Name: Zuivering en microRNA Profilering van Exosomes Afgeleid van Blood en cultuur Media (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Leer exosoomzuivering en microRNA-profielanalyse uit bloed en celkweekmedia via differentiële centrifugatie. Deze methode detecteert tot 758 microRNAs voor biomarkeronderzoek en therapeutische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door fondsen van Rita Allen Stichting subsidie ​​aan Seena Ajit. De auteurs willen graag Erika Balogh en Dr Soumitra Ghoshroy erkennen van de Universiteit van South Carolina Electron Microscopy Center te gebruiken instrument, wetenschappelijke en technische bijstand.

Alle experimenten met bloedmonsters van de mens en knaagdieren werden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, verordeningen en regelgevende instanties. Proefpersonen werden ingeschreven na het geven van geïnformeerde toestemming zoals goedgekeurd door de Drexel University College of Medicine Institutional Review Board en alle procedures voor het onderzoek uitgevoerd met dieren werden goedgekeurd door Drexel&#39;s Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Exosome Zuivering van het bloed (~ 5,5 uur) TIPS <ul><li class="jove_content"> We resuspendeer exosomes van het ene buisje bloed (~ 10 ml menselijk bloed en ~ 2 ml muis bloed) in 300 ul RNA lysisbuffer uit de Mirvana miRNA isolatie kit. </li><li class="jove_content"> Om exosomes van celkweekmedium zuiveren, wordt het medium gecentrifugeerd bij 500 xg gedurende 10 min. om cellen te verwijderen en tevens gefiltreerd door een 0,22 urn filter na centrifugeren bij 12.000 x g. De exosome zuivering van celcultuurmediaeen verdunning in PBS, de PBS wassen of de tweede ultracentrifuge stap niet nodig. </li><li class="jove_content"> Indien de gezuiverde exosomes wordt gebruikt voor proteomics studies, het toevoegen van een sucrose gradiënt centrifugatie stap na ultracentrifugatie stap zal de hoeveelheid eiwit aggregaten en verontreinigingen 15 verminderen. </li><li class="jove_content"> De waargenomen morfologie van exosomes kan afhankelijk van de bron en de verwerkingsstappen voor TEM. We hadden niet in acht nemen van de komvormige morfologie voor exosomes die eerder toegeschreven aan verschillen in de steekproef verwerking 9,15. Onze TEM beelden waaronder de immunogoud etikettering zijn vergelijkbaar met eerdere rapporten uit verschillende bronnen, waaronder bloed, gal en corticale cultuur afgeleid exosomes 9,16,17. </li></ul><ol><li> Omkeren EDTA gecoate buis met daarin het bloed 5x en plaats rechtop bij kamertemperatuur gedurende 10-60 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 2000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li&gt; <li> Verzamel de bovenste laag, het plasma, in 15 ml buizen en blijf op ijs. </li><li> Verdun fluïdum met een gelijk volume PBS. Centrifugeer 30 minuten bij 2000 xg bij 4 ° C. </li><li> Transfer naar centrifugebuizen, voeg 1X PBS voor een totaal volume van 24 ml en centrifugeer 45 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Transfer naar ultracentrifuge buizen en centrifugeer 2 uur bij 110.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer pellet in PBS en centrifugeer 1 uur bij 100.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer pellet in geschikte buffer (RNA lysisbuffer). </li><li> Resuspendeer in PBS of RIPA buffer respectievelijk elektronenmicroscopie en western blot analyse. </li></ol> 2. RNA-zuivering met een aangepaste Mirvana miRNA Isolation Kit (~ 1 uur) TIPS <ul><li class="jove_content"> Bereid de ruimte voor het isoleren van RNA door het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), vlakken schoon te vegen en pipetten met RNase Zap, en met steriele filter tips en buizen. </li><liclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Hoewel het protocol van de leverancier geeft de mogelijkheid om het zuiveren alleen miRNA, we altijd isoleren totaal RNA waaronder mRNA en miRNA zodat we kunnen bestuderen zowel uit hetzelfde monster. </li><li class="jove_content"> Een on-column DNase behandelingsstap toevoegen verwijdert sporen van DNA die aanwezig kunnen zijn. Afhankelijk van de bron van exosomes is DNA gerapporteerd afwezig in exosomes gezuiverd uit een aantal bronnen, waaronder muizen en humane cellijnen mast 8 maar chromosomaal DNA sequenties zijn in exosomes gezuiverd uit medium van gekweekte cardiomyocyten 18 gedetecteerd. </li><li class="jove_content"> We verminderde het volume wasoplossing 1-350 pl (stap 2.4) omdat de verkoper