Een methode voor High Fidelity optogenetic controle van individuele piramidale neuronen In vivo

Het algemene doel van het volgende experiment is om snel genetisch gedefinieerde neuronale populaties te activeren of te verdoven op een fysiologisch relevante tijdschaal. Dit wordt bereikt door een virale vector te leveren die transgenen bevat die coderen voor de blauwlichtneuron activerende kanaalopsine of groenlichtneuron verdovende hallopsine naar genetisch gedefinieerde neuronen. Als tweede stap wordt een lichtemitterend op pad gebouwd dat bestaat uit een glasvezel bevestigd aan een opnameelektrode, wat gelijktijdige lichtlevering en elektrische opname mogelijk maakt.

Vervolgens wordt de TRO gepositioneerd boven en neergelaten in het Opsin-getransduceerde hersengebied. Om opsine en ha opsine gemedieerde reacties op te roepen, worden resultaten verkregen die lichtgeïnduceerde activering en remming van kanaalredsin en ha hallin getransduceerde neuronen laten zien op basis van de enkelheidseenheid opnametechniek die opname van individuele neuronen mogelijk maakt. Deze methode voldoet aan een fundamentele behoefte in de neurowetenschappen door ons in staat te stellen exact te bepalen hoe effectief licht kan zijn bij het aansturen van neuronale activiteit met milliseconden resolutie en in specifieke neurale subtypen en dit zal Chin Nakamura demonstreren.

Een postdoc in mijn laboratorium Zorg ervoor dat bioveiligheidsniveau één procedures worden gevolgd bij het bereiden en hanteren van virus, en dat alle lokale en overheidsrichtlijnen met betrekking tot dieren worden nageleefd. Laat voorafgaand aan stereotactische injectie een aliquot virus op ijs ontdooien en draai het vervolgens kort door. In een tafelcentrifuge een Hamilton glas spuit en naald langzaam terugvullen met een kleine hoeveelheid siliconen of minerale olie.

Zorg ervoor dat er geen zichtbare luchtbellen in de spuitcilinder zijn. Breng de spuit in een micro-injectorpomp in en bevestig de pomp direct aan de verticale stereotaxische arm. Nadat het virusaliquotbuisje in een stabiele positie is geplaatst, laat de stereotaxische arm zakken tot de punt van de naald de bodem van het virusaliquotbuisje raakt.

Gebruik de controller voor de micro-injectorpomp om het gewenste volume virus terug te trekken. Nadat een rat is verdoofd met ketamine en xylazine, controleer de reflexreactie op een teenprik om een voldoende diepte van anesthesie te garanderen met behulp van standaard aseptische methoden. Plaats het dier in een stereotactisch apparaat na het maken van een middenlijnsnede door de huid bovenop de schedel van het dier met kleine chirurgische schaar of scalpel.

Schepp voorzichtig het bindweefsel en maak de bovenkant van de schedel schoon met een kleine botkrabber. Laat de naald zakken en controleer of de Z-coördinaten voor bgma en lambda gelijk zijn om vast te stellen dat de kop niveau is. Beweeg vervolgens de stereotaxische arm naar de coördinaten die overeenkomen met de hersenstructuur van belang.

Markeer de beoogde injectieplaats met een chirurgische pen. Gebruik een handboor om voorzichtig de schedel boven het doelgebied te verdunnen. Stop wanneer de boorslijpsteen de bodem van de schedel bereikt en gebruik een paar extra fijne pincetten om het verdunne bot te verwijderen.

Nadat de dura is blootgelegd, plaats de spuitnaald boven het doelgebied en laat de naald zakken totdat deze de dura raakt. En gebruik dit punt om de z. Coördinaat nu heel langzaam de injectienaald in de hersenen zakken tot de juiste Z-positie is bereikt.

In dit protocol wordt de pre limbische regio van de mediale prefrontale cortex gericht. Injecteer het virus met een snelheid van 0,1 microliter per minuut. Wacht na voltooiing van de injectie 10 minuten voordat u de naald terugtrekt om terugstroming van het virus naar het oppervlak van de hersenen te voorkomen.

Na het gebruik van een naainaald met aangehecht naald om de huid te verzegelen, breng antibiotica aan op de wond. Bevestig eerst een één tot 1,5 mega ohm wolfraamelektrode aan een glazen capillairbuis met superlijm. Gebruik vervolgens een glasvezelstripgereedschap om het blote uiteinde van een multimode glasvezel bloot te leggen en maak het glasvezeltipje lichtjes schoon met ethanol.

Scoreer het glasvezeltipje met een wigvormig diamantmes en gebruik fijne pincetten om voorzichtig het overtollige glasvezel te verwijderen. Het glasvezel moet gemakkelijk op de score snijden. Gebruik een optische vermogensmeter om de laserintensiteit op het uiteinde van de glasvezel te meten.

Voor in vivo opnames kan een lichtintensiteit van slechts 20 tot 100 milliwatt per vierkante millimeter betrouwbaar kanaalredsin of hallin gemedieerde activering of respectievelijk remming van neuronale activiteit oproepen. Plaats vervolgens de glasvezel in de capillairbuis. Plaats het glasvezeltipje ongeveer 500 micrometer boven het uiteinde van de wolfraamelektrode en bind een dunne naad twee keer op enkele punten nabij het uiteinde zodat de elektrode en het glasvezel recht zijn.

Zorg ervoor dat de afstand tussen het uiteinde van de elektrode en de dichtstbijzijnde knoop lang genoeg is voor inbrenging in het doelgebied zoals hier te zien is. Bereid het dier voor op de operatie zoals eerder. Gebruik vervolgens de initiële craniotomie als gids om een nieuw, schoon, klein venster in de schedel te maken.

Voor het positioneren van de tro. Gebruik een fijne naald om een kleine incisie op de dura te maken. Laat de TRO voorzichtig door het schedelvenster en in de hersenen zakken naar het getransduceerde gebied met behulp van een microm manipulator.

Vervolgens brengt u de offroad langzaam in stappen van 10 tot 50 micron tot het optreden van een lichtgevoelige cel. Hier wordt een aangepaste softwaregebruikersinterface geschreven in lab view gebruikt om de enkele diodelaser te besturen en om lopende neurale activiteit te visualiseren en op te nemen. Opgenomen signalen worden vastgelegd met een ex AMP 20 K versterker bandpass gefilterd op 0,3 tot acht kilohertz en een analoge naar digitale kaart van een nationale instrument.

De Neuro Lux Pro gebruikersinterface biedt de keuze uit analoge ingangen en digitale uitgang. Kies twee analoge kanalen voor het neuronale en transistor transistor logic of TTL-signaal. Stel de bemonsteringssnelheid in op 20 kilohertz, de baseline pre-licht periode op twee seconden en de post-licht periode op