Name: Chicken Embryo Spinal Cord Slice Cultuur Protocol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Leer het kweken van kippenembryo-spinaalschijven voor de ontwikkeling van spinale motorneuronen. Deze methode ondersteunt normale neuronale ontwikkeling gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen Sharon Boast bedanken voor vele inzichtelijke discussies en B. Novitch voor het soort geschenk van de antilichamen tegen FOXP1. Dit werk als gefinancierd door een studententijd van de Wellcome Trust KCT en een projectsubsidie ​​van de Wellcome Trust SRP (Grant referentienummer 094399/B/10/Z).

1. Breng de gewenste oplossingen <ol><li> 1 M fosfaatbuffer:. Weeg 109,4 g Na 2 HPO 4 en 32 g NaH 2 PO 4 H 2 0, mengen en oplossen in water tot het totale volume van 1 liter. </li><li> Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS): Bereid 0,1 M fosfaatbuffer, 0,15 M NaCl. 100 ml PBS voldoende is om de verwerking van segmenten van 10 embryo&#39;s. </li><li> Agarose: Heat PBS oplossing tot ongeveer 70 ° C en voeg vaste lage smelttemperatuur agarose langzaam roeren continu. Om de oplossing tot een eindconcentratie van 4% (w / v) agarose. Een voorraad van 50 ml van deze oplossing. Laat deze oplossing in een waterbad gehouden op 48 ° C tot nodig. Elke agarose oplossing ongebruikte na het experiment kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele weken. </li><li> Antilichaam blokkeeroplossing: Voeg foetaal kalfsserum en triton X-100 tot een uiteindelijke concentratie van 1% (v / v) foetaal kalfserum, 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS. 10 ml blokkeeroplossing voldoende voor de immunokleuring van 5 dia&#39;s cryostaatsecties. </li><li> Vast: Bereid 0,75 mm NaOH, 4% (w / v) paraformaldehyde (LET). Om fixeermiddel benodigde warmte hoeveelheid water te bereiden tot 70 ° C, geconcentreerd NaOH aan gewenste eindconcentratie vaste paraformaldehyde en meng tot opgelost voegen. Afkoelen op ijs tot 4 ° C. 10 ml van deze oplossing voldoende voor 20 putjes van embryo plakken. </li><li> Sucroseoplossing: Bereid 10 ml van een 30% (w / v) sucrose oplossing die 0,1 M fosfaatbuffer. 10 ml van deze oplossing voldoende voor 10 putjes van embryo plakken. </li><li> 70% (v / v) ethanol. Verdun 70 ml absolute ethanol met 30 ml water. </li><li> Kweekmedium: Bereid een oplossing van 1% kippenembryo extract, 1% penicilline / streptomycine, 0,35% L-Glutamine, 0,1% 2-mercaptoethanol, 4% kip serum, 2% B27 supplement en 100 ng / ml ciliaryneurotrophic groeifactor (CNTF) alle verdund in neurobasal medium; voorbereid op ijs en gebruikt dezelfde dag. 10 ml kweekmedium vereist voor 20 putjes van embryo plakken. </li></ol> 2. Chick Embryo Voorbereiding <ol><li> Place bevruchte kippen eieren met de langste zijde horizontaal in een luchtstroom incubator bij 38 ° C totdat zij ontwikkelen 15 24 fase. Dit vereist gewoonlijk ongeveer 4 dagen incubatie. </li><li> Op de tweede dag van de incubatie, steriliseren de eischaal schoon met een papieren zakdoekje gedrenkt in 70% ethanol. Voorzichtig doorboren het platte uiteinde van de eierschaal met behulp van een 21 gauge naald bevestigd aan een 5 ml spuit en verwijder 5 ml albumine. Dit verlaagt de embryo weg van het reservoir zodat het embryo niet beschadigd wanneer het reservoir wordt geopend. Zet de eieren in de incubator en incubeer ze nog 2 dagen. </li><li> Met stompe dumont # 5 forceps carefully doorboren de top midden van de schaal en verwijder ongeveer 9 cm 2 van shell. Snijd rond het embryo en til het embryo en de plaats in HBSS tijdens dissectie. De embryo&#39;s worden opgevoerd volgens Hamburger en Hamilton (1992) 15. Alle gebruikte&#39;s moeten op bijna trap 24. Elk embryo&#39;s die geen tekenen van abnormaliteit vertonen moet worden weggegooid. </li><li> Verwijder de amnion membraan, chorio-allantoïsche membraan, het hoofd, en allantois met behulp van twee dumont # 5 pincet. Eviscerate het embryo om alle interne organen te verwijderen. Om dit te doen, opengesneden het ventrale middellijn van het embryo met micro ontleden schaar, houdt u de embryo rond de rostrale stam regio met een pincet, pak de rostrale deel van de darm en het hart en trek caudaal. Het is belangrijk dat deze netjes gedaan. U moet in staat zijn om te zien het embryo somieten duidelijk. Snijd de embryo in half, dwars tussen de bovenste en onderste ledematen buds.Now trimmen de borst lichaamwand met microdissectie schaar. </li></ol> 3. Embryo Slice Voorbereiding <ol><li> Verwijder de agarose oplossing uit het waterbad. Knip 5 cm van de bodem van een wegwerp 3 ml plastic Pasteur pipet. </li><li> Verwijder voorzichtig