geeft alleen voldoende wasoplossing 1 gedurende een 700 ul toevoeging. Indien het volume niet wordt verminderd er niet voldoende oplossing links voor het gebruik van de volledige inhoud kit. Overige stappen werden uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant. </li></ul><ol><li> Voeg 1/10 volume van miRNA Homogenaat Additive (30 pl) en incubeer op ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Extraheer met een volume van zuur-fenol: chloroform gelijk aan het initiële volume lysaat. Centrifugeer en herstellen van de bovenste fase in een nieuwe buis. </li><li> Voeg 1,25 volumes 100% ethanol (375 ul). Vortex. Toepassen op cartridge filteren en centrifugeer 15 sec bij 10000 x g. </li><li> Voeg de helft van de aanbevolen hoeveelheid miRNA Wash Oplossing 1 (350 pl) en centrifugeer 15 sec bij 10000 x g. </li><li> Voeg 10 ul DNase 1-70 pi buffer RDD (Qiagen) voor elk monster. Voeg 80 ul kolom en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg Wash Solution 1 (350 pl) en centrifugeer 15 sec bij 10.000 x g. </li><li> Voeg Wash Solution 2/3 (500 ul) en centrifugeer 15 sec bij 10.000 x g. REPEAT. </li><li> Elueer met 40 pl 95 ° C nuclease-vrij H2O </li><li> Bepaal de concentratie van het RNA en verdun het RNA tot 100 ng / ul. </li></ol> 3. miRNA profilering van Exosomes van Blood Met behulp Taqman Low Density Array (TLDA) Kaarten (~ 6,5 uur) TIPS <ul><li class="jove_content"> Bereid de ruimte voor het isoleren van RNA door het dragen van PBM, vlakken schoon te vegen en pipetten met RNase Zap, en met steriele filter tips en buizen. </li><li class="jove_content"> Pre-amplificatie (pre-amp) stap wordt aanbevolen voor 1-350 ng RNA (350-1,000 ng monsters niet pre-amp stap na cDNA synthese vereist). Het is belangrijk om te bepalen of pre-amp is noodzakelijk voor uw steekproef, omdat je alle monsters moeten behandelen onder gelijke omstandigheden. Pre-amp stap voegt kosten en de Ct-waarden hebben een lager aanvaardbaar cut off (32 ipv 40). </li><li class="jove_content"> Het is nuttig om de cDNA reactie strip buizen bereiden in plaats van een plaat, afhankelijk van het aantal kaarten die kunnen worden uitgevoerd in een enkele dag. Dit zal bevriezen en ontdooien van cDNA monsters die niet worden verwerkt op dezelfde dag minimaliseren. </li><li class="jove_content"> Exosomes verzameld uit verschillende bronnen hebben verschilhuren hoeveelheden RNA. Met dit protocol kunt maximaal 3 pi RNA template voor de synthese van cDNA reactie. Afhankelijk van de bron, de hoeveelheid exosomaal RNA die kunnen worden geïsoleerd kunnen worden beperkt. Terwijl een typische weefsel genoeg RNA zou opleveren dat cDNA zou worden gemaakt van 100 ng RNA in 3 ul volume, exosomes uit menselijk bloed of celcultuurmedia bevatten vaak minder RNA en cDNA moet worden gemaakt van minder uitgangsmateriaal. Het muizenbloed exosomes bevatten hogere niveaus van RNA en ten minste 100 ng in 3 ui kan worden verkregen. </li></ul><ol><li> Ter voorbereiding cDNA uit gezuiverde RNA met behulp van Megaplex Zwembaden reverse transcriptase primers (Poule A en Poule B bevatten primers voor de miRNAs op microfluïdische kaarten array A en B), ontdooi de reactie componenten op het ijs. </li><li> Label twee RNase-free 1,5 ml buizen voor RT-reactie met zwembad A primers of Pool B primers en componenten toe te voegen in de grafiek orde. Voeg minstens een extra hoeveelheid bestanddelen voor 2 of meer reacties of een master mix zoals door thij vendor. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> RT reactie Component </td><td> Component Concentratie </td><td> Volume voor 1 steekproef (totaal V / sample = 4,5 pi) </td></tr><tr><td> Nuclease-vrij water </td><td></td><td> 0,20 pi </td></tr><tr><td> Megaplex RT buffer (10X) </td><td> 1X </td><td> 0.80 pi </td></tr><tr><td> dNTPs (100 mM) </td><td> 4.4 mM </td><td> 0,20 pi </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 5 mM </td><td> 0.90 pi </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (20U/μl) </td><td> 2 U </td><td> 0.10 pi </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primers A of B (10X) </td><td> 1X </td><td> 0.80 pi </td></tr><tr><td> MultiScribe reverse transcriptase </td><td> 75 U </td><td> 1.50 pi </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Omkeren buizen 6 keer en centrifuge kort. Dan, pipet 4,5 pi RT-reactie mengsel in MicroAmp 8-tube strips of een 96-wells MicroAmp optische reactie plaat. </li><li> Voeg 100 ng RNA en het volume op 3 pi met DEPC behandeld water of voeg 3 ul