Chicken Embryo Spinal Cord Slice Cultuur Protocol

Het algemene doel van deze procedure is het kweken van plakjes kippenembryo om een normale neuronale ontwikkeling te behouden, in het bijzonder van spinale motorneuronen. Dit wordt bereikt door eerst het kippenembryo te dissekeren om de visceraal organen te verwijderen. De tweede stap is het voorbereiden en in plakjes snijden van het embryo dat is ingebed in een agarblok.

Vervolgens wordt de embryonale slice voorzichtig uit de agar verwijderd. De laatste stap is het overbrengen van de embryonale slice naar een kweekmedium, dat 24 uur lang wordt geïncubeerd bij 37 °C. Ten slotte wordt immunofluorescentiemicroscopie op dunne coupes van de embryonale slice gebruikt om de aanwezigheid en locatie van spinale motorneuronen na de kweekperiode aan te tonen.

Deze methode kan dus helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de ontwikkelingsneurobiologie. Denk hierbij bijvoorbeeld aan de mechanismen en moleculen die betrokken zijn bij de migratie van spinale motorneuronen. In het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat er tijdens de dissectiefases van het protocol veel zorgvuldigheid vereist is.

Plaats 10 bevruchte eieren met de langste zijde horizontaal in een incubator met geforceerde luchtstroom bij 38 °C tot ze het hamburger-stadium en Hamilton-stadium 24 bereiken. Dit vereist gewoonlijk ongeveer vier dagen incubatie. Steriliseer op de tweede dag van de incubatie de eierschaal door deze af te vegen met een papieren tissue gedrenkt in 70% Ethanol; doorboor vervolgens voorzichtig het platte uiteinde van de eierschaal met een 21 gauge naald bevestigd aan een spuit van 5 mL en verwijder 5 mL albumine.

Dit verlaagt het embryo weg van de schaal, zodat het embryo niet beschadigd raakt wanneer de schaal wordt geopend. Plaats de eieren terug in de incubator en laat ze nog twee dagen incuberen. Nadat deze twee dagen zijn verstreken, gebruikt u stomp.

Ga verder. Nummer vijf, gebruik een pincet om voorzichtig in het midden van de bovenkant van de schaal te prikken en verwijder een stuk schaal van ongeveer negen vierkante centimeter. Snijd rondom het embryo, til het embryo voorzichtig uit en plaats het in HBSS.

Voor dissectie. Alle gebruikte embryo's moeten zich in de buurt van stadium 24 bevinden. Alle embryo's die tekenen van abnormaliteit vertonen, moeten worden weggegooid.

Plaats de schaal met het embryo onder een dissectiemicroscoop. Gebruik twee dubbele nummer vijf pincetten om het amnionmembraan, het chorionmembraan, de allantoïs en het hoofd te verwijderen. Eviscereer vervolgens het embryo om alle interne organen te verwijderen door met micro-dissectiescharen de ventrale middellijn van het embryo open te knippen.

Houd vervolgens het embryo vast bij de rostrale rompstreek met één pincet. Pak het rostrale deel van het darmkanaal en het hart vast en trek deze voorzichtig weg. De somieten van het embryo moeten nu duidelijk zichtbaar zijn.

Trim nu de thoraxwand met microdissectieschaartjes. Snijd vervolgens het embryo transversaal doormidden tussen de knopjes van de boven- en onderledematen. Verwijder voorzichtig de lumbale helft van het gedisseceerde embryo door met twee pincetten het embryo uit de dissectieoplossing te tillen en plaats dit in een droge Petrischaal met behulp van een wegwerppastepipet van ongeveer vijf centimeter.

Snijd vanaf de onderkant en aspireer ongeveer twee milliliter gesmolten 4% gewicht per volume agarose in PBS. Pipetteer ongeveer 0,5 milliliter agarose bovenop het embryo en zuig vervolgens het stuk embryo in de pipet op. Breng het embryo en de agarose over naar een afpelbare plastic mal zonder luchtbellen in de agarose te introduceren.

Laat het embryo voorzichtig naar de bodem van de aros in de plastic mal zakken, met de thoraxsectie naar beneden gericht, en gebruik een naald van 25 gauge om ervoor te zorgen dat het embryo recht ligt. De aros bevat ook een deel van de ontwikkelende ledemaat en het is belangrijk dat de embryo's verticaal in de aros worden geplaatst om dit mogelijk te maken; plaats de plastic mal gedurende ongeveer twee minuten op ijs. Let bij het fixeren van de aros erop dat het embryo tijdens deze periode niet van oriëntatie verandert.

Stel een VT 1000 S soortgelijk in, zodat de kamer is gevuld met HBSS en omringd is door ijskoud water. Gebruik secondelijm om het agarblok op het Vibram-platform te bevestigen en trim het blok vervolgens met een scheermesje, zodat het embryo-stuk wordt omringd door één tot drie millimeter agar.

