Name: Selectieve Tracing van auditieve vezels in de Avian Embryonale evenwichtszenuw Nerve (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Leer een microdissectietechniek om auditieve vezels selectief te traceren in kippenembryo's. Deze methode maakt hoge-resolutievisualisatie van de akoestische ganglion en zijn centrale projecties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen dr. Candace Hsieh bedanken voor suggesties en hulp bij beeldvormende technieken en Dr Doris Wu voor expertise op het gebied chick binnenoor anatomie tijdens de vroege embryogenese. Dit werk werd ondersteund door NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796, en DOE GAANN P200A120165.

1. Bereid de volgende Dissectiemateriaal en reagentia <ul><li> Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF, 130 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH 2PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM HEPES, 10 mM Glucose, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4) continu toegediend met 95% O 2/5% CO 2 bij kamertemperatuur. Voor infusie vullen tot 2/3 van 500 ml met wijde hals Nalgene pot met een gat in het deksel. Tank wordt bevestigd door een glazen buis stam bubbler, die de aCSF dringt door het gat in de pot deksel. Bandenspanning een constante stroom van belletjes die reiken ongeveer 1/3 van de vloeistof maar niet krachtig genoeg om spatten over de rand te verkrijgen. Submerge 5 ml glazen flacons (tot 6) in de Nalgene pot om individuele monsters scheiden van elkaar en van de gasstroom turbulentie. ACSF worden zuurstof ten minste 20 min voorafgaand aan de incubatie weefsel. </li><li> Kleine siliconen dissectie schotel (35 mm x 10mm Petri gecoat met behulp van Sylgard elastomeren Kit) met twee dissectie pinnen geplaatst in kleine zeshoekige polystyreen (47 mm onder) wegen boot. </li><li> Twee fijne tip forceps, een gebogen tip forceps, een 50 ml beker en een houder voor weefsel afval. </li><li> Getrokken glazen micropipet (1,2 OD / 0,9 ID) gebroken ongeveer 20-50 urn opening aan het uiteinde en gevuld met rhodamine dextran amine (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) in een 6,25% oplossing met 0,4% Triton X-100 in PBS . Bevestig door fijne slang aan picospritzer en te stabiliseren tot micromanipulator. </li></ul> 2. Microdissectie basilaire papilla te onthullen op E8 4,5 <ol><li> Met gebogen pincet, snijd E8 embryo net onder de hersenstam, het plaatsen van het hoofd direct op silicone-coated dissectie gerecht binnen wegen boot. </li><li> Met behulp van dissectie pinnen, het hoofd te positioneren met een ventrale uitzicht, dus het oor aan de kant van belang is licht zichtbaar, het hoofd iets schuin dorsaal en wijst 10 tot 30 graden van center (Figuur 2A). Onmiddellijk zet de kop met spelden. Als de bilaterale tracering is gewenst, in het midden van de kop op 0 graden, of een volledige ventrale uitzicht, dus beide kanten kunnen worden benaderd. Ook voor een linkszijdige injectie, zet de kop bij -10 tot -30 graden van het centrum, zodat de linkerkant toegankelijk is. </li><li> Met behulp van de 50 ml bekerglas, breng 30 ml van zuurstofrijk aCSF in de schaal, volledig onder te dompelen het weefsel. </li><li> Voorzichtig te grijpen en schil langs de onderkaak met behulp van fine-tip tang, dan het onderste ooglid te verwijderen aan de zijkant van belang. </li><li> Verwijder de bovenliggende vaatweefsel, met inbegrip van alle resterende gehemelte en slokdarm. Deze zachte weefsels moeten afpellen onthullen het gladde oppervlak van de ontwikkeling van chondrocranium met de kenmerkende vertebrale slagaders aan het oppervlak. Door dit punt, moet