de lumbale helft van de ontleed embryo met behulp van twee tangen to cradle het embryo uit de dissectie oplossing in een droge petrischaal. Met de Pasteur pipet verwijderd ongeveer 2 ml agarose, pipet ongeveer 0,5 ml bovenop het embryo en het embryo zuigen segment in de pipet. Breng de embryo en agarose een pellen plastic mal zorgen dat er geen luchtbellen te introduceren in de agarose. Voorzichtig de embryo naar de bodem van de agarose in de plastic mal met de thoracale deel naar beneden. Het embryo moet worden geplaatst om recht worden met behulp van een 21 gauge naald. De schijfjes bevat ook een deel van de zich ontwikkelende onderdeel en het is belangrijk dat de oriëntatie van het embryo in de agarose dit toestaan. Plaats de boot op het ijs om de agarose in te stellen. Zorg ervoor dat het embryo niet oriëntatie veranderen tijdens deze periode (ongeveer 2 minuten). </li><li> De Leica VT1000S vibratome (Speed ​​3, Frequentie 4, 400 um dikke plakken) moet worden opgezet met het snijden kamer gevuld met HBSS en omringd door ijskoud water. De agarose blok wordt dan vast aan de vibratome platform met superlijm. De agarose blok wordt afgezet met een scheermesje om de embryo stuk reactie met 1-3 mm van agarose omringt. De segmenten die ledematen deel omvat met een duidelijke apicale ectodermale Rigde worden geselecteerd en deze schijfjes worden vervolgens in HBSS. Algemeen zijn er een tot twee geschikte segmenten per embryo. Verwijder voorzichtig de agarose rond de weefselcoupes met twee naalden. Het is essentieel dat dit grondig en zorgvuldig. </li></ol> 4. Het kweken van embryo Slices <ol><li> 500 ml kweekoplossing (hierboven beschreven) aan de required aantal putjes van een 24-wells ultra lage gehechtheid behandeld weefselkweek plaat. Zorgvuldig Breng de plakjes uit de HBSS oplossing in de put. In het algemeen proberen we twee tot drie sneetjes in elk putje hebben. Plaats de 24-well plaat in de weefselcultuurincubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 24 uur. </li></ol> 5. Snijden de Slices voor Immunokleuring <ol><li> Na de kweekperiode voeg 500 ul ongebufferde oplossing aan elk putje van embryo plakken en laat op ijs gedurende 20 minuten. De totale oplossing wordt vervolgens zorgvuldig verwijderd en drie PBS wassingen uitgevoerd met 5-min intervallen. Vervolgens worden de schijfjes nog in sucrose oplossing bij 4 ° C, totdat de plakjes sink, ongeveer 6 uur, maar kan ze langer (bijvoorbeeld &#39;s nachts). </li><li> Verwijder de plakjes en dep eenmalige extra sucroseoplossing en evenwicht gemaakt bij 1 ml LGO voor ongeveer 5 min bij 20 ° C. Monteer elke plak plat in een LGO-gevulde afpellen plastic mal.Na de montage verticaal plaatsen van de mallen op droog ijs te stollen. </li><li> Monteer de LGO blokken in de cryostaat en evenwicht de blokken bij -24 ° C voor ongeveer 20 minuten. Snijd elk sneetje met 15 mm secties gemonteerd op Superfrost-Plus dia&#39;s. Dia&#39;s kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C totdat ze nodig. </li></ol> 6. Immunofluorescentie <ol><li> Pipetteer 1-2 ml PBS op de horizontale dia gehouden in een bevochtigde kamer met de dia opgewekt uit de bodem van de kamer (we 1 of 2 ml plastic pipetten bevestigd met autoclaaf tape). Incubeer de secties in PBS gedurende 5 minuten bij 20 ° C om overtollig oktober de PBS-oplossing verwijderen de dia en voeg 500 ml blokkeeroplossing over de secties, incubeer 30 min bij 20 ° C. Verwijder de blokkering oplossing en onmiddellijk 500 ml verdunde primaire antilichaam toegevoegd aan de dia geïncubeerd bij 4 ° C gedurende 18-22 uur. </li><li> Verwijder primair antilichaam oplossing en werd onmiddellijkh de slides met 1 ml PBS gedurende 5 minuten, drie keer bij 20 ° C om overmaat oplossing te verwijderen primaire antilichaam. Voeg 500 ml van het verdunde secundaire antilichaam over de secties. De slides worden daarna bij 20 ° C gedurende 30 minuten. Het secundaire antilichaam oplossing wordt vervolgens verwijderd en de slede 3 keer gewassen in PBS 5 min bij 20 ° C. </li><li> Na deze wasbeurten, het uiteindelijke PBS wassen, dep de rand van de dia om het overtollige PBS verwijderen te verwijderen, voeg twee druppels van Vectashield op de dia&#39;s en voorzichtig een glas dekglaasje lag over de secties, het vermijden van de vorming van luchtbellen. Overtollig Vectashield door deppen van de rand van de dia voor imaging. </li></ol> 7. Imaging <ol><li> Beeld de immuun-secties. We maken gebruik van een Nikon Eclipse E80i fluorescentiemicroscoop uitgerust met een Hamammatsu ORCA ER digitale camera en 10 X, 20X en 40 X objectief lenzen. </li></ol>