totaal RNA, roer met de pipet tip, en sluit de buizen of platen. Spin kort en incubeer op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> Laad de reactie in de PCR-apparaat en voer het uit onder de volgende voorwaarden (zoals aanbevolen door de Applied Biosystems Megaplex Zwembaden protocol): </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Stadium </td><td> Temp </td><td> Tijd </td></tr><tr><td> Cyclus (40x) </td><td> 16 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td></td><td> 42 ° C </td><td> 1 min </td></tr><tr><td></td><td> 50 ° C </td><td> 1 sec </td></tr><tr><td> Houden </td><td> 85 ° C </td><td> 5 min </td></tr><tr><td> Houden </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> WINKEL cDNA bij -20 ° C (goed tenminste een week) of blijven pre-Amp stap kan worden opgeslagen gedurende een week. </li><li> Ontdooien PreAmp primers voor Poule A en Poule B op ijs en zwenken om te mengen. Werveling Taqman Pre-Amp meester mixen en te houden op het ijs ook. </li><li> Volg de grafiek toevoegen van ten minste een extra volume van componenten voor 2 of meer reacties of maak een master mix zoals aanbevolen door de leverancier. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Pre-Amp Reactie Component </td><td> Volume voor 1 steekproef </td></tr><tr><td> Nuclease-vrij water </td><td> 7,5 pl </td></tr><tr><td> Taqman PreAmp Master Mix (2X) </td><td> 12,5 ul </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Primers A of B (10X) </td><td> 2,5 pl </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> Pipetteer 2,5 pl RT product in MicroAmp 8-tube strips of een 96-wells MicroAmp optische reactie plaat en afzien van 22,5 ul PreAmp reactiemix in elk putje. </li><li> Seal de plaat, incubeer op ijs 5 min en dan laadt het monster in de PCR-apparaat. Uitgevoerd onder de volgende omstandigheden. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Stadium </td><td> Temp </td><td> Tijd </td></tr><tr><td> Houden </td><td> 95 ° C </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> Houden </td><td> 55 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Houden </td><td> 72 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Cyclus (12x) </td><td> 95 ° C </td><td> 15 sec </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> 4 min </td></tr><tr><td> Houden </td><td> 99.9 ° C </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> Houden </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="11"><li> Na de voorversterker reactie is voltooid, kort de buizen of platen gecentrifugeerd en vervolgens voeg 75 ul 0.1X TE pH 8,0 aan elk putje of buis. </li><li> Verzegelen en mix en spin kort. Bewaar het verdunde product gedurende een week bij -20 ° C of verder naar de plaat te laden. </li><li> Combineren de volgende in een RNase-free 1.5 ml buis op ijs. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Volume voor 1 kaart </td></tr><tr><td> TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2X) </td><td> 450 pl </td></tr><tr><td> Verdunde voorversterker product </td><td> 9 pl </td></tr><tr><td> Nuclease-vrij water </td><td> 441 pl </td></tr></tbody></table><ol start="14"><li> Omkeren van de buis te mengen en centrifuge kort. Verdeel 100 pi PCR-mix in elke haven van de Taqman MicroRNA Array kaart. </li><li> Centrifugeer de kaart 2 x 1.000 x g gedurende 1 min. Sluit de kaart en voer het uit met behulp van de sjabloon van de primers in de Applied Biosystems handleiding en de 384 goed Taqman Low Density Array instellingen. We maken gebruik van Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR-systeem. </li></ol> 4. mRNA analyse door Taqman (~ 1,5 uur) <ol><li> Om qPCR reactie te bereiden, meng de reactie componenten in de volgorde in de grafiek. Alle monsters worden geanalyseerd met primer probes voor het gen van belang evenals 18S rRNA als de normalizer gen. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Taqman Reaction Component </td><td> Volume voor 1 steekproef </td></tr><tr><td> Nuclease-vrij water </td><td> 7 pl (aanpassen op basis van individuele steekproef) </td></tr><tr><td> Taqman Fast Master Mix (2X) </td><td> 10 gl </td></tr><tr><td> TaqMan Primer sondes (20x) </td><td> 1 ui </td></tr><tr><td> cDNA van 100 ng RNA </td><td> 2 &amp; mu, L (aanpassen op basis van individuele steekproef) </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Voer de 96 wells plaat met behulp van de Fast 96-blok, zoals aanbevolen door de fabrikant (Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System). </li></ol>

