Generatie van Aligned Functionele myocardweefsel Door microcontact afdrukken
19 maart 2013
De generatie van uitgelijnde myocardiale weefsel is een belangrijke voorwaarde voor het aanpassen van de recente ontwikkelingen in de stamcel biologie om klinisch bruikbare doeleinden. Hierin beschrijven we een microcontact afdrukken benadering voor de nauwkeurige controle van cellulaire vorm en functie. Met behulp van zeer zuivere populaties van embryonale stamcellen afgeleid cardiale voorlopercellen, we dan het genereren van anisotrope functionele myocardium.
Het doel van het volgende experiment is om gealigneerd functioneel myocardweefsel te genereren door middel van microcontactprinting. Dit wordt bereikt door eerst fibronectine microcontactprinten op poly dimethyl siloxaan substraten. Als tweede stap, dubbel transgenisch.
Embryonale stamcellijnen worden gedifferentieerd in vitro en geïsoleerd door middel van fluorescentie geactiveerde celsortering, wat het mogelijk maakt om zeer zuivere populaties van sterk cardiogene progenitors te verkrijgen. Vervolgens worden geïsoleerde hartprogenitors gezaaid op micro patent PDMS substraten om ze kwaadaardig te maken en een hartmyocyet-achtige staafvorm aan te nemen. Resultaten worden verkregen die de succesvolle isolatie en isotrope groei van hartprogenitors laten zien op basis van feiten en immunofluorescentie analyse.
Het genereren van isotrope myocardweefsels kan helpen om vooruitgang te boeken op het gebied van stamcelbiologie en weefselbio-engineering door de mogelijkheid te bieden om ziekte-specifiek celresay te ontwikkelen voor medicijnontwikkeling en -ontdekking. En door de basis te leggen voor regeneratieve geneeskunde van het hart. Eerst IL guard, 180 4 poly dimethyl alane elastomeer in een 10 tot 1 basishardingsmiddelverhouding en meng goed.
Ontgast de assemblage met behulp van een droogkast om eventuele luchtbellen te elimineren. Giet de PDMS in een eerder vervaardigde master met 20 micron brede en twee micron werktuigslagen gescheiden door 20 micron Afstand, en laat twee dagen uitharden in een droogkast op kamertemperatuur om micro-getextureerde PDMS stempels te verkrijgen. Na het hydrofiel maken van de PDMS stempeloppervlakken met een plasmareiniger.
Steriseer de stempels met 70%ethanol gedurende één minuut. Droog snel met perslucht in een biologische veiligheidskast. Bedek de steriele stempeloppervlakken met fibronectine-oplossing om minimaal 10 minuten te absorberen na absorptie.
Scheud de fibronectine-oplossing van de stempels af en droog snel met perslucht. Leg conform contact tussen stempel en eerder voorbereide PDMS gecoate glazen deksels zoals beschreven in het tekstprotocol gedurende twee minuten en druk stevig aan. Spoel micro patroon substraten af met gedistilleerd water.
Bewaar ze maximaal twee weken op vier graden Celsius in gedistilleerd water, tenzij ze onmiddellijk worden gebruikt. Bekleed zes welborden met steriele 0,1%gelatine in gedistilleerd water en laat het 15 minuten absorberen bij 37 graden Celsius Tijdens deze tijd, bereid de muis embryonale fibroblasten van ahor aliquot voor door ze toe te voegen aan 50 milliliter PBS in een conische buis. Centrifugeer de meth bij 1000 RPM gedurende vijf minuten en resuspendeer ze in meth medium.
Zodra de incubatietijd is verstreken, zuigt u het overtollige gelatine af en voegt u de meth toe aan de welborden. Laat de MES een dag om zich te hechten. Bereid de embryonale stamcellen of ES-cellen van een gedacht aliquot voor door ze toe te voegen aan 50 milliliter PBS in een conische buis. Centrifugeer.
De ES-cellen 1000 RPM gedurende vijf minuten en resuspendeer ze in ESC medium. Voeg de E ES-cellen toe aan de welborden die mythen bevatten en onderhoud ze in ESC medium tot confluëntie wordt bereikt om confluënte ES-cellen te masseren. Aspirant eerst het ESC medium en was de cellen eenmaal met steriel PBS.
Aspirant vervolgens het PBS en voeg 500 microliter tripsine toe aan de, welborden. Incubeer de plaat gedurende drie en een half minuten bij 37 graden Celsius. Pipet de TRIPSIN oplossing meerdere keren op en neer.