de karakteristieke witte otoconial massa zichtbaar zijn. </li><li> Voorzichtig ontleden de huid rond de externe gehoorgang, kraakbeen van het kaakgewricht en het middenoor, terwijl de inner oor intact. Gebruik de tang om voorzichtig weggesneden deze kraakbeenachtige structuren. </li><li> Verwijder vertebrale slagaders en bundeling bloed met behulp van een zachte zwaaiende beweging met de fijne tang tips. Bloed kan belemmeren uitzicht en coagulatie kan de injectie pipet opening sluit. </li><li> De cochleaire buis met aangrenzende sensorische epitheel (basilaire papilla) en akoestische ganglion ligt direct onder de chondrocranium 6 en kan worden gevisualiseerd als een langwerpige vingervormige uitsteeksel zich vanaf het binnenoor ventraal, de meest distale punt (apex) bij de voorste middellijn 5. Er een kleine pooling van bloed (rood) vanaf de dissectie en / of otolithic verkalkingen (wit) aan de top van de cochleaire kanaal (Figuur 2B) dat kan helpen bij visualisatie. Bij de top is de lagenar macula, een zintuiglijke patch waarschijnlijk van vestibulaire functie 7,8. </li></ol> 3. Selectieve Labeling van de GN-VIII Auditieve Vezels <ol><li&gt; Plaats de injectie pipet in de buurt van de embryo oppervlak op het cochleaire kanaal en basilaire papilla regio. </li><li> Langzaam zakken de micropipet om eerst doorboren de schedel. Deze schedel is dunner dan de omliggende gebieden en vereist minder kracht te dringen. De micropipet moet nu in de cochleaire kanaal. Optioneel: een kleine injectie van de tracering kleurstof kan hier gemaakt worden om te helpen bij het visualiseren van de basilaire papilla. </li><li> Zonder het herpositioneren van de micropipet, verder te verlagen tot het net strijd is met de diepe rand van het cochleaire kanaal (figuur 1). Hier voert een injectie en herhaal in meerdere gebieden langs de lengte van de basilaire papilla (Figuren 2C, 2D), exclusief de meest proximale uiteinde waar de vestibulaire lagena bevindt. Met de picospritzer ingesteld tussen 10-30 psi, zijn meerdere injecties gemaakt. De hoeveelheid ingespoten kleurstof vloeistof varieert en is afhankelijk van de mate van gewenste etikettering. Iedere injectie moet resulteren in een fluorescente kleurstof-labeled spot van circa 200 - 400 urn diameter (figuur 2D). </li><li> Nadat de injectie is voltooid, een tang om het monster boven de hersenstam doorsnijden en een transferpipet gebruiken om de caudale gedeelte plaatsen in een potje in de houder van aCSF voortdurend perfusie met 95% O2 / 5% CO 2. </li><li> Voor elk embryo, laat 20-30 min voor kleurstofoverdracht, afhankelijk van de afstand van de centrale tracing gewenst. </li><li> Verwijder weefsel en voor te bereiden op histologische coupes. In het voorbeeld wordt weefsel ondergedompeld in 4% paraformaldehyde (in 1X PBS) gedurende de nacht, 30% sucrose (in 1X PBS) gedurende een nacht. </li></ol> 4. Tegenkleuring en Analyse <ol><li> Tegenkleuring is nuttig om te helpen oriënteren de waarnemer anatomische locatie, alsmede de bijzondere regio&#39;s van belang vast te stellen. Een effectieve tegenkleuring in dit preparaat neurofilament immunokleuring (figuren 1, 3B, 3E), die sterk lAbels axonen en maakt afbakening van axonale stukken in het CZS. </li><li> Analyse worden uitgevoerd binnen de label regio en de uitsteeksels kunnen honderden microns of meer zich langs de as rostrocaudal. Enkele voorbeelden van eenvoudige analyses zijn: targeting foutenpercentages, timing en / of veranderingen in de divergentie van projectie patronen. RDA-gelabelde axons gevisualiseerd in het perifere en centrale zenuwstelsel met hoge resolutie (Figuren 3A, 3D). </li></ol>

