High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

Het algemene doel van deze procedure is om transcriptionele regulatoren van elk gen van belang te identificeren met behulp van een eenvoudig hoogdoorlaattransfectieprotocol en een zelfgemaakte dubbele glow-luciferase-assay. Dit wordt bereikt door eerst een unieke set dubbele luciferase-reporterplasmiden te ontwerpen en te klonen. Deze plasmiden worden gecot-getransfecteerd in 2 9 3 T-cellen in een microplaat met plasmiden van een DNA-expressiebibliotheek, zodat elke put wordt getransfecteerd met een enkel bibliotheekplasmide.

Na 48 uur wordt de Firefly-luciferase-activiteit getest, gevolgd door een test van vanilla-luciferase-activiteit. De laatste stap is het berekenen van de verhoudingen van firefly tot vanilla-luciferase-activiteit. Uiteindelijk is de relatieve inductie van het gen van belang in reactie op elke bibliotheek.

Gen wordt afgeleid uit de verhouding van firefly tot vanilla-luciferase-activiteit in elke put na normalisatie op basis van platen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande reporter-assayprotocollen is de mogelijkheid om snel functionele gegevens voor een groot aantal genen te genereren met minimale mankracht en kosten. Eén dag voorafgaand aan de transfectie, aangeduid als dag één van het screenen, worden 2 9 3 T-cellen geplaatst in 96.

Putjes met cellen worden gedimensioneerd, geteld en hervat tot een concentratie van 1,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter. In DMEM met 14%FBS giet u de cellen in een steriel reservoir. Plaats het reservoir, zes helderbodemde 96-putjesplaten en een doos filterpipettips op het robotsdek van de geautomatiseerde vloeistofpomp.

Twee platen met cellen moeten worden geplaatst voor elke bibliotheekplaat die zal worden gescreend. Spuit 100 microliter cellen in elk putje van elke plaat voor een dichtheid van 1,5 keer 10 tot de vierde cellen per putje. Drie bibliotheekplaten zullen in deze demonstratie worden gescreend.

Daarom worden zes platen met cellen voorbereid, centrifugeer de celplaten bij 50 keer G gedurende twee minuten met lage oploopsnelheden om een gelijkmatige celdichtheid in elk putje te garanderen. Deze afbeelding illustreert hoe de geplateerde cellen eruit zouden moeten zien na de centrifugatie. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 10% koolstofdioxide een nacht.

Om de firefly- en vanilla-reporterplasmiden voor te bereiden, verdunt u deze tot vijf nanogram per microliter in endotoxinevrij water in een 15 milliliter conische buis. Combineer de verdunningen in een verhouding van vijf op drie firefly naar vanilla-plasmide naar volume. Spuit de gecombineerde plasmiden in elk putje van een 96-putjesplaat en verdeel 17 microliter per bibliotheekplaat, plus twee tot 10 microliter overschot in elk putje. Cellen worden op dag twee van het screen getransfecteerd.

Om deze procedure voor elke bibliotheekplaat te starten, mengt u 107,5 microliter kamertemperatuur op defect met 4,3 milliliter serumvrij medium, een verdunning van één op veertig in een polystyreenbuis, en incubeert u gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Spuit 44 microliter per bibliotheekplaat in elk putje van een 96-putjespolystyreen V-bodemplaat. Plaats de bibliotheek-DNA-plaat, de verdunde opt-effectplaat, de reporter-plasmidplaat en een doos pipetten op het robotsdek. Aspiraat. 17 microliter reporter-plasmiden, 43 microliter verdund opt-effect en 26 microliter bibliotheek-DNA met een luchtspleet van vijf microliter tussen elke aspiratie.

Het bibliotheek-DNA moet als laatste worden afgezogen om kruisbesmetting te voorkomen. Spuit de inhoud van de pipetten in een nieuwe polystyreen V-bodemplaat, dek af en laat 20 minuten staan ​​om lipide-DNA-complexen te laten vormen. Als u meerdere bibliotheekplaten transecteert, vervangt u de pipetten en de bibliotheekplaat en herhaalt u na 20 minuten, dekt u de opt-effect-DNA-mengselplaat af en plaatst u deze op het robotsdek met twee platen 2 9 3 T-cellen met een enkele doos pipetten.

Aspiraat 80 microliter van het opt-effect-DNA-mengsel en verdeel langzaam 40 microliter per putje voor elke plaat met cellen. Dek de cellen af nadat het opt-effect-DNA-mengsel aan de cellen in alle platen is toegevoegd. Centrifugeer de platen bij 1.200 keer G gedurende 30 minuten.

Breng de platen terug naar de incubator en incubeer de cellen gedurende vier tot zes uur. Tijdens deze incubatie bereidt u vers medium voor door 12 milliliter DMEM met 10%FBS en 10 microgram per milliliter ciprofloxine te mengen. Voor elke getransfecteerde bibliotheekplaat, giet u vers medium in een steriel reservoir.

Plaats vervolgens twee dozen robotspullen, een enkele plaat met cellen, het reservoir met vers medium en een afvalreservoir op het robotsdek. Aspiraat vervolgens 100 microliter medium van de cellen en verdeel het in het afvalreservoir, gedeeltelijk gevuld met 70%ethanol. Gebruik nieuwe pipetten om 100 microliter vers medium te aspireren en verdeel het langzaam over de cellen.

Breng de platen terug naar de incubator voor 48 uur. De firefly- en vanilla-luciferase-assays worden uitgevoerd. 48 uur na de transfectie op dag vier van het screen voor elke bibliotheekplaat, bereidt u acht milliliter drie keer firefly-assaybuffer en 12 milliliter drie keer vanilla-assaybuffer vanuit hun respectieve stockoplossingen voor. Spuit 82 microliter firefly-assaybuffer in elk putje van een 96-putjes V-bodemplaat voor elke bibliotheekplaat die wordt getest.

Spuiten op dezelfde manier 122 microliter vanilla-assaybuffer in elk putje van een andere 96-putjes V-bodemplaat. Zet voor elke plaat die wordt getest beide assaybuffers opzij. Plaats een doos pipetten, een afvalreservoir en twee platen cellen getransfecteerd van dezelfde bibliotheekplaat op het robotsdek. Aspiraat 60 microliter medium van elke plaat en gooit het in het afvalreservoir, gedeeltelijk gevuld met 70%ethanol. Dek de platen af en laat ze opzij staan.