Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van adhesieve en oplosbare gradiënten om celmigratie te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst een oppervlak te passiveren om aspecifieke celadhesie te voorkomen. De tweede stap is het vervaardigen van stempels middels microcontactprinten.

Vervolgens wordt het behandelde oppervlak voorzien van een patroon van streptavidine-lijnen middels microcontactdrukken. Streptavidine kan ook als stippen worden gedrukt met behulp van dip-pen-lithografie aan de onderzijde van een microfluïdisch apparaat. Het gemodificeerde oppervlak zal dienen als basis voor een adhesiegradiënt van biotine-RGD.

De laatste stap is het laden van cellen op het oppervlak met de adhesieve stimulus in aanwezigheid van een gradiënt van een oplosbare chemo-attractant. Uiteindelijk wordt live-cell microscopie gebruikt om celmigratie aan te tonen als reactie op zowel adhesieve als oplosbare stimuli. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de transwell- of void chamber assay en een conventionele microfluidische opstelling, is dat het geïntegreerde systeem van het oppervlakgepatroneerde microfluidische apparaat de observatie van celresponsen op ruimtelijk gecontroleerde adhesieve stimuli, adhesieve gradiënten en een oplosbare gradiënt gelijktijdig mogelijk maakt.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van celmigratie, zoals het belang van celadhesie en cross-talk tussen chemotactische receptoren, waaronder receptor tyrosinekinasen, G-proteïnegekoppelde receptoren en adhesiereceptoren zoals integrines. Begin met het prepareren van de glazen dekglasjes. Reinig de dekglasjes door ze in een rek onder te dompelen in 100% ethanol en het rek gedurende 30 minuten in een sonicate waterbad te plaatsen. Laat de glazen dekglasjes aan de lucht drogen.

Sonicate vervolgens de glazen dekglasjes gedurende 30 minuten in één molar natriumhydroxide. Spoel daarna de glazen oppervlakken af door het rek voorzichtig te kantelen in een bekerglas gevuld met anderhalve liter milli cube water. Herhaal het spoelproces drie keer, waarbij elke keer vers milli cube water wordt gebruikt.

Droog na de derde spoeling de glazen dekglasjes in een oven bij 60 °C gedurende ongeveer een half uur. Plaats de helft van de schone glazen dekglasjes individueel in een bevochtigingskamer die is gemaakt van een 24-wells plaat, die gedeeltelijk met water is gevuld. De wells zijn gevuld met water en de glazen dekglasjes worden bovenop de wells gelegd voor de atie. Er wordt een copolymeer van polylysine en polyethyleenglycol gebruikt, waarbij 20% van de peg-moleculen zijn gekoppeld aan biotine.

Afgekort als PLL Peg biotine; druppel 15 µL PLL Peg biotine in PBS op elk glazen dekglas. Neem de andere helft van de overgebleven schone glazen dekglazen en klem de PEG-oplossing er voorzichtig tussen. Laat de dekglazen één uur in de bevochtigingskamer rusten.

Na een uur glijden de tussengeplaatste dekglasplaatjes voorzichtig van elkaar af zonder het met PEG gecoate oppervlak te schrapen, waarna ze worden gespoeld met UE-water. Het water zou gemakkelijk van de met PEG behandelde zijde af moeten glijden. Indien nodig.

Laat de glazen dekglasjes aan de lucht drogen op een papieren handdoek met de behandelde zijde naar boven gericht. Bewaar de glazen dekglasjes in een vacuümexsiccator tot verder gebruik. De siliciummaster die vereist is voor deze procedure wordt vervaardigd via fotolithografie om een PDMS-stempel te gieten. Giet het PDMS-elastomeer op de siliciummaster in een petrischaal tot een hoogte van ongeveer één centimeter en laat de master en het PDMS-mengsel uitharden in een oven bij 70 °C gedurende één uur.