<ol><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+sound+in+space%3A+the+regulation+of+inner+ear+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139, 245-257 (2012).</li>
<li>Pflieger, J. F., Cabana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vestibular+primary+afferents+and+the+vestibulospinal+projections+in+the+developing+and+adult+opossum%2C+Monodelphis+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica.</a> Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).</li>
<li>Molea, D., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+topography+of+nucleus+magnocellularis+innervation+by+the+cochlear+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion.</a> The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).</li>
<li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).</li>
<li>Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+pattern+formation+in+the+inner+ear%3A+do+compartment+boundaries+play+a+role%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).</li>
<li>Bellairs, R., Osmond, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBellairs%2C+R+%22The+atlas+of+chick+development%22">The atlas of chick development</a>. , 2nd Edn, Elsevier. (2005).</li>
<li>Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+patterns+and+spontaneous+activity+of+afferent+fibres+to+the+lagenar+macula+and+apical+basilar+papilla+of+the+chick%27s+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick's cochlea.</a> Hearing Research. 56, 211-226 (1991).</li>
<li>Code, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efferent+neurons+to+the+macular+lagena+in+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick.</a> Hearing Research. 82, 26-30 (1995).</li>
<li>Maklad, A., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vestibular+afferent+projections+into+the+hindbrain+and+their+central+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets.</a> Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).</li>
<li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+system+development%3A+primary+auditory+neurons+and+their+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li>
<li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+inner+ear+cells+using+genomic+tags+for+clonal+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification.</a> Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).</li>
<li>Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+morphogenesis+of+the+vertebrate+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).</li>
<li>Appler, J. M., Goodrich, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+ear+to+the+brain%3A+Molecular+mechanisms+of+auditory+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly.</a> Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).</li>
<li>Bulankina, A. V., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuit+development+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Neural circuit development in the mammalian cochlea.</a> Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).</li>
<li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon guidance in the inner ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).</li>
<li>Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+functional+synaptic+connections+in+the+auditory+system+visualized+with+optical+recording%3A+afferent-evoked+activity+is+present+from+early+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).</li>
<li>Marrs, G. S., Spirou, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+assembly+of+auditory+circuits%3A+spiral+ganglion+and+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem.</a> The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).</li>
<li>Milo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+the+function+of+the+transcription+factor+gata3+during+development+of+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear.</a> PloS One. 4, e7144(2009).</li>
<li>Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bHLH+genes+in+ear+development+and+evolution%3A+revisiting+a+10-year-old+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+regulates+survival+and+formation+of+connections+in+mouse+ear+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain.</a> Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).</li>
<li>Huang, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+is+a+transcriptional+regulator+of+soma+size%2C+target+field+innervation+and+axon+pathfinding+of+inner+ear+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons.</a> Development. 128, 2421-2432 (2001).</li>
<li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).</li>
<li>Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+profiling+of+spiral+ganglion+neurons+reveals+insights+into+auditory+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten worden gedeclareerd.

