Laser Capture Microdissection van Verrijkt populaties van neuronen of Single Neuronen voor de analyse van genexpressie na traumatisch hersenletsel
10 april 2013
We beschrijven hoe laser capture microdissectie (LCM) om verrijkte populaties van hippocampale neuronen of afzonderlijke neuronen vastgezette gewonden rattenhersenen voor daaropvolgende analyse van genexpressie met kwantitatieve real time PCR en / of hele genoom microarrays verkrijgen.
Het algemene doel van deze procedure is om te demonstreren hoe verrijkte populaties van hippocampale neuronen en enkele neuronen uit bevroren weefselsecties kunnen worden verkregen door middel van laser capture microdissectie voor daaropvolgende genexpressieanalyse. Dit wordt bereikt door eerst een rat in een anesthesiegekamer te anesthetiseren. De rat wordt vervolgens geïntubeerd, mechanisch geventileerd en in een stereotactische hoofdhouder geplaatst om de rat voor te bereiden op vloeibare percussie hersenletsel, waarna een craniotomie wordt uitgevoerd.
De tweede stap is om de vloeistof percussie hersenletsel toe te dienen. Vervolgens worden coronale secties van de hersenen gesneden op een cryostaat en gekleurd met fluro aid, een marker voor degenererende neuronen, of real violet, een missielkleuring. De laatste stap is om laser capture micro dissectie uit te voeren en enkele neuronen of groepen neuronen te verzamelen.
Uiteindelijk wordt totaal RNA geïsoleerd uit de gevangen cellen, geanalyseerd op kwaliteit en gekwantificeerd met behulp van een Agilent bioanalyzer en gebruikt in downstream toepassingen zoals kwantitatieve real-time PCR en pathway gefocuste of genoom-wide microarray-analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals handmatige micro dissectie, is dat we verrijkte populaties van neuronen of andere hersencellen zoals gliacellen of immunomodulerende cellen, of enkele neuronen uit weefselsecties kunnen verkrijgen. Dit stelt ons in staat om genexpressieanalyse uit te voeren in verschillende geïdentificeerde celtypen in de hersenen en in andere heterogene weefsels bestaande uit meerdere celtypen, Dit zal worden gemist door deze procedure te demonstreren.
Debbie Boone, een senior onderzoeksmedewerker in ons laboratorium. Haal eerst de hersenweefsels op die zijn verkregen van ratten met vloeibare percussie, traumatische hersenletsel of schijnletsel uit de min 80 graden Celsius vriezer, en breng over naar min 22 graden Celsius. Cryostaat gedurende 10 minuten om de hersenen tot snijdtemperatuur te brengen terwijl de hersenen ontdooien.
Veeg de cryostaat af met RNA zap die ethanol bevat en maak de borstels schoon met ethanol. Nadat de 10 minuten zijn verstreken, haal het brein uit de buis en plaats het met de ventrale kant omhoog op een stuk gaas op de cryostaatstand, gebruik een nieuw scheermesje en snijd het brein om het achterste gedeelte van de hersenen te verwijderen. Net rostraal van het cerebellum en het voorste gedeelte bij de optische chiasma.
Vul een cryo mal met OCT montagemedium en plaats de hersenen in de mal met de voorkant naar beneden. Laat het hersenweefsel in het montagemedium bevriezen tot het wit wordt. Dit duurt ongeveer 10 minuten.
Vries nu de monster schijf op de hersenen met OCT vast. Verwijder vervolgens de mal. Plaats de schijf met de hersenen eraan vast in de monstersteun en draai de schroeven vast.
Plaats een wegwerpbare laag profiel kling in de messenhouder en draai de hendel vast. Begin met het snijden van de hersenen op 20 micron om de buitenste laag OCT te verwijderen. Zodra de hippocampale regio is bereikt, stel de microndiale in op 10.
Verzamel coronale seriële secties door een glazen plaat of plusglas te plaatsen. Schuif op de weefselsectie. Plaats de platen in een RNAs vrije bekledingsrek bij min 22 graden Celsius totdat het snijden voltooid is.
Voordat u doorgaat met het kleuren van de secties, veegt u alle kleurcontainers en schaalcilinders af met ese en spoelt u ze af in milli Q water. Zorg ervoor dat alle oplossingen zijn bereid met RNAs vrij water en dat de crestal violet en fluoro jade kleurstof eerder door een 0.2 micron filter zijn gegaan. Gebruik Thor hersensecties bij kamertemperatuur gedurende 30 seconden en fixeer in 75%ethanol gedurende één minuut.