Vervolgens wordt de PDMS-stempel van de silicium-master verwijderd en op maat gesneden om eiwitpatronen te printen met de microcontactprinttechniek. Maak de PDMS-stempels eerst schoon en maak ze hydrofieler door de zijde met het patroon gedurende anderhalf uur te behandelen in een UV- en ozonreiniger. Plaats direct na de ozonbehandeling 10 µL gestripte streptavidine op de PDMS-stempels en verspreid dit. Indien er sporen zichtbaar moeten zijn onder de fluorescentiemicroscoop, gebruik dan gestripte streptavidine die is geconjugeerd aan een fluorofoor, zoals gestripte streptavidine Alexa Fluor 488.

Laat het één uur in een vochtige kamer rusten. Verwijder overtollig strep din van de stempel met tissue, papier en lucht. Droog de stempel gedurende ongeveer één minuut.

Druk de stempel lichtjes op het met biotin gecoate glazen dekglas met PLL-pinnen. Indien fluorescent strep din is gebruikt, kan het patroon worden onderzocht met een epifluorescentiemicroscoop. Proteïnepatronen kunnen ook worden geprint met behulp van dip-pen lithografie.

Meng eerst één deel van één milligram per milliliter strippin of stripped avidan elif Fluor three 50 met 10 delen glycerol en breng vijf microliters van het mengsel aan op de cantilever. Pas de printsnelheid aan. Pas de contacttijd van de cantilever op het oppervlak of de verticale afstand van de cantilever tot het oppervlak aan om de spotgrootte te verkleinen.

Ongeveer vijf micrometer starten het printproces zoals beschreven in de gebruikershandleiding van het dip-pen lithografie-instrument. Alle geprinte oppervlakken worden in een droogkast bewaard. Een commercieel verkrijgbaar microfluïdisch apparaat wordt gebruikt om oppervlaktegradiënten te creëren.

Plak deze met tritin gecoate of gepatronde glazen dekglasjes op de plakkerige zijde van het apparaat om lekken gedurende enkele uren te voorkomen. Afdicht de randen van het apparaat met een dunne laag verwarmde Vaseline en met een tweede laag van een mengsel van één deel Vaseline en één deel paraffine. Vul het kanaal van het apparaat met 6 µL PBS om twee tegenstelde gradiënten te creëren.

Vul de twee reservoirs, één met 70 µL biotinyl-fluoresceïne en de andere met 70 µL biotine geconjugeerd aan het gebiotinyleerde peptide arginine-glycine-asparaginezuur (RGD). Incubeer de monsters gedurende één uur in het donker bij kamertemperatuur. Het spoelen van biotine, RGD en biotine-fitsy uit het microfluïdische apparaat is het moeilijkste aspect van deze procedure, omdat er een risico bestaat op het insluiten van luchtbellen en het verstoren van de via microcontactprinten aangebrachte sporen. Om succes te garanderen, moeten de biotine en PBS voorzichtig en langzaam worden verwijderd.

Verwijder de biotine-oplossingen en spoel het oppervlak voorzichtig twee keer af met PBS terwijl het nog is bevestigd aan het microfluïdische apparaat. Markeer de richting van de adhesiegradiënt voordat fluorescentieel gelabelde cellen in het microfluïdische apparaat worden geladen. Tel de cellen en verdeel deze over twee buisjes met een gelijk aantal cellen.

Was en resuspendeer. Suspendeer één buis cellen in medium dat het chemoattractant bevat, zoals DMEM met laag glucosegehalte en 10% FBS, en de andere buis cellen in medium zonder het chemoattractant, zoals DMEM met 0% FBS. De uiteindelijke concentratie cellen in elke buis moet 5 × 10⁵ cellen per milliliter zijn.

Verwijder alle oplossingen uit het microfluïdische apparaat en plaats het op de voorverwarmde microscooptafel. Laad 70 µL cellen resuspendeerd in 0% FBS-DMEM in één reservoir. Laad 70 µL cellen resuspendeerd in 10% FBS-DMEM in een ander reservoir.

Plak losjes tape over de reservoirs om verdamping te voorkomen. Zorg ervoor dat het kanaal van het microfluïdische apparaat zich in het gezichtsveld bevindt en de cellen scherp zijn gesteld. Selecteer de parameters voor beeldacquisitie, zoals de belichtingstijden en fluorescentiefilters.

