie. Dit protocol geeft de mogelijkheid om een ​​groot aantal genen (~ 2500 per week) screenen op hun vermogen om een ​​reportergen transactiveren met minimale mankracht (1-2 personen) en minimale kosten (ongeveer $ 3 reagens kosten per microtiterplaat test). Transcriptiefactoren van neuronale genen (bijvoorbeeld alfa-synucleïne), die moeilijk te bestuderen in gekweekte neuronen vuurvaste genetische manipulatie kan worden vergeleken side-by-side in deze directe functionele test. We nemen in onzeprotocol een gedetailleerde methode voor het klonen en de groei van plasmiden die de alfa-synucleïne promotor, omdat we vonden dat plasmiden die deze regio zijn instabiel wanneer ze groeien met conventionele procedures (zie Discussie). We gebruiken ook een goedkoop alternatief voor handel verkrijgbare dubbele luciferase reagentia voor high-throughput assays. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere regelelementen van belang richten, of voor een werkwijze die een hoge-doorvoer transiënte transfecties.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiaal</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-12</td><td></td></tr><tr><td>PureLink PCR Micro Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K310250</td><td></td></tr><tr><td>PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-03</td><td></td></tr><tr><td>PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-07</td><td></td></tr><tr><td>Bravo Robot</td><td>Agilent</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Robot Pipet Tips with Filter</td><td>Agilent</td><td>19477-022</td><td></td></tr><tr><td>Robot Pipet Tips without Filter</td><td>Agilent</td><td>19477-002</td><td></td></tr><tr><td>Clear-bottomed 96-well Plates</td><td>Corning</td><td>3610</td><td></td></tr><tr><td>Reservoirs</td><td>Axygen</td><td>RES-SW96-HP-SI</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene V-bottomed 96-well Plate</td><td>Greiner</td><td>651101</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene V-bottomed 96-well Plate</td><td>Greiner</td><td>651201</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive Plate Covers</td><td>CryoStuff</td><td>#FS100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagens</td></tr><tr><td>Phusion DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>BAC 2002-D6</td><td>Invitrogen</td><td>2002-D6</td><td></td></tr><tr><td>Calf Intestine Alkaline Phosphatase</td><td>Roche</td><td>10713023001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E6931</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX Stbl4 Competent Cells</td><td>Invitrogen</td><td>11635-018</td><td></td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5&alpha; Competent Cells</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>DMEM without Phenol Red</td><td>Invitrogen</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Optifect</td><td>Invitrogen</td><td>12579017</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>CellGro</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hydrochloride Powder</td><td>Sigma</td><td>93287</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base Powder </td><td>Sigma</td><td>93286</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Pure Liquid</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>C&#8211;nzyme A</td><td>Nanolight</td><td>309</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Invitrogen</td><td>L2912</td><td></td></tr><tr><td>h-CTZ</td><td>Nanolight</td><td>301</td><td></td></tr><tr><td>PTC124</td><td>SelleckBiochemicals</td><td>S6003</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput functionele screening met behulp van een zelfgemaakte dual-gloed luciferase assay

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We presenteren een snelle en goedkope high-throughput screening protocol transcriptionele regulatoren van alfa-synucleïne, een gen geassocieerd met de ziekte van Parkinson te identificeren. 293T cellen transient getransfecteerd met plasmiden uit een array ORF expressiebibliotheek, samen met luciferase reporter plasmiden in een gen-per-well microplate format. Vuurvlieg luciferase activiteit bepaald na 48 uur om de effecten van elke bibliotheek gen op alfa-synucleine transcriptie, genormaliseerd op de expressie van een interne controle construct (een hCMV promoter Renilla luciferase) bepalen. Dit protocol wordt vergemakkelijkt door een tafelmodel robot ingesloten in een bio kast, die aseptisch vloeistofverwerking in 96-well formaat uitvoert. Onze geautomatiseerde transfectie protocol gemakkelijk aanpasbaar voor hoge-doorvoer lentivirale bibliotheek productie of andere functionele screening protocollen ter drievoudige transfecties van grote aantallen unieke bibliotheek plasmiden conjuncties met een gemeenschappelijke set van helper plasmiden. Presenteren we ook een goedkoop en gevalideerd alternatief voor in de handel verkrijgbare, dual luciferase reagentia die PTC124, EDTA, en pyrofosfaat te vuurvliegluciferase activiteit onderdrukken voorafgaand aan de meting van Renilla luciferase telt. Met behulp van deze methoden, gescreend we 7670 menselijke genen en geïdentificeerd 68 regulatoren van alfa-synucleïne. Dit protocol is gemakkelijk aanpasbaar aan andere genen van belang te richten.

Typische luciferase waarden F: R verhoudingen en inductie waarden voor een halve plaat worden getoond in figuur 4 Merk de hit in goed H2, een 32-voudige inductor.. Genen veroorzaken overmatige toxiciteit (bijvoorbeeld goed E3), of putten die slecht werden getransfecteerd, zullen lage waarden voor zowel de vuurvlieg en Renilla luciferases produceren, maar een gemiddelde inductie waarde. Genen waardoor niet-specifieke inductie van luciferaseactiviteit, bijvoorbeeld via interactie met de ...