Eerst om de E es celkolonies te breken. Neutraliseer vervolgens de tripsin oplossing door 500 microliter ESC medium toe te voegen aan de welborden. Masseer de ES-cellen volgens de vereiste verhouding hier worden de E ES-cellen gepasseerd in een verhouding van één op dertig, waardoor ze binnen drie dagen confluëntie kunnen bereiken.
Begin de in vitro differentiatie wanneer de ES-cellen confluëntie hebben bereikt. Bekleed eerst 10 centimeter kweekschalen met steriele 0,1%gelatine in gedistilleerd water en laat het 15 minuten absorberen bij 37 graden Celsius. Gedurende deze tijd, oogst u de ES-cellen zoals eerder.
Zodra de 15 minuten zijn verstreken, zuigt u eventueel overtollig gelatine af en voegt u ongeveer een derde tot de helft van de E ES-celsuspensie toe aan gekweekte schalen die adaptatiemedium bevatten. Na het twee dagen cultiveren van de cellen in adaptatiemedium, oogst u de aangepaste ES-cellen in een 50 milliliter conische buis die PBS bevat met behulp van 1,5 milliliter trypsine. Centrifugeer ze bij 1000 RPM gedurende vijf minuten en resuspendeer ze in differentiatiemedium.
Maak embryolichamen of EBS van ongeveer 1000 cellen per 10 microliter druppel differentiatiemedium in 15 centimeter kweekschalen. Gebruik een meerkanaalspipet, draai de schalen om en cultiveer. EBS is hangende druppels gedurende twee en een half dagen bij 37 graden Celsius.
Na twee en een half dagen, trekt u de EBS van zes tot acht 15 centimeter schalen in één met differentiatiemedium en cultiveert u ze nog drie en een half dagen verder. Na nog eens drie en een half dagen, verzamelt u de EBS in een 50 milliliter conische buis en wast u de plaat eenmaal met steriel PBS om alle ebs te verzamelen. Laat ze vervolgens ongeveer vijf minuten naar de bodem zinken.
Verwijder vervolgens de supinate en was de EBS met steriel PBS. Laat de EBS opnieuw ongeveer vijf minuten naar de bodem zinken. Dissocieer de EBS door 2,5 milliliter trypsine toe te voegen en schud de buis zachtjes in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende twee minuten.
Voeg vervolgens 2,5 milliliter steriel PBS toe aan de tripsin oplossing en pipet op en neer met de 10 milliliter serologische Pipet ongeveer acht tot 10 keer om celclusters te breken. Neutraliseer de trypsine met 10 milliliter fax buffer bevattende 7,5%E ES cel of differentiatiegradue FBS en 0,01%DPI in PBS centrifuge, gedissocieerde EBS bij 1000 RPM gedurende vijf minute
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een microcontactprinttechniek om uitgelijnd functioneel myocardiaal weefsel te genereren uit cardiale progenitorcellen afgeleid van embryonale stamcellen. De methode maakt een nauwkeurige controle over de celvorm en -functie mogelijk, wat bijdraagt aan vorderingen in de stamcelbiologie voor klinische toepassingen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Stamcelbiologie
- Cardiac Tissue Engineering
- Microcontact Printing-technieken
Achtergrond
- Uitgelijnd myocardweefsel is cruciaal voor een effectief cardiac herstel.
- Recente vorderingen in de stamcelbiologie bieden nieuwe mogelijkheden voor tissue engineering.
- Microcontact printing biedt een methode om de celmorfologie te controleren.
- Embryonale stamcellen kunnen differentiëren tot cardiac progenitorcellen.
Doel van de studie
- Om uitgelijnd functioneel myocardiaal weefsel te genereren.
- Om microcontactprinten te gebruiken voor precieze controle over de celvorm.
- Om zeer gezuiverde populaties van cardiale progenitorcellen te isoleren.
Gebruikte methoden
- Microcontactprinten van fibronectine op PDMS-substraten.
- In vitro differentiatie van dubbel transgene embryonale stamcellijnen.
- Fluorescentie-geactiveerde cellsortering voor de isolatie van cardiale progenitorcellen.
- Uitzaaien van cardiale progenitorcellen op micropatroon-substraten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van cardiogene progenitorcellen.
- Demonstratie van anisotrope groei van cardiale progenitorcellen.
- Validatie via immunofluorescentieanalyse.
- Generatie van staafvormige cellen die lijken op cardiale myocyten.
Conclusies
- De microcontactprinttechniek genereert effectief uitgelijnd myocardiaal weefsel.