Beeldsequentie van brightfield en fluorescentie, waarbij cellen, sporen, tijdspunten en de opnameduur worden ingesteld om het beeldacquisitieprogramma te starten. Deze video demonstreert een methode voor live-cell imaging van cellen die migreren in een omgeving met concurrerende adhesieve en oplosbare gradiënten. Adhesieve sporen die fluorescerend strippin en gebiotinyleerd RGD bevatten, werden gecreëerd met microcontactprinten of dip-pen lithografie.

Succesvolle microcontactdruk is zichtbaar aan het lijnprofiel van de fluorescentie-intensiteit over de sporen, waarbij adhesieve sporen en antifouling-regio's duidelijk van elkaar te onderscheiden zijn. Stippen die met dip-pen lithografie zijn gedrukt, zien er rond uit en niet traanvormig, wat duidt op een succesvol drukproces. In dit voorbeeld zijn de stippen in een lijn gedrukt met een rij- en kolomafstand van 10 tot 15 micrometers.

Deze afstand is voldoende om te voorkomen dat stippen in elkaar overvloeien, maar maakt het mogelijk om meerdere stippen in één gezichtsveld te bekijken. Met de meeste microscoopinstellingen werd met het eenvoudige microfluidische apparaat een gradiënt van adhesieve signalen op het geprinte spoor gecreëerd, door biotin four fluorescein en biotin RGD in de tegenovergestelde zijden van een microfluidisch kamerpaneel te laden.

Afbeelding A toont 60 mozaïekbeelden die zijn genomen met een totale beeldlengte van 3072 micrometers. In paneel B werd de fluorescentie-intensiteit gemeten over de gehele lengte van het mozaïek. Lineaire trendlijnen zijn aangepast aan de fluorescentie-intensiteit om de RGD-gradiënt in het kanaal aan te geven.

Na het verwijderen van de biotine-RGD-oplossing kan dezelfde kamer worden gebruikt om een oplosbare gradiënt te introduceren. Paneel A toont de fluorescentie-intensiteit van fluoresceïnekleurstof nabij de reservoirs gevuld met PBS en fluoresceïne, en over het kanaal bij T gelijk aan nul. Paneel B toont de fluorescentie-intensiteit van de oplosbare signalen.

Na een incubatie van 16 uur wijzen de vergelijkbare resultaten erop dat de gradiënt gedurende ten minste 16 uur stabiel was. Celmigratie in een microfluïdische kamer met tegengestelde gradiënten werd met deze methode waargenomen en een representatieve film wordt hier getoond. De adhesieve gradiënt bestond uit geïmmobiliseerd RGD op strepavidin-sporen en de oplosbare gradiënt liep van 0 tot 10% FBS.

De beelden werden elke 15 minuten genomen gedurende een totale periode van 20 uur. De getoonde overgang van de beelden is acht frames per seconde. Deze tweede film toont een enkele heli-cel die migreert in de richting van de FBS-bron.

De getoonde beeldovergang is acht frames per seconde. De blauwe lijn die het celpad weergeeft, is verkregen via celltrackingsoftware. Deze laatste afbeelding toont de celpaden van de beelden uit de eerste film.

Celbanen die migreerden naar de hogere concentratie van oplosbaar FPS zijn in het rood weergegeven; celbanen die migreerden naar hogere concentraties van adherent RGD zijn in het zwart weergegeven. Deze banen toonden aan dat meer HeLa-cellen migreerden naar de bron van het chemo-attractant dan naar hogere concentraties van adherent RGD. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om verdamping van PBS of medium in het microfluidische apparaat te voorkomen tijdens de bereiding van de adhesiegradiënt en de time-lapse imaging; gebruik indien nodig plakband om alle inlaats van het microfluidische apparaat af te dekken na het volgen van deze procedure.

Andere methoden, zoals transfectie en hybrid solution microscopie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de biomechanica van het cytoskelet dat werkt via eiwitten, focale adhesie-eiwitten en receptoren tijdens celmigratie.