<ol><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Mendell, J. T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+stress+signaling+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in stress signaling and human disease.</a> Cell. 148, 1172-1187 (2012).</li>
<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNAs+in+serum%3A+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell research. 18, 997-1006 (2008).</li>
<li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PloS one. 3, e3148(2008).</li>
<li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nature. 2, 282(2011).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li>
<li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).</li>
<li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li>
<li>Ramachandran, S., Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+transfer+of+RNAs%3A+exosomes+as+mediators+of+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev.+RNA%22%5BJournal%5D)">Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication.</a> Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).</li>
<li>Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+intercellular+signalosomes+and+pharmacological+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors.</a> Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).</li>
<li>Ludwig, A. K., Giebel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+small+vesicles+participating+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22(2006).</li>
<li>Masyuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+exosomes+influence+cholangiocyte+regulatory+mechanisms+and+proliferation+through+interaction+with+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Gastrointestinal+and+liver+physiology%22%5BJournal%5D)">Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).</li>
<li>Fauré, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+are+released+by+cultured+cortical+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Exosomes are released by cultured cortical neurones.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).</li>
<li>Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+microvesicles+contain+DNA%2FRNA+and+convey+biological+messages+to+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells.</a> PloS one. 7, e34653(2012).</li>
<li>Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+proteomic+insights+and+diagnostic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential.</a> Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).</li>
<li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).</li>
<li>El-Andaloussi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+delivery+of+siRNA+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo.</a> Nature. 7, 2112-2126 (2012).</li>
<li>Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+isolated+from+mycobacteria-infected+mice+or+cultured+macrophages+can+recruit+and+activate+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 189, 777-785 (2012).</li>
<li>Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microRNA%3A+A+new+source+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular microRNA: A new source of biomarkers.</a> Mutat. Res. , (2011).</li>
<li>Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+LNA+in+microRNA-based+cancer+diagnostics+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics.</a> Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).</li>
<li>Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExoCarta+2012%3A+database+of+exosomal+proteins%2C+RNA+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids.</a> Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