<ol><li>Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+specification+in+the+spinal+cord%3A+Inductive+signals+and+transcriptional+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes.</a> Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).</li>
<li>Landmesser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+Of+Motoneurons+Supplying+Chick+Hind+Limb+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology-London%22%5BJournal%5D)">Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles.</a> Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).</li>
<li>Romanes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+motor+pools+of+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The motor pools of the spinal cord.</a> Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).</li>
<li>Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+repertoires+for+motor+neuron+diversity+and+connectivity+gated+by+a+single+accessory+factor%2C+FoxP1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1.</a> Cell. 134 (2), 304-316 (2008).</li>
<li>Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+actions+of+the+forkhead+protein+Foxp1+and+Hox+proteins+in+the+columnar+organization+of+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons.</a> Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).</li>
<li>Tsuchida, T., Ensini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+organization+of+embryonic+motor-neurons+defined+by+expression+of+limhomeobox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes.</a> Cell. 79 (6), 957-970 (1994).</li>
<li>Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+roles+for+LIM+homeobox+genes+in+directing+the+dorsoventral+trajectory+of+motor+axons+in+the+vertebrate+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb.</a> Cell. 102 (2), 161-173 (2000).</li>
<li>Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+neuron+pool+sorting+by+differential+expression+of+type+II+cadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins.</a> Cell. 109 (2), 205-216 (2002).</li>
<li>Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+Neuron+Position+and+Topographic+Order+Imposed+by+%CE%B2-+and+%CE%B3-Catenin+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities.</a> Cell. 147 (3), 641-652 (2011).</li>
<li>Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catenin-Dependent+Cadherin+Function+Drives+Divisional+Segregation+of+Spinal+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).</li>
<li>Haase, G., Dessaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF+acts+through+PEA3+to+regulate+cell+body+positioning+and+muscle+innervation+of+specific+motor+neuron+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools.</a> Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).</li>
<li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryo slices.</a> Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).</li>
<li>Hotary, K. B., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+that+guide+sensory+and+motor+neurites+identified+in+an+embryo+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation.</a> Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).</li>
<li>Krull, C. E., Tosney, K. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKrull%2C+CE+%22Methods+in+Cell+Biology%3A+New+Methods+in+Avian+Embryology%22">Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology</a>. Bronner-Fraser, M. 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. San Diego. 97-113 (2008).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+%28Reprinted+From+Journal+Of+Morphology%2C+Vol.+88%2C+1951%29%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951).</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+progress+in+corticoneurogenesis%3A+From+silver+impregnation+to+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering.</a> Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).</li>
<li>Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mechanisms+mediate+motor+neuron+migration+in+the+zebrafish+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain.</a> Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).</li>
<li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).</li>
<li>Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+Live+Imaging+of+Cell+Behavior+in+the+Developing+Neuroepithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium.</a> J. Vis. Exp. (62), e3920(2012).</li>
<li>Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-7+and+cadherin-6B+differentially+regulate+the+growth%2C+branching+and+guidance+of+cranial+motor+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons.</a> Development. 137 (5), 805-814 (2010).</li>
</ol>