- Deze aanpak vergroot het potentieel voor klinische toepassingen bij cardiaal herstel.
- Toekomstige studies kunnen verdere toepassingen van deze techniek onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Deze methode speelt in op de dringende behoefte aan fysiologisch relevante in vitro-modellen die de architectuur en functie van het menselijk myocard nabootsen, wat een belangrijk knelpunt vormt bij de ontdekking van cardiale geneesmiddelen en de regeneratieve geneeskunde. Door de generatie van uitgelijnd, functioneel myocardiaal weefsel uit pluripotente stamcellen mogelijk te maken, ondersteunt deze methode het mechanistische risicobeheer van therapeutische kandidaten en verbetert het de voorspellende betrouwbaarheid bij preklinische evaluaties. De aanpak biedt een schaalbaar, reproduceerbaar platform voor targetvalidatie en assayontwikkeling binnen pijplijnen voor cardiovasculair onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via ruimtelijk gecontroleerde celadhesie en anisotrope weefselvorming die de natuurlijke cardiale architectuur nabootst.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd systeem voor functionele targetvalidatie met behulp van sterk gezuiverde cardiale progenitorcellen die via FACS zijn geïsoleerd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Creëert micropatroon-extracellulaire matrixoppervlakken die de uitlijning en rijping van cardiomyocyten sturen, wat resulteert in kwantitatieve structurele en functionele meetwaarden.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays door nauwkeurige geometrische signalen die de variabiliteit in celorganisatie en contractiliteitsmetingen verminderen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en de preklinische stadia door ziekterelevante myocardiale weefselmodellen te genereren die de menselijke weefselarchitectuur weerspiegelen en mechanistische studies naar cardiaal herstel ondersteunen.
- Operationele waarde: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door middel van gevalideerde, schaalbare productie van gealigneerd functioneel weefsel uit hernieuwbare celbronnen.
Pipeline- & Workflowintegratie
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm door een biologisch gede-riskt platform te bieden voor vroege targetvalidatie, wat leidt tot assay-klare systemen voor compound-screening, en ondersteunt preklinische continuïteit via functionele beoordelingen op weefselniveau.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door gecontroleerde differentiatie en ruimtelijke organisatie van cardiale progenitorcellen tot uitgelijnd weefsel mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via reproduceerbare micropatroon-substraten die een consistente uitlijning en rijping van cardiomyocyten bevorderen voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert kwantitatieve output via immunofluorescentie en functionele analyse van sarcomere organisatie en weefselanisotropie, wat een vergelijkende beoordeling van condities mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verbinding met preklinische validatie door mens-relevante myocardiale weefselmodellen te produceren die mechanistische risicoreductie van regeneratieve en farmacologische interventies ondersteunen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het genereren van gestandaardiseerd myocardiaal weefsel over meerdere projecten heen, waardoor herontwikkelingskosten worden verlaagd en de consistentie tussen teams wordt verbeterd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in cardiale weefselmodellen te verminderen via nauwkeurige ruimtelijke controle over celadhesie en uitlijning.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via microcontactprinten van fibronectine en FACS-gebaseerde isolatie van progenitorcellen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door vroege detectie van ineffectieve of toxische verbindingen in fysiologisch relevante modellen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door betrouwbare, mens-relevante weefselmodellen die klinische uitkomsten bij cardiaal herstel en medicijnrespons beter voorspellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, fluorescence-activated cell sorting en microcontact-printtechnieken.
- Is afhankelijk van toegang tot apparatuur voor PDMS-fabricage, plasmareinigers en fluorescentiemicroscopie voor validatie.
- Vereist standaardisatie van micropatroonafmetingen, proteïnecoatingsprotocollen en celzaaidichtheden tussen teams.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de methode op verschillende celtypen of ziekte-specifieke progenitorlijnen.
- Omvat praktische beperkingen met betrekking tot de langetermijnstabiliteit van gemicroprinte patronen en de noodzaak van geoptimaliseerde differentiatieprotocollen om de zuiverheid van de progenitoren te behouden.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Microcontact Printing of Fibronectin onto PDMS Substrates
4:37
In vitro Differentiation of Double Transgenic Embryonic Stem Cell Lines and Isolation and Seeding of Cardiac Progenitors
8:14
Results: Highly Purified Populations of Embryonic Stem Cell Derived Cardiac Progenitors
10:51
Conclusion
2:46
Maintenance of Double Transgenic Embryonic Stem Cell Lines