Studies van de vroege ontwikkeling van de VIIIe zenuw zijn beperkt voor een deel als gevolg van de moeilijkheid bij het identificeren van embryonale axonen die voortvloeien uit meerdere, afzonderlijke ganglia. Verschillende studies hebben gekeken naar de moleculaire signalen geleiden auditieve en vestibulaire sensorische ganglion cel en celtypes tijdens de vroege ontwikkeling, maar 5,11,12 processen reguleren centrale innervatie nog worden bepaald. Verslagen van akoestische ganglion cel projecties doorgaans b...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Polystyreen Weeg Schotel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-202-101 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischaal, 35 X 10 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820644 </td><td> Gebruik om siliconen dissectie schotel te maken </td></tr><tr><td> Sylgard siliconelastomeerfase Kit </td><td> Wereld Precisie-instrumenten </td><td> SYLG184 </td><td> Coat Petri aan dissectie schotel te maken </td></tr><tr><td> Dissection Pins </td><td> Divers </td><td></td><td> Houdt embryo op zijn plaats tijdens dissectie </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Divers </td><td></td><td> van aCSF recept </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Divers </td><td></td><td> van aCSF recept </td&gt; </tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Divers </td><td></td><td> van aCSF recept </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> Divers </td><td></td><td> van aCSF recept </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Divers </td><td></td><td> van aCSF recept </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> Divers </td><td></td><td> van aCSF recept </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Divers </td><td></td><td> van aCSF recept </td></tr><tr><td> Container voor aCSF. Suggestie doorschijnende breed-mond Nalgene pot, 500 ml (16 oz) met deksel. </td><td> CPLabSafety </td><td> QP-PLC-03717 </td><td> Boorgat opening in de top van het deksel voor glas bubling stam door te dringen vloeistof </td></tr><tr><td> Lege 5 ml glazen flacon of vergelijkbare doorzichtige flacon </td><td> American Pharmaceutical Partners, Inc </td><td> 6332300105 </td><td&gt; Gebruik tijdens aCSF incubatie monsters gescheiden te houden van elkaar en van de bruisende stroom </td></tr><tr><td> Carbogen tank (95% O2 / 5% CO 2) via leiding met bubbler </td><td> Divers </td><td></td><td> Bevestig door slang aan op glas steel bubbler voor infusie in aCSF </td></tr><tr><td> Glazen steel bubbler </td><td> Divers </td><td></td><td> Om carbogen doordringen in aCSF </td></tr><tr><td> Gebogen-tip pincet </td><td> Wereld Precisie-instrumenten </td><td> 501008 </td><td> Om embryo kop te verwijderen van ei </td></tr><tr><td> Twee fine-tip tang </td><td> Wereld Precisie-instrumenten </td><td> 501985 </td><td> Voor micro-dissectie </td></tr><tr><td> 50 ml Beker </td><td> divers </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine Dextran Amine (RDA) </td><td> Invitrogen </td><td> divers </td><td> Fluorescerende axon tracer </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> ICN Biomedicals </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing (1X PBS) </td><td> Divers </td><td></td><td> Standaard lab reagens </td></tr><tr><td> Thin Wall glazen capillairen, 1,2 OD, 0.9 ID 4 &quot;(100 mm) lengte </td><td> Wereld Precisie-instrumenten </td><td> TW120F-4 </td><td> Laad met RDA. Elk capillair maakt twee glazen micropipetten </td></tr><tr><td> Naald / pipet trekker </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> Model 720 </td><td> Gebruikte instellingen: Heat 16.4, Solenoid 2,2 </td></tr><tr><td> Picospritzer </td><td> Parker Instrumentatie </td><td> divers </td><td> Bevestig door fijne slang aan op glas micropipet </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Narishige </td><td> divers </td><td></td></tr><tr><td> Dissectie microscoop met fluorescentie </td><td> Divers </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> 4% paraformaldehyde </td><td> Divers </td><td></td><td> Standaard lab reagens </td></tr><tr><td> anti-neurofilament antilichaam, optioneel </td><td> Millipore </td><td> AB1991 </td><td> Volg histologische protocol aanbevolen door de fabrikant </td></tr><tr><td> Cryostaat en bijbehorende materialen voor het snijden </td><td> Leica </td><td> divers </td><td></td></tr><tr><td> Epifluorescerende microscoop voor beeldvorming </td><td> Zeiss, verschillende </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selectieve tracing van auditieve vezels in de avian embryonale evenwichtszenuw nerve