We presenteren een snelle en goedkope screening methode voor het identificeren van transcriptiefactoren met behulp van high-throughput robotachtige transfecties en een zelfgemaakte dual-gloed luciferasetest. Dit protocol snel genereert direct naast elkaar functionele data voor duizenden genen en is gemakkelijk aanpasbaar aan een gen van belang te richten.

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Het algemene doel van deze procedure is om transcriptionele regulatoren van elk gen van belang te identificeren met behulp van een eenvoudig hoogdoorlaattransfectieprotocol en een zelfgemaakte dubbele glow-luciferase-assay. Dit wordt bereikt door eerst een unieke set dubbele luciferase-reporterplasmiden te ontwerpen en te klonen. Deze plasmiden worden gecot-getransfecteerd in 2 9 3 T-cellen in een microplaat met plasmiden van een DNA-expressiebibliotheek, zodat elke put wordt getransfecteerd met een enkel bibliotheekplasmide.Na 48 uur wordt de Firefly-luciferase-activiteit getest, gevolgd door een test van vanilla-luciferase-activiteit. De laatste stap is het berekenen van de verhoudingen van firefly tot vanilla-luciferase-activiteit. Uiteindelijk is de relatieve inductie van het gen van belang in reactie op elke bibliotheek.Gen wordt afgeleid uit de verhouding van firefly tot vanilla-luciferase-activiteit in elke put na normalisatie op basis van platen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande reporter-assayprotocollen is de mogelijkheid om snel functionele gegevens voor een groot aantal genen te genereren met minimale mankracht en kosten. Eén dag voorafgaand aan de transfectie, aangeduid als dag één van het screenen, worden 2 9 3 T-cellen geplaatst in 96.Putjes met cellen worden gedimensioneerd, geteld en hervat tot een concentratie van 1,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter. In DMEM met 14%FBS giet u de cellen in een steriel reservoir. Plaats het reservoir, zes helderbodemde 96-putjesplaten en een doos filterpipettips op het robotsdek van de geautomatiseerde vloeistofpomp.Twee platen met cellen moeten worden geplaatst voor elke bibliotheekplaat die zal worden gescreend. Spuit 100 microliter cellen in elk putje van elke plaat voor een dichtheid van 1,5 keer 10 tot de vierde cellen per putje. Drie bibliotheekplaten zullen in deze demonstratie worden gescreend.Daarom worden zes platen met cellen voorbereid, centrifugeer de celplaten bij 50 keer G gedurende twee minuten met lage oploopsnelheden om een gelijkmatige celdichtheid in elk putje te garanderen. Deze afbeelding illustreert hoe de geplateerde cellen eruit zouden moeten zien na de centrifugatie. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 10% koolstofdioxide een nacht.Om de firefly- en vanilla-reporterplasmiden voor te bereiden, verdunt u deze tot vijf nanogram per microliter in endotoxinevrij water in een 15 milliliter conische buis. Combineer de verdunningen in een verhouding van vijf op drie firefly naar vanilla-plasmide naar volume. Spuit de gecombineerde plasmiden in elk putje van een 96-putjesplaat en verdeel 17 microliter per bibliotheekplaat, plus twee tot 10 microliter overschot in elk putje. Cellen worden op dag twee van het screen getransfecteerd.Om deze procedure voor elke bibliotheekplaat te starten, mengt u 107,5 microliter kamertemperatuur op defect met 4,3 milliliter serumvrij medium, een verdunning van één op veertig in een polystyreenbuis, en incubeert u gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Spuit 44 microliter per bibliotheekplaat in elk putje van een 96-putjespolystyreen V-bodemplaat. Plaats de bibliotheek-DNA-plaat, de verdunde opt-effectplaat, de reporter-plasmidplaat en een doos pipetten op het robotsdek. Aspiraat. 17 microliter reporter-plasmiden, 43 microliter verdund opt-effect en 26 microliter bibliotheek-DNA met een luchtspleet van vijf microliter tussen elke aspiratie.Het bibliotheek-DNA moet als laatste worden afgezogen om kruisbesmetting te voorkomen. Spuit de inhoud van de pipetten in een nieuwe polystyreen V-bodemplaat, dek af en laat 20 minuten staan ​​om lipide-DNA-complexen te laten vormen. Als u meerdere bibliotheekplaten transecteert, vervangt u de pipetten en de bibliotheekplaat en herhaalt u na 20 minuten, dekt u de opt-effect-DNA-mengselplaat af en plaatst u deze op het robotsdek met twee platen 2 9 3 T-cellen met een enkele doos pipetten.Aspiraat 80 microliter van het opt-effect-DNA-mengsel en verdeel langzaam 40 microliter per putje voor elke plaat met cellen. Dek de cellen af nadat het opt-effect-DNA-mengsel aan de cellen in alle platen is toegevoegd. Centrifugeer de platen bij 1.200 keer G gedurende 30 minuten.Breng de platen terug naar de incubator en incubeer de cellen gedurende vier tot zes uur. Tijdens deze incubatie bereidt u vers medium voor door 12 milliliter DMEM met 10%FBS en 10 microgram per milliliter ciprofloxine te mengen. Voor elke getransfecteerde bibliotheekplaat, giet u vers medium in een steriel reservoir.Plaats vervolgens twee dozen robotspullen, een enkele plaat met cellen, het reservoir met vers medium en een afvalreservoir op het robotsdek. Aspiraat vervolgens 100 microliter medium van de cellen en verdeel het in het afvalreservoir, gedeeltelijk gevuld met 70%ethanol. Gebruik nieuwe pipetten om 100 microliter vers medium te aspireren en verdeel het langzaam over de cellen.Breng de platen terug naar de incubator voor 48 uur. De firefly- en vanilla-luciferase-assays worden uitgevoerd. 48 uur na de transfectie op dag vier van het screen voor elke bibliotheekplaat, bereidt u acht milliliter drie keer firefly-assaybuffer en 12 milliliter drie keer vanilla-assaybuffer vanuit hun respectieve stockoplossingen voor. Spuit 82 microliter firefly-assaybuffer in elk putje van een 96-putjes V-bodemplaat voor elke bibliotheekplaat die wordt getest.Spuiten op dezelfde manier 122 microliter vanilla-assaybuffer in elk putje van een andere 96-putjes V-bodemplaat. Zet voor elke plaat die wordt getest beide assaybuffers opzij. Plaats een doos pipetten, een afvalreservoir en twee platen cellen getransfecteerd van dezelfde bibliotheekplaat op het robotsdek. Aspiraat 60 microliter medium van elke plaat en gooit het in het afvalreservoir, gedeeltelijk gevuld met 70%ethanol. Dek de platen af en laat ze opzij staan.<