Geen van de auteurs hebben concurrerende belangen of belangenconflicten.

De hier beschreven protocol kan een kippenembryo slice worden gedurende meer dan een dag met behoud motorneuronen levend blijven migreren tijdens de kweekperiode. In het ophelderen van de voorwaarden om motorneuronen in leven, hebben we identificeerden verschillende vereiste belangrijke functies. Het lijkt erop dat maximaal 4% chick serum is cruciaal voor de overleving van motorneuronen en wordt vervangen door serum van een andere soort wordt niet getolereerd. Interessant we gevonden dat de aanwezigheid van hogere concentraties serum nadelig waren voor de plakjes die woekering van het weefsel leidt tot grove vertekeningen in het segment vorm bevorderd. Belangrijker, de aanwezigheid van cilliary neurotrofe factor bleek ook kritisch. Het blijft een mogelijkheid dat de plakjes kan kunnen worden gekweekt aanzienlijk langer dan 24 uur, zelfs waardoor de visualisatie van sensorische afferente input naar het ruggenmerg. Bovendien, de cultuur voorwaarden hier kan het nuttig blijken om culturen van de ontwikkelingslanden hersenstam en middenhersenen / cerebellum snijden. Misschien wel de grootste potentiële voordeel in het gebruik van deze slice kweekomstandigheden is dat de mogelijkheid voor farmacologische manipulatie van eiwitfunctie met een minimale kans op bijwerkingen op de rest van de embryo, zoals het hart te bevorderen. Een groot aantal remmers en agonisten van verschillende signaalwegen kan worden gebruikt om de migratie van verschillende subtypes spinale neuronen en mogelijk het effect van de vorming van lokale spinale circuits in te beoordelen. Bovendien hebben sommige genetische verstoringen van eiwitexpressie, zoals die gebruik van siRNA&#39;s en morfolino oligonucleotiden maken, hebben als nadeel dat ze alleen vroeg in de ontwikkeling worden ingevoerd (door beperkingen in in ovo elektroporatie procedures) en de effecten slechts voor een korte periode van time (meestal een dag). Onze slice cultuur wordt gestart in een later stadium en biedt de mogelijkheid om deze technologie te gebruiken later in ontwikkeling bij het snijden podium om hun effecten te bekijken tijdens de periode van de cultuur van het segment. De slice cultuur-protocol kan ook toestaan ​​dat de visualisatie van zowel spinale motorische neuron en dorsale interneuron migratie in real time via time-lapse video microscopie. Dit kan worden bereikt met fasecontrastmicroscopie onder wit licht of door het gebruik van fluorescentie beeldvorming. Indien deze techniek zou dan gebruikt de introductie van fluorescerende labels nodig. Dit kan worden bereikt door het inbrengen van fluorescerende kleurstoffen zoals DiI of DIO via ofwel retrograde labeling van de tak of anterograde labeling van de ventrikel of in ovo elektroporatie van constructen fluorescerende eiwitten rijden in een subset van neuronen.