In dit protocol, tonen we de kwantificering van miRNAs en mRNA&#39;s van exosomes gezuiverd door differentiële centrifugatie uit bloed en cultuur media. Exosomes hebben verschillende componenten afhankelijk van hun oorsprong en zijn betrokken bij een aantal biologische functies, waaronder immuunrespons antigeenpresentatie, intracellulaire communicatie, en de overdracht van RNA en eiwitten 9,11,12,19,20. Terwijl and size bepalend is exosome zuiverheid, een aantal documenten met EM-gegevens van exosomes blijkt ...

Korte noncoding miRNAs moduleren genexpressie door te binden aan het doelwit mRNA. Zaad sequentiecomplementariteit van ~ 7 basenparen kunnen miRNA te binden aan het doel-mRNA resulteert in de remming van translatie of vermindering van de stabiliteit van het mRNA, die beide kunnen leiden tot verminderde expressie van het doeleiwit 1. Onderzoek van de afgelopen tien jaar heeft ondubbelzinnig een fundamentele rol voor miRNAs bewezen in het bemiddelen cellulaire functies. Er is ook een aanzienlijke inspanning gericht op het ontleden van miRNA gemedieerde moleculaire veranderingen ten grondslag liggen aan diverse ziekten 2,3. Bovendien recente identificatie van stabiele miRNAs in lichaamsvloeistoffen 4-6 maakte de weg vrij voor het gebruik ervan als nieuwe biomarkers vatbaar voor klinische diagnose. Het ene vervoermiddel miRNA in lichaamsvloeistoffen is via exosomes, kleine blaasjes die mRNA&#39;s dragen, proteïnen, lipiden bemiddelaars, en miRNAs aan ontvanger cellen via systemische bloion 7-14. Dit resulteert in modulatie van genexpressie in ontvangende cellen en vertegenwoordigt een nieuw mechanisme van cellulaire communicatie. Bijvoorbeeld kunnen cellen immuun-regulerende processen moduleren secreteren en / of absorberen van exosomen bevattende biomoleculen van inflammatie zoals interleukine-1β (IL1β), tumor necrosis factor-α (TNFa), transformerende groeifactor-β5 (TGFβ5) en de miRNAs dat deze genen reguleren 13. Zoals afwijkende miRNA expressie is een gemeenschappelijk kenmerk in een verscheidenheid van ziekten bij de mens, deze moleculen bieden opwindende nieuwe mogelijkheden voor de ontdekking en validatie van nieuwe therapeutische doelwitten 2. Circulerende miRNAs zijn in alle lichaamsvloeistoffen en het is bekend dat de samenstelling van exosomes verschilt zich uitgaande van de cellen waaruit ze werden vrijgelaten. Zo bieden zij een laan naar de fysiologische toestand van de cellen te bestuderen en hoe de cellen zelfs alter signaleringts in reactie op stress, waaronder ziekten. Studeren veranderingen in exosome samenstelling kan inzicht geven in signaaltransductie en onderzoeken hun potentiële nut als biomarkers of therapeutische interventie routes. Hier zullen we de zuivering van exosomes uit meerdere bronnen op basis van gepubliceerde protocollen te tonen. Deze exosomes zullen worden gebruikt voor RNA-isolatie gevolgd door qPCR om de niveaus van miRNAs in de exosomes identificeren en te meten.