Ga vervolgens naar de juiste tegenstof voor LCM van hetzij stroken van neuronen of individuele neuronen voor LCM van stroken van neuronen na fixatie, spoel de slides in RNAs vrije water gedurende één minuut, kleur met 1%crest violet gedurende één minuut. Spoel drie keer in RNAs vrij water gedurende één minuut elk, dehydrateer met 95%ethanol twee keer gedurende 30 seconden elk. Dan 100%ethanol twee keer gedurende 30 seconden en xyleen twee keer gedurende drie minuten elk.
Na het kleuren droogt u alle secties gedurende 15 minuten in een afzuigingskast en gaat u verder met LCM. Hier wordt LCM uitgevoerd. Gebruik een P-cel twee E-microscoop met een infrarood diodelaser, pas eerst de centrumjoystick aan in de verticale positie.
Draai vervolgens en vergrendel het Forex objectief in positie. Plaats een schuif met gekleurde hippocampale secties in het midden van de microscoopstand en pas handmatig aan tot de regio van de hippocampus in zicht is. Gebruik grove en scherpstellen aanpassingen.
Om de sectie scherp te stellen, activeer de vacuümklem door op de vacuümknop op de controller te drukken. Draai vervolgens en vergrendel het 10 x objectief op zijn plaats. Focus opnieuw met grove en fijne aanpassingen.
Laad uw macro LCM caps in de caps, uw cassettemodule en plaats een cap op de laadlijnpositie. Draai de cap plaatsing arm en positioneer rond de cap. Vervolgens verhoogt u de cap plaatsing arm om de caps uw cap uit de cassettemodule te verwijderen.
Draai de cap plaatsing arm over de schuif en laat het dan zakken over de schuif om de cap op de schuif te plaatsen. Pas de fijne focus aan en beweeg de joystick om te controleren of cellen zich binnen de zwarte cirkel op de cap bevinden. Alle cellen die moeten worden gevangen, moeten zich binnen deze zwarte cirkel bevinden.
Stel nu de laserparameters in. Druk eerst op de laser inschakelen knop op de controller. De laser doelgroep zal zichtbaar zijn als roze.
in het gezichtsveld op de computermonitor. Stel de laserspotgrootte in op klein om de laser te focussen en pas het vermogen en de duur aan op 65 tot 75 milliwatt gedurende één tot twee milliseconden, zoals nodig is voor optimale celvangst. Om de laser te testen, gebruikt u de joystick om de laserspot naar een gebied te verplaatsen waar geen cellen zijn om op te halen.
Activeer de laser met de duimschak
Overzicht
Dit artikel beschrijft het gebruik van laser capture microdissectie (LCM) om verrijkte populaties hippcampale neuronen of individuele neuronen te isoleren uit bevroren coupes van de beschadigde rattenhersenen. De geïsoleerde neuronen kunnen vervolgens worden gebruikt voor genexpressieanalyse via kwantitatieve real-time PCR en whole-genome microarrays.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Genexpressieanalyse
- Microdissectietechnieken
Achtergrond
- Lasercapture-microdissectie maakt de precieze isolatie van specifieke celtypen mogelijk.
- Hippocampale neuronen zijn van cruciaal belang voor het bestuderen van hersenletsel en herstel.
- Genexpressieanalyse biedt inzicht in cellulaire reacties na letsel.
- Deze techniek vormt een verbetering ten opzichte van traditionele handmatige dissectiemethoden.
Doel van de studie
- Om de procedure voor het isoleren van neuronen uit rattenbreinweefsel te demonstreren.
- Om genexpressieanalyse in verschillende celtypen te vergemakkelijken.
- Om het begrip van cellulaire mechanismen na hersenletsel te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van rattenhersenweefsel via anesthesie en craniotomie.
- Snijden van hersenweefsel met behulp van een cryostaat.
- Kleuring van secties voor de identificatie van neuronen.
- Toepassing van laser capture microdissectie voor het verzamelen van neuronen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van hippocampale neuronen uit bevroren coupes.
- RNA van hoge kwaliteit verkregen uit gevangen cellen.