Tijdens normale embryonale ontwikkeling, worden vele verschillende celtypen die gegenereerd moeten migreren hun oorsprong waar ze uiteindelijk functioneren in het volwassen organisme. Binnen de ontwikkeling ruggenmerg, zijn progenitorcellen in de ventriculaire zone aan de middellijn en genereert vele subtypen van postmitotische neuronen en gliacellen die moeten migreren te integreren in functionele neuronale circuits nodig voor sensorische en motorische uitgangen 1. Spinale motorische neuronen die de samentrekking van ledematen spieren te controleren zijn uitgebreid bestudeerd en veel bekend van de moleculen en mechanismen die de vorming van hun verschillende subklassen rijden. Er is echter veel minder bekend over de mechanismen waarmee de motorneuronen migreren, scheiden en te ontvangen synaptische input. Motorneuron subtype identiteit wordt verworven tijdens de ontwikkeling in een hiërarchische manier. Motorneuron subtypes kan grofweg worden ingedeeld into verschillende kolommen, divisies en zwembaden die worden gedefinieerd door hun axon projecties. Motor kolommen project axonen om ofwel axiale, viscerale of ledematen spieren. Motor divisies onder te verdelen het ledemaat projecteren motorische neuronen van de laterale motor kolom (LMC) in die projecteren naar ventrale of dorsale spieren 2. Binnen de divisies, clusters van motorische neuronen genoemd motor zwembaden project aan de individuele spieren in het been 2, 3. Limb-projecterende neuronen worden gedefinieerd door hun expressie van de transcriptiefactor FOXP1 4, 5, terwijl afgesplitste identiteit wordt gekenmerkt door de expressie van het homeodomein transcriptiefactoren Islet-1 (ventraal uitstekende) of LHX-1 (dorsaal uitstekende) 6. Inderdaad, LHX-1 expressie vereist voor de betreffende dorsale projecties van de motorneuronen 7. Elk van deze subtypes verschillende posities innemen in het ruggenmerg ventrale uitstekende motorneuronen komen verblijven, dorsaal mediale projecting motorneuronen. Dit resulteert in de LMC worden gescheiden in zogenaamde LMCmedial (LMCm) en LMClateral (LMCL) divisies. Divisional en motor poolorganisatie wordt verworven in twee fasen 8. In de eerste fase wordt bereikt door segregatie afgesplitste een migratie van motorneuronen in een karakteristiek mediaal naar lateraal mode. De LMCL cellen worden gegenereerd nadat de LMCm cellen en zo LMCL verplaatsing door de LMCm te bereiken zijn definitieve afwikkeling positie. De tweede fase duurt motorische neuronen binnen een divisie en clusters ze in motor neuron zwembaden, vermoedelijk via een dorsale-ventrale sorteren van de motorneuronen. Leden van de catenine afhankelijke klassieke cadherine familie bleken cruciaal voor beide fasen van motor neuron organisatie 8-10. Echter, hoe cadherine functie cel beweging controleert slecht begrepen. De overname van zuilvormig, divisie-en zwembad identiteiten vereist extrinsieke signalen dat patroon intrinsiekc expressie van transcriptiefactoren 11. Bovendien, ongeveer 50% van alle motorneuronen sterven via apoptose tijdens de normale ontwikkeling in een proces dat extrinsieke signalen van de ledematen vereist, grotendeels door neurotrofe ondersteuning van motor neuron overleven. Zo motorneuron ontwikkeling vereist geschikte omgeving worden gehandhaafd op een relatief lange tijdsverloop. Daarom de praktische genereren ruggenmerg slice culturen motor neuron overleving handhaven vereist de opheldering van geschikte kweekomstandigheden. Previous embryo slice culturen werden gebruikt om het gedrag van extrinsiek toegevoegd gezuiverd neuronale populaties 12-14 volgen. Er zijn echter aan onze kennis kweekomstandigheden die in situ motor neuron overleving en migratie te vergemakkelijken binnen de plak zelf niet gepubliceerd. We pasten een standaard cultuur voorwaarde dat het voortbestaan ​​van gezuiverd vergemakkelijkt, om los craniale motorneuronen te vergemakkelijken motor neuron ontwikkeling binnen een embryo slice kweeksysteem. We controleerden tevens de positionering van de overlevende motorneuronen en aantonen dat grotendeels normaal posities van de motor neuron schotten is tijdens de kweekperiode.

<table border="1"><tbody><tr><td> Eieren </td><td> Henry Stewart Farms, UK </td><td></td><td> Bevruchte Bruin Bovan Gold kippeneieren (Henry Stewart Farms, UK), bewaard bij 14 ° C tot incubatie </td></tr><tr><td> 21-gauge naald </td><td> BD-Microlance-3 </td><td> 304432 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml spuit </td><td> BD Plastipak </td><td> 302187 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont forceps </td><td> Roboz </td><td> RS 5045 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Schaar </td><td> Roboz </td><td> RS 5910SC </td><td> (3,5 in rechte) </td></tr><tr><td> Embryo inbedding mallen: Peel weg mallen </td><td> Agar Wetenschappelijk </td><td> G3764 </td><td> Piramidale vorm 22 mm tot 12 mm </td></tr><tr><td> Super lijm </td><td></td><td></td><td> Macht Flex, Loctite </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> SIGMA </td><td> 32221 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Natrium-di waterstof fosfaat, mono-hydraat </td><td> BDH </td><td> 102454R </td><td></td></tr><tr><td> Natrium mono-di waterstof fosfaat </td><td> VWR / BDH </td><td> 102494C </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> VWR / BDH </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Lage smelttemperatuur agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16520 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Gibco </td><td> 10500-064 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> SIGMA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxide </td><td> FLUKA </td><td> 71689 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> VWR / BDH </td><td> 28794.295 </td><td></td></tr><tr><td> Plastic wegwerp pasteur pipetten </td><td> ELKAY Precisie laboratorium verbruiksartikelen </td><td> 127-P503-000 </td><td> Liquipette 3 ml volume </td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> SIGMA </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumwaterstofcarbonaat </td><td> SIGMA </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Chicken Embryo Extract </td><td> Seralabs </td><td> CE650-J </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine oplossing </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine oplossing </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> Gibco </td><td> 21985 </td><td></td></tr><tr><td> Paardenserum </td><td> Zuid-Group Labs </td><td> 9028B </td><td></td></tr><tr><td> B27 supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Neurobasal medium </td><td> Gibco </td><td> Cat ~ 2103 </td><td></td></tr><tr><td> CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) </td><td> R en D Systems </td><td> 557-NT-010 </td><td></td></tr><tr><td> Chick Serum </td><td> SIGMA </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Primaire antilichamen </td><td></td><td></td><td> werden gekocht bij Developmental Studies Hybridoma Bank, met uitzondering van anti-FOXP1 antilichamen waren een vriendelijke gift van Bennett Novitch van UCLA. Primaire antilichamen verdunningen werden Rabbit anti-FOXP1 (1/32000), anti-muis Lhx1 / 2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FOXP1 (1/1000). Alle antilichamen werden bewaard bij 4 ° C. </td></tr><tr><td> Secundaire antilichamen </td><td></td><td></td><td> Ezel anti-Guinea Pig (Cy3) (1:1000) gekocht bij Jackson Laboratories Inc Immunoreseach ezel anti-muis (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-konijn (Alexa Fluor 594) (1:1000) gekocht bij Invitrogen Alle antilichamen werden bewaard bij 4 ° C. </td></tr><tr><td> 24-well plaat </td><td> Corning Costar </td><td> 3473 </td><td> ultralaag bevestiging 24-well plaat </td></tr><tr><td> Oktober </td><td> Tissue Tek, Sakura </td><td> 4583 </td><td> Optimale snijtemperatuur </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H1000 </td><td> Vectashield fluorescerende montage medium </td></tr><tr><td> Slides </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td> Superfrost-Plus positief geladen dia&#39;s, 25 x 75 x 1,0 mm </td></tr><tr><td> Cover Glass </td><td> VWR International </td><td> 631-0167 </td><td> 25x60 mm </td></tr><tr><td> Geforceerde trek incubator: </td><td> Lyon Electric Company </td><td></td><td> vochtig gehouden door te zorgen waterstanden altijd voldoende gehandhaafd op 38 ° C </td></tr><tr><td> Cryostaat </td><td> Brite, Huntingdon, Verenigd Koninkrijk </td><td></td><td> -36 ° C </td></tr><tr><td> Tissue Culture Incubator </td><td> DH Autoflow </td><td></td><td> Nuaire 38 ° C, 5% CO2 </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td></td><td> Leica VT1000-S </td></tr><tr><td> Microscoop </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon Eclipse E80i fluorescentiemicroscoop </td></tr><tr><td> Digitale Camera </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon DS5M en Hamammatsu ORCA ER </td></tr></tbody></table>