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

De embryonale kuiken is een veel gebruikt model voor de studie van perifere en centrale ganglion cel projecties. In het auditieve systeem, zou selectieve kenmerken van auditieve axonen in het VIIIe hersenzenuw verbeteren van de studie van de centrale auditieve circuit ontwikkeling. Deze aanpak is een uitdaging omdat meerdere zintuigen van het binnenoor bij te dragen tot de VIIIe zenuw 1. Bovendien markers die betrouwbaar auditieve onderscheiden ten opzichte van vestibulaire groepen van axonen binnen het aviaire VIIIe zenuw moeten nog worden geïdentificeerd. Auditieve en vestibulaire paden kan niet functioneel worden onderscheiden in het begin van embryo&#39;s, als zintuiglijke-reacties van de consument zijn niet aanwezig voor het schakelingen worden gevormd. Centraal projecteren VIIIe zenuw axonen zijn getraceerd in sommige studies, maar auditief axon labeling werd gevoegd waarin de door de andere VIIIe zenuw componenten 2,3. We beschrijven een werkwijze voor anterograde tracing van de akoestische ganglion selectief label auditieve axonen in het ontwikkelen van VIIIe zenuw. Ten eerste, na gedeeltelijke ontleding van het voorste Cephalic gebied van een 8-daagse kippenembryo ondergedompeld in zuurstofrijk kunstmatige cerebrospinale vloeistof, wordt het cochleaire kanaal geïdentificeerd door anatomische oriëntatiepunten. Vervolgens wordt een boete getrokken glazen micropipet gepositioneerd om een ​​kleine hoeveelheid rhodamine dextran amine injecteren in het kanaal en diep aangrenzende gebied waar de akoestische ganglion cellen zich bevinden. Binnen dertig minuten na de injectie, zijn auditieve axonen centraal getraceerd in de achterhersenen en kunnen later worden gevisualiseerd na histologische voorbereiding. Deze methode biedt een handig hulpmiddel voor ontwikkelingsstudies van perifeer naar centrale auditieve circuit formatie.