- Analyse van genexpressie met behulp van kwantitatieve real-time PCR.
- Potentieel voor het bestuderen van diverse typen hersencellen en hun functies.
Conclusies
- Lasercapture-microdissectie is een effectieve methode voor het isoleren van neuronen.
- Deze techniek maakt gedetailleerde genexpressiestudies in specifieke celpopulaties mogelijk.
- Het biedt waardevolle inzichten in de cellulaire respons op hersenletsel.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Laser capture microdissectie (LCM) maakt de nauwkeurige isolatie van verrijkte neuronale populaties of individuele neuronen uit heterogeen hersenweefsel mogelijk, wat high-resolution genexpressieanalyse na traumatisch hersenletsel (TBI) ondersteunt. Deze mogelijkheid bevordert mechanistische risicoreductie en doelwitvalidatie door een directe vergelijking van transcriptionele profielen tussen beschadigde en onbeschadigde neuronen binnen anatomisch verschillende hippocampus-subregio's toe te staan. De aanpak versterkt het voorspellende vertrouwen in vroege ontdekkings- en translationele neurowetenschappelijke pipelines door moleculaire signaturen te koppelen aan functionele uitkomsten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar celtype-specifieke veranderingen in genexpressie na TBI in gedefinieerde hippocampusregio's.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door moleculaire pathways in stervende versus overlevende neuronen te onderscheiden.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door directe analyse van transcriptionele responsen geïnduceerd door letsel.
- Verbetert de voorspellende betrouwbaarheid voor targetselectie en prioritering in neurodegeneratieonderzoek.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde neuronale populaties voor voor downstream kwantitatieve PCR- en microarray-workflows.
- Waarborgt de reproduceerbaarheid van de assay door homogene celtypen te isoleren uit complexe weefselomgevingen.
- Maakt kwantitatieve meting van genexpressie in specifieke neuronale subtypen mogelijk, wat robuuste screeningsplatforms ondersteunt.
- Levert RNA van hoge kwaliteit dat geschikt is voor schaalbare transcriptomische analyses.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt moleculaire bevindingen uit aan ziekterelevante neuronale populaties die betrokken zijn bij cognitieve dysfunctie na TBI.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door single-cell- en populatie-analyses mogelijk te maken.
- Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door regio- en celtype-specifieke mechanismen van kwetsbaarheid en veerkracht te onthullen.
- Faciliteert de identificatie van translationele biomarkers via vergelijkende genexpressieprofilering.
Integratie van Pipeline en Workflow
Neuronale isolatie op basis van LCM integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door hypothese-gestuurde genexpressiestudies in gedefinieerde hersengebieden na letsel mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing over overlevings- en sterftekritische mechanismen van cellen in TBI-modellen.
- Screening: Levert reproduceerbare, celtype-specifieke monsters voor kwantitatieve genexpressie-assays.
- Analytics: Levert RNA van hoge kwaliteit voor robuuste PCR- en microarray-uitlezingen, waardoor vergelijkingen tussen condities mogelijk zijn.
- Translational Research: Verbindt moleculaire veranderingen in specifieke neuronen met functionele uitkomsten die relevant zijn voor cognitieve stoornissen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het isoleren van diverse hersenceltypen in verschillende neurologische ziekte-modellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in onderzoek naar neurodegeneratie.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows voor celisolatie en genexpressie voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliomanagement mogelijk in CNS-pipelines.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets en therapeutische hypothesen op basis van celtype-specifieke gegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in neuroanatomie, weefselverwerking en LCM-instrumentatie.
- Vereist toegang tot cryostaten, LCM-microscopen en platforms voor downstream moleculaire analyse.
- Necessiteert strikte standaardisatie van weefselbehandeling en kleuringsprotocollen tussen teams.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende hersenregio's of celtypen, afhankelijk van de ziektecontext.
- RNA-kwaliteit en opbrengst zijn gevoelig voor de timing van de procedure en contaminatiecontrole.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
2:00
Sectioning and Staining of Rat Brain for LCM
4:28
LCM of Swaths of Enriched Populations of Hippocampal Neurons
8:41
LCM of Single FJ+ Neurons in the Hippocampus
10:42
Results: Laser Capture Microdissection of Individual and Swaths of Hippocampal Neurons
12:51
Conclusion