chicken embryo spinal cord slice cultuur protocol

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice culturen kan zijn voor de manipulatie van embryo-ontwikkeling zowel farmacologisch en door middel van genetische manipulaties. In dit systeem verlaagd kunnen potentiële dodelijke bijwerkingen van systemische geneesmiddel toepassingen worden overwonnen. Wel moet kweekomstandigheden ervoor te zorgen dat de normale ontwikkeling opbrengst binnen de gereduceerde omgeving van de plak. We hebben gericht op de ontwikkeling van het ruggenmerg, in het bijzonder die van spinale motorische neuronen. We systematisch gevarieerd kweekomstandigheden van kippenembryo plakjes vanaf het punt waarop de meeste spinale motorische neuronen was geboren. We getest het aantal en type van motorneuronen dat tijdens de kweekperiode en de positie van de motorneuronen in vergelijking met die overleefden in vivo. We vonden dat serum type en neurotrofe factoren vereist tijdens de kweekperiode en konden motorneuronen levend gedurende ten minste 24 uur en de motorneuronen migreren naar gewenste posities in de toeruggenmerg. We presenteren deze kweekomstandigheden en de methodologie van de voorbereiding van de embryo slice culturen met behulp van de ingewanden ontdane kippenembryo&#39;s ingebed in agarose en gesneden met behulp van een vibratome.

Het gebruik van gekweekte plakjes aan de ontwikkeling van interneuron en projectie neuronen te volgen is invloedrijk in de voortgang van ons begrip van de generatie van organisatie binnen de cortex 16. In het ruggenmerg is motorneuron ontwikkeling gevolgd met culturen van geheel zebravisembryo&#39;s 17. Echter spinale motorische neuron organisatie zebravis is relatief eenvoudig (door het ontbreken van grote reguleert in vissen). De moleculaire mechanismen die een hiërarchie van spinale motorische neuron organisatie te rijden tijdens de ontwikkeling van hogere gewervelde dieren zijn momenteel slecht begrepen. Kweekomstandigheden die neuron overleving en cellichaam migratie in embryo slice culturen van hogere gewervelde dieren te vergemakkelijken zijn dus vereist. Momenteel ruggenmerg slice culturen van hogere vertebraten zijn gebruikt om zaad gedissocieerde neuronen bovenop de segmenten 12-14, onderzoeken fluorescent gelabelde axons in de periferie van de slice18, of van progenitor cel gedrag in de vroege ruggenmerg ontwikkeling 19. Snijd kweekomstandigheden voor later ruggenmerg, met name degenen die behouden motorneuron ontwikkeling op dit moment ontbreekt. Om te proberen om spinale neuronale ontwikkeling te volgen, in het bijzonder die van de spinale motorische neuronen, wij diverse kweekomstandigheden die motorneuron overleving en de acquisitie van de eerste orde in de motorische organisatie door laterale migratie van de neuronen kunnen bevorderen onderzocht. De eerste proeven met behulp van fase 18 tot 20 kippenembryo ruggenmerg plakjes fase bleek vruchteloos, we waren niet in staat om motorneuronen in leven te houden langer dan een paar uur en waren niet in staat tot het genereren van aanzienlijke aantallen LMCL cellen over de cultuur periode (gegevens tonen aan niet getoond). We hebben daarom onderzocht slice culturen van fase 24 embryo&#39;s, een tijdpunt wanneer de meerderheid van de LMCL en LMCm neuronen zijn gegenereerd, maar als LMCL neuron migratie staat nog in de infancy (figuur 1a-c). Deze laterale migratie van LMCL neuronen is grotendeels voltooid stadium 27, rond 24 tot 36 uur later (figuur 1 df). De assay kan derhalve worden vereenvoudigd kunnen om de neuronen in leven en hun migratie zijdelings gemakkelijk in de ventrale hoorn. We hebben onze experimenten begonnen met relatief eenvoudige kweekomstandigheden met slechts gebalanceerde zout Hank&#39;s oplossing, met of zonder kip serum of kippenembryo-extract. In alle gevallen, hoewel we konden LMC neuronen in het segment behouden, weinig aanwijzingen voor LMCL neuronen worden gehandhaafd (ten minste expressie van LHX-1). Verder vonden we onjuiste expressie van genen zoals HB9 in de dorsale ruggenmerg, een situatie die nooit voorkomt in vivo (data niet getoond). Aldus deze eenvoudige kweekomstandigheden zijn niet geschikt voor het onderzoek naar de verwerving van motorische neuron organisatie. Wij hebben dus zocht meer complexe conditions en uitgaan van een formulering die is gepubliceerd voor het voortbestaan ​​van gedissocieerde embryonale kip craniale motorneuronen te vergemakkelijken gebruikt. Deze voorwaarde 20 (1% kippenembryo extract, 1% Pen strep, 0,35% L-Glutamine, 0,1% 2-mercaptoethanol, 2% paardenserum, 2% B27 supplement en 50 ng / ml ciliaryneurotrophic growth factor (CNTF) in medium neurobasal (hier genoemd Guthrie medium) heeft altijd op meer motorneuronen in leven dan de meer eenvoudige media. Daarnaast is het resulteerde niet in valse expressie van transcriptiefactoren in de dorsale ruggemerg. Echter, het overleven van neuronen LMCL was slecht (Figuur 1 gi, p). Daarom varieerde onze mening een sleutelrol spelen in de Guthrie, namelijk via het dier oorsprong van het serum, de concentratie van het serum en de concentratie van CNTF in het medium. We vonden dat een verandering van serum van paardenserum Chick serum en een toename in concentratie van CNTF van 50 ng / ml tot 100 ng / ml aanzienlijk toegenomen thij overleving van de LMCL en LMCm cellen en toegestaan ​​hun migratie in de ventrale hoorn over de 24 uur van de kweek omstandigheden (figuur 1 jl, p). Het totale aantal motorneuronen de verhouding LMCm tot LMCL en zelfs de migratie van de LMCL cellen in het ventrale hoorn leek sterk op delen van embryo&#39;s had laten ontwikkelen in ovo plaats in het segment kweek (Figuur 1 ko, p). Zo vinden wij dat gebaseerd op transcriptiefactor expressie, het aantal cellen en positie van motorneuronen, slice onze kweekomstandigheden normale spinale motorische neuron ontwikkeling vatten ten minste gedurende 24 uur periode. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1.jpg" /> Figuur 1. a - c. Status van generatie LMC (FOXP1 kleuring inb) en LMCL (LHX-1 kleuring in a) in stap 24. c is een samenvoeging van de twee kanalen. De middellijn wordt weergegeven als een stippellijn in een en D, V toont de oriëntatie van de dorsoventrale (D, V) as van het ruggenmerg d -. F. . Status van LMC (FOXP1 kleuring in d), en LMCL (LHX-1 kleuring in e) organisatie in de eerste fase 27 f is een samenvoeging van de twee kanalen g -. I. LHX-1 (g) en FOXP1 (h) expressie in secties van een slice gekweekt in een medium dat craniale motor neuron celoverleving ondersteunt (Guthrie medium, onze &quot;eerste medium&quot; zie referentie 20). LHX-1 niet meer uitgedrukt in motorneuronen, hoewel er enige overleving van cellen LMC blijkt uit FOXP1 expressie. D, V in (g) toont de oriëntatie van de dorsoventrale (D, V) as van het ruggenmerg. ML toont de oriëntatie van de mediolaterale (M, L) as van de sPinal koord j - l. LMCL cellen (LHX-1 in de ventrale hoorn j) en LMC in het algemeen (in FOXP1 k) worden waargenomen in plakjes gekweekt in medium dat 4% chick serum en 100 ng / ml CNTF. Merk op dat sommige LMCL cellen worden aangetroffen in een laterale positie in de ventrale hoorn. De pijl in (j) toont de laterale positie van sommige LMCL de cellen. (L) is een samenvoeging van de twee kanalen m. -. O.. Status van expressie van LHX-1 (m) en FOXP1 (n) in delen van een embryo in ovo gehouden tijdens de slice cultuur van de embryo getoond in j - l. (O) is een samenvoeging van de twee kanalen. P. Kwantificering van het percentage van LMCL (FOXP1 + ve / Lhx1 + ve) cellen versus LMC (FOXP1 + ve / Lhx1-ve) cellen in slice culturen in verschillende omstandigheden compared om embryo&#39;s in ovo (overeenkomende met 100%) te controleren. Student&#39;s t-test *** vertegenwoordigt p &lt;0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50295/50295fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> .