<table><tbody><tr><td>EDTA coated vacutainer (10 ml tubes)</td><td>BD Diagnostics</td><td>366643</td><td>Voor exosoombepaling uit menselijk bloed</td></tr><tr><td>EDTA coated vacutainer (2 ml tubes)</td><td>BD Diagnostics</td><td>367841</td><td>Voor exosoombepaling uit muisbloed</td></tr><tr><td>PAXgene Blood RNA Tube</td><td>BD Diagnostics</td><td>762165</td><td>Voor miRNA isolatie uit totaal bloed</td></tr><tr><td>miRVana microRNA isolation kit</td><td>Ambion</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol: CHCl3</td><td>Ambion</td><td>9721G</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4326614</td><td>Voor TLDA-kaarten</td></tr><tr><td>Megaplex RT rodent Pool Set v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444746</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex preamp rodent Pool set v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444747</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444909</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT Human Pool set V3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444745</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex Preamp human pool set v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444748</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444913</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA RT kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman fast universal PCR master mix </td><td>Applied Biosystems</td><td>4366072</td><td>Voor mRNA qRT-PCR</td></tr><tr><td>Tumor necrosis factor (primer probe)</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs01113624_g1</td><td></td></tr><tr><td>Vascular endothelial growth factor A (primer probe)</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs00900055_m1</td><td></td></tr><tr><td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1642</td><td>Voor mRNA</td></tr><tr><td>HSP70 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab94368</td><td>Voor western blot</td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG-Gold</td><td>Sigma</td><td>G7402</td><td>Voor elektronenmicroscopie</td></tr><tr><td>Rabbit-anti CD81</td><td>Sigma</td><td>SAB3500454</td><td></td></tr><tr><td>Nickel 300 mesh carbon formvar grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FCF300-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Copper 300 mesh carbon formvar grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 1. Tabel van specifieke reagentia.</td></tr></tbody></table>

zuivering en microrna profilering van exosomes afgeleid van blood en cultuur media

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Stabiele miRNA&#39;s zijn aanwezig in alle lichaamsvloeistoffen en sommige circulerende miRNA&#39;s worden beschermd tegen afbraak door vastlegging in kleine blaasjes genaamd exosomes. Exosomes kunnen fuseren met de plasmamembraan leidt tot de overdracht van RNA en eiwitten aan de doelcel. Hun biologische functies zijn immuunrespons antigeenpresentatie en intracellulaire communicatie. Levering van miRNAs die genexpressie kan reguleren in de ontvangende cellen via het bloed heeft nieuwe wegen voor doel interventie geopend. Naast het aanbieden van een strategie voor de levering van drugs of RNA therapeutische middelen, kunnen exosomaal inhoud dienen als biomarkers die kunnen helpen bij de diagnose, het bepalen van behandelingsmogelijkheden en prognose. Hier zullen we de procedure beschrijven voor het kwantitatief analyseren van miRNAs en messenger RNA (mRNA) uit exosomes uitgescheiden in het bloed en de media voor celkweek. Gezuiverde exosomes zal worden gekarakteriseerd met behulp van western blot analyse voor exosomal markers en PCR voor mRNA&#39;s die van belang zijn. Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en immuno labeling wordt gebruikt om exosomal morfologie en integriteit valideren. Totaal RNA wordt gezuiverd van deze exosomes om ervoor te zorgen dat we zowel mRNA en miRNA uit hetzelfde monster kunnen bestuderen. Na RNA integriteit valideren door Bioanalyzer, zullen we een middelgrote doorvoer kwantitatieve real time PCR (qPCR) uit te voeren om de exosomaal miRNA met Taqman Low Density Array (TLDA) kaarten en genexpressie studies voor transcripties van belang te identificeren. Deze protocollen kunnen worden gebruikt om wijzigingen in exosomal miRNAs kwantificeren patiënten diermodellen en celkweekmedium voor en na farmacologische interventie. Exosomaal inhoud variëren afhankelijk van de bron van herkomst en de fysiologische omstandigheden van cellen die afscheiden exosomes. Deze variaties kunnen inzicht geven over hoe cellen en systemen omgaan met stress of fysiologische verstoringen. Onze representatieve gegevens tonen variations in miRNAs presenteren exosomes gezuiverd uit muizen bloed, menselijk bloed en menselijke celkweek media. Hier zullen we de procedure beschrijven voor het kwantitatief analyseren van miRNAs en messenger RNA (mRNA) uit exosomes uitgescheiden in het bloed en de media voor celkweek. Gezuiverde exosomes zal worden gekarakteriseerd met behulp van western blot analyse voor exosomaal markers en PCR voor mRNA&#39;s van belang zijn. Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en immuno labeling wordt gebruikt om exosomal morfologie en integriteit valideren. Totaal RNA wordt gezuiverd van deze exosomes om ervoor te zorgen dat we zowel mRNA en miRNA uit hetzelfde monster kunnen bestuderen. Na RNA integriteit valideren door Bioanalyzer, zullen we een middelgrote doorvoer kwantitatieve real time PCR (qPCR) uit te voeren om de exosomaal miRNA met Taqman Low Density Array (TLDA) kaarten en genexpressie studies voor transcripties van belang te identificeren. Deze protocollen kunnen worden gebruikt om veranderingen in exosomaal miRNAs kwantificeren in patiënten, knaagdier modellen en celcultuurmedia voor en na farmacologische interventie. Exosomaal inhoud variëren afhankelijk van de bron van herkomst en de fysiologische omstandigheden van cellen die afscheiden exosomes. Deze variaties kunnen inzicht geven over hoe cellen en systemen omgaan met stress of fysiologische verstoringen. Onze representatieve gegevens tonen variaties in miRNAs presenteren exosomes gezuiverd uit muizen bloed, menselijk bloed en menselijke celcultuurmedia