De componenten van de VIIIe zenuw en de anatomie van de zenuw zelf complexe en ingewikkelde (figuren 1, 3). Door selectief traceren vezels als gevolg van akoestische ganglioncellen, kan segmenten van de VIIIe zenuw en primaire afferenten auditieve hersenstam binnen de correct worden opgespoord en onderscheiden van hun tegenhangers vestibulaire (figuren 2, 3). Evenzo kan deze techniek gebruikt om perifere projecties van de akoestische ganglion cellen (Figuur 3G) bestuder...

Hier beschrijven we een methode, gevolgd door microdissectie fluorescerende kleurstof injectie in de akoestische ganglion vroege kippenembryo&#39;s voor selectieve tracering van auditieve axon vezels in de zenuw en achterhersenen.

Selectieve Tracing van auditieve vezels in de Avian Embryonale evenwichtszenuw Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Het doel van deze procedure is om selectief auditieve vezels te traceren van het perifere zenuwstelsel naar het centrale zenuwstelsel in een embryo. Dit wordt bereikt door eerst een microdose-sectie uit te voeren om het ventrale chondrocranium bloot te leggen en het aviaire cochleaire ductus te identificeren. De tweede stap is het uitvoeren van een micro-injectie in de onderliggende cellen van het akoestische ganglion en hun axonen.Vervolgens wordt het monster gedurende 20 minuten geïncubeerd in gezetteerde kunstmatige CSF om de DIA-overdracht mogelijk te maken. Ten slotte maken een histologische preparatie en coupes van het weefsel de microscopische visualisatie van de centrale projecties van het akoestische ganglion mogelijk. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zijn dat het selectieve tracing van de achtste hersenzenuw mogelijk maakt.Auditieve vezels met een hoge resolutie maken een snelle overdracht van kleurstof in levend weefsel mogelijk en maken experimenten in een vroeg ontwikkelingsstadium mogelijk. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het gehooronderzoek. Bijvoorbeeld, wat zijn de moleculen die axonen naar hun centrale doelwit leiden?Of hoe reageert het circuit op letsel of blootstelling aan ototoxische stoffen? Voeg eerst kunstmatige cerebrospinale vloeistof toe aan een Nalgene-pot van 500 milliliter met een brede opening totdat de pot voor twee derde gevuld is. Plaats het deksel, waarin een gat is geboord, terug op de pot.Plaats een bubbler met een stam, aangesloten op een tank met 95% oxygen en 5% carbon dioxide, door het gat in het deksel en in de A CSF. Zet het gas aan en stel de druk zo in dat er een constante stroom bellen ontstaat die ongeveer een derde van de vloeistof bereikt, maar niet krachtig genoeg is om spatten over de rand te veroorzaken. Dompel maximaal zes glazen vials van five milliliter in de pot om individuele monsters van elkaar te scheiden.En vanuit de turbulentie van de gasstroom. Laat de A CSF gedurende ten minste 20 minuten oxygeneren; terwijl de A CSF oxygeneert, trekken we glazen micropipetten terug en vullen we de micropipet opnieuw met een 6,25% rodine Dexter en am-immuunoplossing in PBS met 0,4% Triton XX. Bevestig de micropipet aan de micromanipulator en breek de tip met een fijne pincet om een opening van 20 tot 50 micron te vormen. Gebruik fijne slangetjes om de gestabiliseerde micromanipulator aan de pico-spritzer te bevestigen.Stel de pico spritzer in op 10 tot 30 PSI om de rest van de installatie te voltooien. Zorg ervoor dat er een klein siliconen dissectieschaaltje aanwezig is met twee dissectienaalden die in een kleine hexagonale vorm zijn geplaatst. Gebruik twee fijne pincetten.Eén gebogen pincet, een bekerglas van 50 milliliter en een container voor weefselafval in het dissectiegebied. Nadat het kippenembryo uit het ei is gehaald, plaatst u de kop op de met siliconen gecoate dissectieschaal. Positioneer de kop in het dissectiebakje met een ventrale weergave, zodat het oor aan de zijde van belang — in dit geval de rechterzijde — zichtbaar is.Zodra het weefsel in de juiste positie ligt, stabiliseert u het met dissectienaalden, waarbij u de regio van de rhomencefalon vermijdt. Gebruik het bekerglas van 50 milliliter om 30 milliliter van de zuurstofrijke A CSF in de schaal over te brengen, zodat het weefsel volledig is ondergedompeld. Gebruik vervolgens een fijne pincet om de onderkaak voorzichtig vast te pakken en naar beneden te pellen.Verwijder vervolgens het onderste ooglid aan de zijde van belang. Verwijder daarna het bovenliggende vaat- en weke weefsel, inclusief het resterende gehemelte en de keelholte. Zodra deze weefsels zijn verwijderd, zouden het gladde oppervlak van het ventrale schedeldak en de kenmerkende vertebris arteriën zichtbaar moeten zijn.Dissekeer voorzichtig de huid rond de externe meatus, het kraakbeen van het kaakgewricht en het middenoor, terwijl het binnenoor intact blijft. Gebruik de pincet om de kraakbenige structuren van de kaak en het middenoor voorzichtig weg te snijden. Gebruik nu een zachte vegende beweging met de fijne pincetpunten om de vertebris arteriën en opgehoopt bloed te verwijderen.Dit is belangrijk omdat bloed het zicht kan belemmeren en stolling de opening van de injectiepipet kan verstoppen. Op dit punt zou de kenmerkende witte tial-massa zichtbaar moeten zijn. De pijl in deze figuur geeft het cochleaire duct aan met het aangrenzende sensorische epitheel en het acoustische ganglion.Het bevindt zich direct onder het chondra cranium en kan, zoals hier te zien is, worden gevisualiseerd als een langgerekte, vingerachtige projectie die ventraal vanuit het binnenoor uitsteekt, met de