Start de vibratoom en begin met het snijden van het embryo. De plakjes die secties van de ledemaatknop bevatten met een duidelijke apicale ectodermale lijst worden geselecteerd en vervolgens overgebracht naar een schaal met HBSS. Over het algemeen zijn er slechts één tot twee geschikte plakjes per embryo.

Verwijder voorzichtig de agarose rond de weefselsneden met behulp van twee naalden. Het is essentieel dat dit grondig en zorgvuldig gebeurt. Voeg 500 µL cultuuroplossing toe aan het benodigde aantal wells van een 24-well ultra low attachment weefselkweekplaat.

Breng de plakjes voorzichtig over van de HBSS-oplossing naar de well, waarbij twee of drie plakjes per well worden geplaatst. Plaats de 24-wells plaat vervolgens in de weefselkweekincubator bij 37 °C met 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur. Voeg na de kweekperiode 500 µL ongebufferde fixeeroplossing toe aan elke well met embryonale plakjes en laat dit 20 minuten op ijs staan. Aspireer vervolgens voorzichtig de volledige oplossing en was drie keer in PBS met intervallen van vijf minuten. Voeg daarna 30% sucrose in PBS toe aan de wells en plaats de plaat bij 4 °C gedurende ongeveer zes uur of langer, totdat de plakjes naar beneden zakken.

Nadat de coupes zijn gezonken, verplaatst u de coupes naar een schone Petrischaal van 10 centimeter en dept u het overtollige sucrose-oplossing weg. Voeg vervolgens één milliliter OCT toe en laat de coupes vijf minuten equilibreren bij 20 °C. Monteer elke coupe vlak in een met OCT gevulde, afpelbare plastic mal na de montage.

Plaats de mallen verticaal op droogijs om de OCT-blokken te verstevigen, monteer ze op de cryostaat en laat de blokken ongeveer 20 minuten equilibreren bij minus 24 °C. Snijd vervolgens elke plak in secties van 15 micron en monteer deze op Superfrost Plus-objectglazen. De objectglazen kunnen worden bewaard bij minus 80 °C tot ze nodig zijn voor immunofluorescentiekleuring, zoals beschreven in het tekstgedeelte van het protocol; deze afbeelding toont de status van de generatie van de laterale motorische kolom bij Hamburger en Hamilton stadium 24.

De laterale onderverdeling van de laterale motorische kolom wordt gevisualiseerd door LH X one-kleuring in het linkerpaneel. De laterale motorische kolom wordt gevisualiseerd door kleuring met Fox P one in het middenpaneel en het rechterpaneel is een samenvoeging van de twee kanalen. De middellijn wordt weergegeven als een stippellijn en DV duidt hier de dorsoventrale as aan.

De status van de laterale divisie van de laterale motorische kolom wordt in het linkerpaneel opnieuw aangetoond door LH X one-kleuring en de laterale motorische kolom door Fox P one-kleuring in het middelste paneel, met de samengevoegde afbeelding rechts. Deze afbeeldingen tonen de ontwikkeling in stadium 27. Deze afbeeldingen tonen LH X one-expressie links en Fox P one-expressie in het middelste paneel in secties van een slice-cultuur in een medium dat het overleven van gedissocieerde craniale motorische neuroncellen ondersteunt.

LH X one wordt niet langer tot expressie gebracht in motorneuronen, hoewel er enige overleving van LMC-cellen is, aangetoond door Fox P one-expressie. DV stelt de oriëntatie van de dorso-ventrale as van het ruggenmerg voor, en ML stelt de oriëntatie van de medio-laterale as van de laterale motorische kolom van het ruggenmerg voor. Cellen van de laterale divisie, opnieuw gekleurd voor LH X one in het ventrale hoorn in het linkerpaneel en de LMC in het algemeen gekleurd voor Fox P one in het middenpaneel, kunnen worden waargenomen in coupes, gekweekt in medium bevattend 4% kkipserum en 100 nanograms per milliliter CNTF.

Let op dat sommige cellen van de laterale divisie van de laterale motorische kolom zich in een laterale positie in het ventrale hoorn bevinden, zoals aangegeven door de pijl in het linkerpaneel. Deze afbeelding toont de expressiestatus van LHX1 en FoxP1 in secties van een embryo dat in ovo is gehouden tijdens de plakcultuur van het eerder getoonde embryo. Dit histogram toont de resultaten van de kwantificering van het percentage cellen van de laterale divisie van de laterale motorische kolom, die positief kleuren voor FOXP1 en LHX1, versus cellen van de laterale motorische kolom, die positief kleuren voor FOXP1 en LHX1.

Negatieve gegevens worden getoond voor cellen in slice-culturen onder verschillende condities vergeleken met controle-embryo's die in ovo zijn gehouden, welke 100% vertegenwoordigen; de gegevens werden geanalyseerd met behulp van de t-toets van Student. De drievoudige asterisk staat voor een significantieniveau van minder dan 0,01. Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om voorzichtig te zijn bij het dissecteren van het embryo en bij het verwijderen van de agros uit de slices, omdat het essentieel is om de integriteit van de motorische axonen in de ledematenknop te behouden.