Na scheiding van exosomen uit bloed of celkweek media, kan de zuiverheid van de exosomes worden getest door elektronenmicroscopie (EM) en western blot (Figuren 1A en 1B). We bevestigden onze exosome preparaten uit verschillende bronnen met EM en western blot met verschillende antilichamen. Figuur 1A toont EM beelden bevestigen dat exosomes intact met een diameter van ~ 30 -100 nm en bevatten CD81 door immuno labeling. Veelgebruikte exosomaal markers zijn Hsp70 en tetras...

De aanwezigheid van stabiele microRNA (miRNA) in exosomes heeft immense belangstelling gegenereerd als een nieuwe wijze van intercellulaire communicatie, voor hun potentiële nut als biomarkers en als een route voor therapeutische interventie. Hier laten we zien exosome zuivering van het bloed en de cultuur media, gevolgd door kwantitatieve PCR om miRNA&#39;s worden vervoerd identificeren.

Zuivering en microRNA Profilering van Exosomes Afgeleid van Blood en cultuur Media

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren en kwantificeren van microRNA's die aanwezig zijn in exosomen verkregen uit bloed of celkweekmedia. Dit wordt bereikt door eerst exosomen uit bloed of celkweekmedia te zuiveren met behulp van differentiële centrifugatie. De tweede stap is het zuiveren van totaal exosomaal RNA met behulp van een nirvana micro RNA-isolatiekit.Nadat de integriteit en concentratie van het gezuiverde RNA zijn bevestigd, wordt dit omgezet in cDNA met behulp van reagentia uit de Megaplex reverse transcriptase reactieset. Vervolgens wordt een pre-amplificatiestap uitgevoerd met Megaplex preamp-primers en TaqMan preamp master mix. Om de microRNA's te amplificeren, is de laatste stap het uitvoeren van een realtime PCR-reactie met gebruik van 384-well microfluïdische kaarten of TaqMan low-density array-kaarten die gedroogde TaqMan-primerprobes bevatten.Uiteindelijk maakt deze procedure de detectie van maximaal 758 bekende microRNA's mogelijk. Deze techniek meet variaties in het exosomale microRNA-gehalte die afhankelijk zijn van de bron en de fysiologische omstandigheden waaronder ze worden uitgescheiden. De implicaties van het kwantificeren van deze u

purification-microrna-profiling-exosomes-derived-from-blood-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze paper toont voor de isolering, zuivering en detectie van exosomes, evenals technieken voor de analyse van hun moleculaire inhoud. Deze methoden zijn aanpasbaar voor exosome isolatie van zowel de media voor celkweek en biologische vloeistoffen, en kan daarna analyse van moleculaire content ook nuttig zijn in functionele studies.