apex nabij de anterieure middellijn om auditieve vezels te labelen. Plaats eerst de injectiepipet nabij het embryo-oppervlak van het cochleaire kanaal en de baula papular-regio en laat de micropipet langzaam zakken om eerst het cranium te doorboren. Dit deel van het cranium is dunner dan de omliggende gebieden en vereist minder kracht om te penetreren.De micropipet moet zich nu in het cochleaire ductus bevinden. Indien nodig kan hier een kleine injectie van een traceringskleurstof worden toegediend om de visualisatie van de basilarisperipilaar te ondersteunen. Zonder de micropipet te verplaatsen, wordt deze verder naar beneden bewogen tot deze net de diepe rand van het cochleaire ductus bereikt.Deze afbeelding toont de ideale positie van de pipet in het juiste gebied van het akoestische ganglion. Voer een injectie uit op dit punt en herhaal dit vervolgens in meerdere regio's langs de lengte van de basala papilla. Dit is afhankelijk van de gewenste mate van labelen en met uitzondering van de meest proximale punt waar de vestibular legina zich bevindt.Met de pico spritzer ingesteld tussen 10 en 30 PSI, moet elke injectie resulteren in een fluorescerende DIA-gelabelde plek van ongeveer 200 tot 400 micron in diameter, zoals hier te zien is. Zodra de injectie is voltooid, gebruikt u een pincet om het monster boven de hersenstam door te snijden, zoals hier geïllustreerd, en gebruikt u een transferpipet om het ruggenmerggedeelte in een van de kleine potjes in de houder met geparfundeerd CSF te plaatsen.Laat voor elk embryo 20 tot 30 minuten verstrijken voor de overdracht van de kleurstof, afhankelijk van de gewenste afstand van de centrale tracering. Zodra de incubatietijd is verstreken, wordt het weefsel verwijderd en klaargemaakt voor histologische doorsnijding. Hierbij wordt het weefsel gedurende een nacht ondergedompeld in 4%paraldehyde in one XPBS, gevolgd door een dehydratatie van een nacht in 30%sucrose in one XPBS.Nadat het weefsel gedurende de nacht is geëquilibreerd in 30% sucrose, wordt het in coronale vlakken cryosectie gedaan. Na het sectieproces kan immunolabeling met geschikte antilichamen de waarnemer helpen bij de anatomische lokalisatie en het identificeren van specifieke regio's van belang. Deze afbeelding toont het coronale aanzicht van de hersenstam van E6 met intacte bilaterale akoestische ganglia.De geschematiseerde rode pipet in S illustreert de nauwkeurige targeting van cellen in het akoestische ganglion vanaf een dorsolateraal instappunt. De coupes zijn immunogelabeld met anti-neurofilament om axonale projecties te accentueren. De vestibulaire organen bevinden zich rostrocaudaal ten opzichte van de getoonde coupe.De nervus vestibularis cochlearis is gelabeld, evenals het ganglion acousticum en het ganglion vestibularis. De dorsale zijde bevindt zich boven; de schaalbalk is gelijk aan 300 microns. Hier volgen representatieve beelden bij lage en hoge vergroting van selectieve tracing van auditieve vezels in een E8-embryo van 25 micron.Coronale doorsneden verzameld uit hetzelfde embryo tonen verschillende vlakken, zoals hier te zien is. RDA-gelabelde axonen kunnen worden gevolgd vanaf de injectieplaats, aangegeven door de pijlpuntsymbool, door de hersenzenuw, aangegeven door de pijl, en verder richting de primaire auditieve kernendoelen, aangegeven door de dubbele pijlpunt; de schaalbalk is gelijk aan 300 microns. Immunolabeling met anti-neurofilamentantilichamen accentueert alle axonale projecties, en de RDA-getraceerde vezels uit de vorige afbeelding bevinden zich binnen het auditieve projectiepad.AP en VP duiden respectievelijk de auditieve en vestibulaire componenten perifeer van het zenuwingangspunt. De samengevoegde kleurenfoto laat zien hoe de met RDA gelabelde axonen passen in de lokale anatomie. Een opname bij hoge vergroting van hetzelfde embryo op een meer cordale positie demonstreert de hoge resolutie van de vezels bij het zenuwingangspunt, aangegeven door een pijl, en langs het centrale pad, aangegeven door een dubbele pijl.Neurofilamentkleuring van alle axonen maakt de afbakening van P-N-S-C-N-S mogelijk, evenals het onderscheid tussen vermeende auditieve versus vestibulaire projecties. Opnieuw geven AP en VP respectievelijk de auditieve en vestibulaire componenten perifeer van het zenuwingangspunt aan, terwijl AC en VC respectievelijk de auditieve en vestibulaire projecties centraal van het zenuwingangspunt aanduiden. De overlay van afzonderlijke kanalen wordt opnieuw weergegeven als een kleurfusie.Histologisch onderzoek van het akoestische ganglion onthult de locatie van gelabelde akoestische ganglioncellen uit de vorige tracing en hun perifere projecties, aangegeven door het asterisk, die grotendeels teruggetraceerd zijn naar de basilaire papil. Hier staat AG voor het akoestische ganglion, bp voor de basilaire papil en lm voor de lamina macularia. De schaalbalk is gelijk aan 100 microns.Ten slotte laat deze illustratie een traceringspad van 700 micron zien dat wordt verwacht bij auditory-specifieke labelingen van de achtste hersenzenuw bij E8. De injectieplaats, aangegeven door de rode cirkel, bevindt zich dorsaal van het zenuwingangspunt en centrale projecties verlopen rostraal en caudaal. Eenmaal in de achterhersenen is de schaalbalk hier gelijk aan 300 micron.Pas bij het uitvoeren van deze procedure uw injecties aan om deze optimaal af te stemmen op uw analysecriteria. Houd er rekening mee dat er variabiliteit zal zijn in het exacte aantal en de locatie van de tracer-axonen tussen de monsters.