Slice culturen vergemakkelijken de manipulatie van embryo-ontwikkeling van gen-en farmacologische verstoringen. Wel moet kweekomstandigheden ervoor te zorgen dat de normale ontwikkeling kan gaan binnen de verminderde omgeving van de plak. We tonen een protocol dat normale ontwikkeling ruggenmerg vergemakkelijkt men gedurende ten minste 24 uur.

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Cultuur Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Het algemene doel van deze procedure is het kweken van plakjes kippenembryo om een normale neuronale ontwikkeling te behouden, in het bijzonder van spinale motorneuronen. Dit wordt bereikt door eerst het kippenembryo te dissekeren om de visceraal organen te verwijderen. De tweede stap is het voorbereiden en in plakjes snijden van het embryo dat is ingebed in een agarblok.Vervolgens wordt de embryonale slice voorzichtig uit de agar verwijderd. De laatste stap is het overbrengen van de embryonale slice naar een kweekmedium, dat 24 uur lang wordt geïncubeerd bij 37 °C. Ten slotte wordt immunofluorescentiemicroscopie op dunne coupes van de embryonale slice gebruikt om de aanwezigheid en locatie van spinale motorneuronen na de kweekperiode aan te tonen.Deze methode kan dus helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de ontwikkelingsneurobiologie. Denk hierbij bijvoorbeeld aan de mechanismen en moleculen die betrokken zijn bij de migratie van spinale motorneuronen. In het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat er tijdens de dissectiefases van het protocol veel zorgvuldigheid vereist is.Plaats 10 bevruchte eieren met de langste zijde horizontaal in een incubator met geforceerde luchtstroom bij 38 °C tot ze het hamburger-stadium en Hamilton-stadium 24 bereiken. Dit vereist gewoonlijk ongeveer vier dagen incubatie. Steriliseer op de tweede dag van de incubatie de eierschaal door deze af te vegen met een papieren tissue gedrenkt in 70% Ethanol; doorboor vervolgens voorzichtig het platte uiteinde van de eierschaal met een 21 gauge naald bevestigd aan een spuit van 5 mL en verwijder 5 mL albumine.Dit verlaagt het embryo weg van de schaal, zodat het embryo niet beschadigd raakt wanneer de schaal wordt geopend. Plaats de eieren terug in de incubator en laat ze nog twee dagen incuberen. Nadat deze twee dagen zijn verstreken, gebruikt u stomp.Ga verder. Nummer vijf, gebruik een pincet om voorzichtig in het midden van de bovenkant van de schaal te prikken en verwijder een stuk schaal van ongeveer negen vierkante centimeter. Snijd rondom het embryo, til het embryo voorzichtig uit en plaats het in HBSS.Voor dissectie. Alle gebruikte embryo's moeten zich in de buurt van stadium 24 bevinden. Alle embryo's die tekenen van abnormaliteit vertonen, moeten worden weggegooid.Plaats de schaal met het embryo onder een dissectiemicroscoop. Gebruik twee dubbele nummer vijf pincetten om het amnionmembraan, het chorionmembraan, de allantoïs en het hoofd te verwijderen. Eviscereer vervolgens het embryo om alle interne organen te verwijderen door met micro-dissectiescharen de ventrale middellijn van het embryo open te knippen.Houd vervolgens het embryo vast bij de rostrale rompstreek met één pincet. Pak het rostrale deel van het darmkanaal en het hart vast en trek deze voorzichtig weg. De somieten van het embryo moeten nu duidelijk zichtbaar zijn.Trim nu de thoraxwand met microdissectieschaartjes. Snijd vervolgens het embryo transversaal doormidden tussen de knopjes van de boven- en onderledematen. Verwijder voorzichtig de lumbale helft van het gedisseceerde embryo door met twee pincetten het embryo uit de dissectieoplossing te tillen en plaats dit in een droge Petrischaal met behulp van een wegwerppastepipet van ongeveer vijf centimeter.Snijd vanaf de onderkant en aspireer ongeveer twee milliliter gesmolten 4% gewicht per volume agarose in PBS. Pipetteer ongeveer 0,5 milliliter agarose bovenop het embryo en zuig vervolgens het stuk embryo in de pipet op. Breng het embryo en de agarose over naar een afpelbare plastic mal zonder luchtbellen in de agarose te introduceren.Laat het embryo voorzichtig naar de bodem van de aros in de plastic mal zakken, met de thoraxsectie naar beneden gericht, en gebruik een naald van 25 gauge om ervoor te zorgen dat het embryo recht ligt. De aros bevat ook een deel van de ontwikkelende ledemaat en het is belangrijk dat de embryo's verticaal in de aros worden geplaatst om dit mogelijk te maken; plaats de plastic mal gedurende ongeveer twee minuten op ijs. Let bij het fixeren van de aros erop dat het embryo tijdens deze periode niet van oriëntatie verandert.Stel een VT 1000 S soortgelijk in, zodat de kamer is gevuld met HBSS en omringd is door ijskoud water. Gebruik secondelijm om het agarblok op het Vibram-platform te bevestigen en trim het blok vervolgens met een scheermesje, zodat het embryo-stuk wordt omringd door één tot drie millimeter agar.Start de vibratoom en begin met het snijden van het embryo. De plakjes die secties van de ledemaatknop bevatten met een duidelijke apicale ectodermale lijst worden geselecteerd en vervolgens overgebracht naar een schaal met HBSS. Over het algemeen zijn er slechts één tot twee geschikte plakjes per embryo.Verwijder voorzichtig de agarose rond de weefselsneden met behulp van twee naalden. Het is essentieel dat dit grondig en zorgvuldig gebeurt. Voeg 500 µL cultuuroplossing toe aan het benodigde aantal wells van een 24-well ultra low attachment weefselkweekplaat.Breng de plakjes voorzichtig over van de HBSS-oplossing naar de well, waarbij twee of drie plakjes per well worden geplaatst. Plaats de 24-wells plaat vervolgens in de weefselkweekincubator bij 37 °C met 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur. Voeg na de kweekperiode 500 µL ongebufferde fixeeroplossing toe aan elke well met embryonale plakjes en laat dit 20 minuten op ijs staan. Aspireer vervolgens voorzichtig de volledige oplossing en was drie keer in PBS met intervallen van vijf minuten. Voeg daarna 30% sucrose in PBS toe aan de wells en plaats de plaat bij 4 °C gedurende ongeveer zes uur of langer, totdat de plakjes naar beneden zakken.Nadat de coupes zijn gezonken, verplaatst u de coupes naar een schone Petrischaal van 10 centimeter en dept u het overtollige sucrose-oplossing weg. Voeg vervolgens één milliliter OCT toe en laat de coupes vijf minuten equilibreren bij 20 °C. Monteer elke coupe vlak in een met OCT gevulde, afpelbare plastic mal na de montage.Plaats de mallen verticaal op droogijs om de OCT-blokken te verstevigen, monteer ze op de cryostaat en laat de blokken ongeveer 20 minuten equilibreren bij minus 24 °C. Snijd vervolgens elke plak in secties van 15 micron en monteer deze op Superfrost Plus-objectglazen. De objectglazen kunnen worden bewaard bij minus 80 °C tot ze nodig zijn voor immunofluorescentiekleuring, zoals beschreven in het tekstgedeelte van het protocol; deze afbeelding toont de status van de generatie van de laterale motorische kolom bij Hamburger en Hamilton stadium 24.De laterale onderverdeling van de laterale motorische kolom wordt gevisualiseerd door LH X one-kleuring in het linkerpaneel. De laterale motorische kolom wordt gevisualiseerd door kleuring met Fox P one in het middenpaneel en het rechterpaneel is een samenvoeging van de twee kanalen. De middellijn wordt weergegeven als een stippellijn en DV duidt hier de dorsoventrale as aan.De status van de laterale divisie van de laterale motorische kolom wordt in het linkerpaneel opnieuw aangetoond door LH X one-kleuring en de laterale motorische kolom door Fox P one-kleuring in het middelste paneel, met de samengevoegde afbeelding rechts. Deze afbeeldingen tonen de ontwikkeling in stadium 27. Deze afbeeldingen tonen LH X one-expressie links en Fox P one-expressie in het middelste paneel in secties van een slice-cultuur in een medium dat het overleven van gedissocieerde craniale motorische neuroncellen ondersteunt.LH X one wordt niet langer tot expressie gebracht in motorneuronen, hoewel er enige overleving van LMC-cellen is, aangetoond door Fox P one-expressie. DV stelt de oriëntatie van de dorso-ventrale as van het ruggenmerg voor, en ML stelt de oriëntatie van de medio-laterale as van de laterale motorische kolom van het ruggenmerg voor. Cellen van de laterale divisie, opnieuw gekleurd voor LH X one in het ventrale hoorn in het linkerpaneel en de LMC in het algemeen gekleurd voor Fox P one in het middenpaneel, kunnen worden waargenomen in coupes, gekweekt in medium bevattend 4% kkipserum en 100 nanograms per milliliter CNTF.Let op dat sommige cellen van de laterale divisie van de laterale motorische kolom zich in een laterale positie in het ventrale hoorn bevinden, zoals aangegeven door de pijl in het linkerpaneel. Deze afbeelding toont de expressiestatus van LHX1 en FoxP1 in secties van een embryo dat in ovo is gehouden tijdens de plakcultuur van het eerder getoonde embryo. Dit histogram toont de resultaten van de kwantificering van het percentage cellen van de laterale divisie van de laterale motorische kolom, die positief kleuren voor FOXP1 en LHX1, versus cellen van de laterale motorische kolom, die positief kleuren voor FOXP1 en LHX1.Negatieve gegevens worden getoond voor cellen in slice-culturen onder verschillende condities vergeleken met controle-embryo's die in ovo zijn gehouden, welke 100% vertegenwoordigen; de gegevens werden geanalyseerd met behulp van de t-toets van Student. De drievoudige asterisk staat voor een significantieniveau van minder dan 0,01. Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om voorzichtig te zijn bij het dissecteren van het embryo en bij het verwijderen van de agros uit de slices, omdat het essentieel is om de integriteit van de motorische axonen in de ledematenknop te behouden.