Isolatie en karakterisatie van RNA-bevattende Exosomes

Technieken die een gradiëntprocedure beschrijven om exosomen te scheiden van humaan immunodeficiëntievirus (HIV) deeltjes worden beschreven. Deze procedure werd gebruikt om exosomen te isoleren van HIV-deeltjes in menselijk plasma van met HIV geïnfecteerde personen. De geïsoleerde exosomen werden geanalyseerd op cytokine/chemokine-gehalte.

Isolatie van exosomen uit het plasma van HIV-1 positieve personen

Galvocht is een waardevolle bron van extracellulaire vesiclen/exosomen die potentieel belangrijke biomarkers bevatten. Dit protocol vertegenwoordigt een robuuste methode om exosomen uit menselijk gal te isoleren voor verdere analyses, inclusief miRNA-profilering.

Isolatie en profilering van MicroRNA-bevattende exosomes van Human Bile

MicroRNAs spelen een belangrijke regulerende rol en zijn in opkomst als nieuwe therapeutische doelen voor verschillende ziekten bij de mens. Het is aangetoond dat miRNAs worden vervoerd in high density lipoproteïnen. Wij hebben een eenvoudige methode om gezuiverd HDL geschikt voor miRNA analyse uit menselijk plasma snel isoleren ontwikkeld.

Snelle en vereenvoudigde methode voor High Through-put Isolatie van miRNA uit Highly Purified high density lipoproteïne

Extracellulaire vesicules in bloed zijn voorgesteld als nieuwe biomarkers voor verschillende ziekten. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van grote plasmamembraan-afgeleide microvesicles uit perifere bloedmonsters en hun daaropvolgende analyse door conventionele flowcytometrie en Western Blotting.

Isolatie en karakterisering van microvesicles uit perifeer bloed

Hier presenteren we een protocol om te zuiveren van exosomes van plasma en serum met verminderde CO zuivering van niet-exosomal bloedeiwitten. Het geoptimaliseerde protocol bevat ultrafiltratie, protease behandeling en grootte uitsluiting chromatografie. Verbeterde zuivering van exosomes voordelen downstream analyses, met inbegrip van nauwkeuriger kwantificering van blaasjes en proteomic karakterisering.

Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum

Hier beschrijven we twee extracellulaire vesikel isolatie protocollen, ultrafiltratie centrifugeren en ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren, te isoleren van extracellulaire blaasjes van lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeibare steekproeven. De extracellulaire blaasjes lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeistof door beide methoden afgeleid zijn gekwantificeerd en gekenmerkt.

Isolatie van extracellulaire blaasjes aan de lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof met behulp van een techniek van ultrafiltratie centrifugeren

Dit protocol laat zien hoe om te zuiveren van extracellulaire microRNAs van cel voedingsbodems voor kleine RNA bibliotheek constructie en de volgende generatie sequencing. Verschillende kwaliteitscontrole controlepunten worden beschreven om lezers te begrijpen wat u kunt verwachten wanneer u werkt met lage input monsters als exRNAs.

Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen

Een exosome is een nieuwe generatie van drug delivery vervoerders. Wij opgericht een protocol exosome isolatie met een hoge opbrengst en zuiverheid voor siRNA levering. Wij ook ingekapseld fluorescently geëtiketteerde aspecifieke siRNA in exosomes en onderzocht de cellulaire opname van siRNA-geladen exosomes in kankercellen.

Voorbereiding van Exosomes van siRNA levering aan kankercellen

Dit protocol illustreert de 1) de isolatie en kweek van primaire fibroblasten uit de gastrocnemius-spier van volwassen muizen, evenals 2) zuivering en karakterisering van exosomen met behulp van een differentiële ultracentrifugatiemethode in combinatie met sucrosedichtheidsgradiënten gevolgd door western blot-analyses.

Isolatie en karakterisering van exosomen uit skeletspierfibroblasten

Leer exosoomzuivering en microRNA-profielanalyse uit bloed en celkweekmedia via differentiële centrifugatie. Deze methode detecteert tot 758 microRNAs voor biomarkeronderzoek en therapeutische toepassingen.

Zuivering en microRNA Profilering van Exosomes Afgeleid van Blood en cultuur Media

Meer video's verkennen