high-throughput-functional-screening-using-homemade-dual-glow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we de procedures voor het bestuderen van veranderingen in de fagocytose-geïnduceerde genexpressie met een luciferase-based reportergen benadering met behulp van de Dual-GloTM Luciferase Assay System van Promega.

Studeren Membraan Biogenese met een Luciferase-Based Reporter Gene test

Circadiane klokken functioneren binnen de individuele cellen, dat wil zeggen, ze zijn cel-autonoom. We beschrijven werkwijzen voor het genereren van cel-autonome klok modellen niet-invasieve, luciferase-gebaseerde real-time bioluminescentie technologie. Reporter cellen handelbaar, functionele modelsystemen voor het bestuderen van circadiane biologie.

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

In this video, we describe a method highlighting the utility of bioluminescence assay for sensitive and rapid screening of drugs. These drugs can be tested alone or in combination to assess the synergism in their mode of action.

Cellular Bioluminescence Based Assay: A High Throughput Method for Combinatorial Drug Screening

The video demonstrates the luciferase assay used to quantify luciferase-tagged proteins. The assay uses an engineered luciferase enzyme composed of a large fragment that binds with the small fragment, which is conjugated with a protein of interest. The bound subunits form an active enzyme that, in the presence of the substrate, releases a luminescent signal. This signal is then quantified using a luminometer.

The Luciferase Assay: A High-Throughput Assay to Measure Luminescent Signals Using Engineered Nanoluciferase System-Based Bioreporters

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

In vitro assays om virusreplicatie te meten zijn sterk verbeterd door de ontwikkeling van recombinante RNA-virussen tot expressie luciferase of andere enzymen die in staat bioluminescentie. Hier hebben we detail een high-throughput screening pijplijn dat dergelijke recombinante stammen van mazelen en chikungunya virussen breed-spectrum antivirale middelen te isoleren van chemische bibliotheken combineert.

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

Dit artikel presenteert een methode op basis van luciferase-expressie met hoge doorvoer voor het titreren van verschillende RNA- en DNA-virussen met behulp van geautomatiseerde en handmatige vloeistofbewogen.

High-throughput Titratie van Luciferase-expressie Recombinant virussen

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

Om nieuwe regelgevers van transcriptiefactoren te identificeren, ontwikkelden we een benadering om arrayed lentivirale of retrovirale RNAi-bibliotheken te screenen met behulp van een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie-verslaggever test. Deze aanpak biedt een snelle en relatief goedkope manier om honderden kandidaten in één experiment te screenen.

Identificatie van Transcription Factor Regulators met behulp van Medium-Throughput Screening van arrayed bibliotheken en een Dual-Luciferase-Based Reporter

Leer een snelle, kosteneffectieve methode voor high-throughput screening van transcriptieregulatoren met behulp van een zelfgemaakte dual-gloed luciferase assay in 293T-cellen.

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

Meer video's verkennen