chicken-embryo-spinal-cord-slice-culture-protocol

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video toont nieuwe cultuur, een methode waarbij kippenembryo's zich buiten het ei gekweekt tot 24 uur. Deze methode stelt je in staat om te studeren vroege ontwikkeling (primitieve streep tot 14 som.), Een periode die overeenkomt met E7-9 in de muis. Toepassingen van deze techniek zijn onder elektroporatie, in situ hybridisatie en immunohistochemie.

Methode voor Cultuur van Early kippenembryo&#39;s ex vivo (Nieuwe Cultuur)

In deze paper presenteren we een methode voor het transplanteren van menselijke stamcellen in verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel van de kip embryo. Dit zorgt voor...

Xenotransplantatie van menselijke stamcellen in het kippenembryo

We presenteren een methode om organotypische plakjes van mid-dracht muis embryo's voor te bereiden op de teelt en de time-lapse imaging van perifere zenuwen uitgroei.

Organotypische Slice Cultuur van GFP-expressie muis embryo&#39;s voor real-time beeldvorming van perifere zenuwen uitgroei

De kip auditieve hersenstam bestaat uit de kernen die verantwoordelijk is voor de binaurale geluidsbewerking. Een enkele coronale slice voorbereiding onderhoudt het hele circuit, terwijl de gekweekte aanpak biedt een unieke voorbereiding op de ontwikkeling van neuronale structuur en auditieve functie bestuderen op moleculair, cellulair en netwerk niveau.

Voorbereiding en Cultuur van Chicken Auditieve Brainstem Slices

Imaging embryonaal weefsel in real-time is een uitdaging gedurende een lange periode van tijd. Hier presenteren we een test voor het toezicht cellulaire en sub-cellulaire veranderingen in de chick ruggenmerg gedurende lange perioden met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Deze techniek kan worden aangepast voor andere gebieden van het zenuwstelsel en zich ontwikkelende embryo.

Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium

Een methode waarmee genexpressie in de neurale buis downgereguleerd in een celtype-specifieke, traceerbare wijze beschreven. We laten zien...

In ovo Elektroporatie van miRNA gebaseerde Plasmiden in de ontwikkelingslanden neurale buis en Beoordeling van de fenotypes van Dil Injectie in de Open-boek Voorbereidingen

The video demonstrates the functional regeneration of propriospinal connections using a multi-electrode array (MEA)-based assay. The spinal cord slices are placed on the MEA and are allowed to fuse. The fused slices are mechanically separated by creating a lesion, inducing propriospinal neurons to grow over the lesion and connect the slices. The electrical activity of the slices is assessed to identify the regeneration of functional connections.

Studying the Regeneration of Functional Connections between Spinal Cord Slices Using a Multi-Electrode Array

Celkweekmodellen gedetailleerde controle milieuomstandigheden en dus een krachtig platform om verschillende aspecten van neuronale cel biologie. We beschrijven een snelle, goedkope en betrouwbare wijze te isoleren, dissociëren en cultuur sensorische neuronen van kippenembryo's. Details van de ondergrond voorbereiding en immuuncytochemie zijn ook aanwezig.

Isolatie en Cultuur van Gedissocieerde sensorische neuronen van Chick Embryo

Hier presenteren we een protocol dat is gebaseerd op gekweekt ruggemerg segmenten op multi-elektrode arrays functionele regeneratie van propriospinal verbindingen in vitro bestuderen.

Onderzoek van functionele Regeneratie in Organotypische Spinal Cord Co-culturen Grown on Multi-elektrode arrays

Hier presenteren we een organotypic kweken protocol om te groeien van embryonale kip organen in vitro. Met deze methode kan de ontwikkeling van embryonale kip weefsel worden bestudeerd, met behoud van een hoge mate van controle over de omgeving van de cultuur.

Organotypic cultuur methode om te studeren van de ontwikkeling van embryonale kip weefsels

Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van niet-coronale auditieve hersenstamschijfjes van het kippenembryo voor het onderzoek naar tonotopische eigenschappen en ontwikkelingstrajecten binnen één hersenstamsegment. Deze segmenten omvatten sagittale, horizontale en horizontale / transversale secties die grotere tonotopische gebieden omvatten binnen een individueel segmentvlak dat de traditionele coronale secties omvat.

Snijden van de embryonale kip auditieve hersenstam om tonotopische gradiënten en microcircuits te evalueren

Leer het kweken van kippenembryo-spinaalschijven voor de ontwikkeling van spinale motorneuronen. Deze methode ondersteunt normale neuronale ontwikkeling gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius.

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Cultuur Protocol

Meer video's verkennen