selective-tracing-auditory-fibers-avian-embryonic-vestibulocochlear

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the process of preparing wedge-shaped brain slices in a laboratory setting. Using a vibratome, a wedge-shaped slice from a mouse's brain is crafted with varying thickness. This slice contains the auditory nerve root positioned on the thicker end, while the hearing-related neurons are located on the thinner end.

Preparing Wedge Brain Slices to Visualize Auditory Neurons

Analyse van vestibulaire haar celfunctie wordt bemoeilijkt door hun locatie diep in het moeilijkste deel van de schedel, de petrous temporale bot. Meest functionele haarcellen studies hebben acuut gebruikt geïsoleerde haarcellen. Hier beschrijven we een semi-intacte bereiding van muis vestibulaire epitheel voor elektrofysiologische en twee-foton microscopie studies.

Een GeÃ ¯ soleerde semi-intacte Voorbereiding van de muis Vestibulaire Sensory epitheel voor elektrofysiologie en hoge-resolutie twee-foton microscopie

We presenteren een methode die de isolatie en kweek van cochleaire explantaten van het binnenoor van embryonale muizen beschrijft. We demonstreren ook een methode voor genoverdracht naar cochleaire explantaten via vierkantgolfelektroporatie. De in vitro explantaatkweek gekoppeld aan de genoverdrachtstechniek stelt onderzoekers in staat om de effecten van het veranderen van genexpressie tijdens de ontwikkeling te bestuderen.

Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie

Het gehoororgaan is betrokken bij het gehoor. Hier presenteren we een aangepaste in ovo micro-elektroporatiemethode, geoptimaliseerd voor het bestuderen van de proliferatie en differentiatie van auditieve stamcellen in het zich ontwikkelende gehoororgaan van de kip.

Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elektroporatie

Auditieve hersenstam neuronen van avians en zoogdieren zijn gespecialiseerd in snelle neurale codering, een fundamenteel proces voor normale gehoorfuncties. Deze neuronen ontstaan ​​uit duidelijke precursoren van embryonale hindbrain. We presenteren technieken die elektroporatie gebruiken om genen uit te drukken in het achterhoofd van kippenembryo's om de genfunctie tijdens de auditieve ontwikkeling te bestuderen.

In Ovo Electroporation in de Kip Auditory Brainstem

Dit protocol wordt beschreven methoden om vast te leggen van de auditieve brainstem response van postnatale rat pups. Om te onderzoeken de functionele ontwikkeling van buitenste haarcellen, is de experimentele procedure van geheel-cel patch klem opnemen in geïsoleerde buitenste haarcellen stapsgewijze beschreven.

Auditieve Brainstem Response en buitenste Haarcel geheel-cel Patch klem opname bij postnatale ratten

Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van niet-coronale auditieve hersenstamschijfjes van het kippenembryo voor het onderzoek naar tonotopische eigenschappen en ontwikkelingstrajecten binnen één hersenstamsegment. Deze segmenten omvatten sagittale, horizontale en horizontale / transversale secties die grotere tonotopische gebieden omvatten binnen een individueel segmentvlak dat de traditionele coronale secties omvat.

Snijden van de embryonale kip auditieve hersenstam om tonotopische gradiënten en microcircuits te evalueren

We hebben standaard auditieve hersenstamrespons (ABR) technieken gebruikt en toegepast op broedkippen, een vroegrijp vogelmodel voor auditieve functie. Het protocol schetst diervoorbereidings- en ABR-acquisitietechnieken in detail, met stappen die zich kunnen vertalen naar andere vogel- of knaagdiermodellen.

Evaluatie van auditieve hersenstamrespons bij kippenbroedjes

Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.

In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen

Met  behulp van ovo-elektroporatie hebben we een methode ontwikkeld om selectief het auditieve binnenoor en de cochleaire kern in kippenembryo's te transfecteren om een celgroepspecifieke knockdown van fragiele X mentale retardatie-eiwit te bereiken tijdens discrete perioden van circuitassemblage.

Ontleedende cel-autonome functie van fragiele X mentale retardatie-eiwit in een auditief circuit door In Ovo-elektroporatie

De stria vascularis is van vitaal belang voor het genereren van endocochleair potentieel. Hier presenteren we de dissectie van de volwassen muis stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining.

Dissectie van volwassen muis Stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining

Leer een microdissectietechniek om auditieve vezels selectief te traceren in kippenembryo's. Deze methode maakt hoge-resolutievisualisatie van de akoestische ganglion en zijn centrale projecties mogelijk.

Selectieve Tracing van auditieve vezels in de Avian Embryonale evenwichtszenuw Nerve

Meer video's verkennen