Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Het algemene doel van deze procedure is om kleef- en oplosbare gradiënten te creëren om celmigratie te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst een oppervlak te passieven om niet-specifieke celadhesie te voorkomen. De tweede stap is om stempels te fabriceren met behulp van micro contact printing.

Vervolgens wordt het ated-oppervlak gepatternd met strep avid-lijnen door micro contact printing. Strapped din kan ook als stippen worden afgedrukt met behulp van dip pen lithography die aan de onderkant van een microfluïdisch apparaat is bevestigd. Het gemodificeerde oppervlak zal fungeren als een fundament voor een kleefstofgradiënt van biotin RGD.

De laatste stap is om cellen op het oppervlak te laden met de kleefstof cue in de aanwezigheid van een oplosbaar chemo-attractant-gradiënt. Uiteindelijk wordt levendcelmicroscopie gebruikt om celmigratie te laten zien in reactie op zowel kleef- als oplosbare cues. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals transwell of void chamber assay en een conventionele microfluïdische opstelling is dat het gedesintegreerde systeem van oppervlakpatroon Microfluïdisch apparaat de observatie van celreacties op ruimtelijk gecontroleerde kleefstof cues en een kleefstofgradiënt en een oplosbaar gradiënt tegelijkertijd mogelijk maakt.

Nou, deze methode kan helpen om sleutelvragen in het gebied van celmigratie te beantwoorden, zoals de belangrijkheid van celadhesie en de oorzaak van een beroerte tussen chemo Texas receptoren zoals receptor kinase G-eiwit-gekoppelde receptoren en adhesiereceptoren zoals RIN To ate glas deksels. Maak eerst de deksels schoon door ze onder te dompelen in een rek in 100% ethanol en de rek in een son skating waterbad te plaatsen gedurende 30 minuten. Droog de glazen deksels in de lucht.

Soniceer vervolgens de glazen deksels gedurende 30 minuten in één molair natriumhydroxide. Spoel daarna de glasoppervlakken door voorzichtig de rek in een beker te kantelen die gevuld is met anderhalve liter milli cube water. Herhaal het spoelproces drie keer met elke keer vers milli cube water.

Na de derde spoeling droogt u de glazen deksels in een oven op 60 graden Celsius gedurende ongeveer een half uur. Plaats de helft van de schone glazen deksels afzonderlijk in een vochtige kamer die is gemaakt van een 24-well plate, gedeeltelijk gevuld met water. Wells zijn gevuld met water en de glazen deksels worden bovenop de wells gelegd voor de ation, Een copolymeer van polylysine en polyethyleenglycol wordt gebruikt waarbij 20% van de peg-moleculen zijn gegraft op biotin.

Afgekort als PLL Peg biotin, druppel 15 microliter PLL Peg biotin in PBS op elke glazen deksel. Neem de andere helft van de resterende schone glazen deksels en leg voorzichtig de PEG-oplossing ertussen. Laat de deksels een uur in de vochtige kamer.

Na een uur schuift u de gesandwichde deksels voorzichtig uit elkaar zonder het PEG-gecoate oppervlak te schrabben en spoelt u ze met UE-water. Het water zou gemakkelijk op de peg-behandelde kant moeten glijden. Indien nodig.

Laat de glazen deksels drogen op een papieren handdoek met de behandelde kant naar boven. Bewaar de glazen deksels in een vacuüm-dessicante tot verder gebruik. De siliconen master die vereist is voor deze procedure wordt vervaardigd door fotolithografie om een A-P-D-M-S-stempel voor de PDMS-elastomeer op de siliconen master binnen een petrischaal te gieten tot een hoogte van ongeveer een centimeter en de master en PDMS-mengsel in een oven op 70 graden Celsius gedurende een uur te laten uitharden.

Vervolgens wordt de PDMS-stempel verwijderd van de siliconen master en gesneden op maat om eiwitpatronen te printen met behulp van de micro contact printing-techniek, eerst schoon te maken en om de PDMS-stempels meer hydrofiel te maken door de patroonkant een anderhalf uur in een UV- en ozonreiniger te behandelen direct na de ozonbehandeling plaats. En verspreid 10 microliters van stripped adin op de PDMS-stempels. Als tracks zichtbaar moeten zijn onder de fluorescerende microscoop, gebruikt u stripped Aden dat is geconjugeerd aan een fluoro vier, zoals stripped avid en LOR drie 50.

Laat het een uur in een vochtige kamer staan. Verwijder overtollig strep din uit de stempel met weefsel, papier en lucht. Droog de stempel gedurende ongeveer een minuut.

Druk de stempel lichtjes op de PLL peg biotin-gecoate glazen deksel. Als er fluorescerend strep din is gebruikt, bekijk dan het patroon onder een epifluorescentiemicroscoop. Eiwitpatronen kunnen ook worden afgedrukt met behulp van dip pen lithography.

Meng eerst één deel van één milligram per milliliter, strippin of stripped avidan elif Fluor drie 50 met 10 delen glycerol en laad vijf microliters van het mengsel op de cantilever. Pas de printsnelheid aan. Contacttijd van de cantilever op het oppervlak of een verticale afstand van de cantilever tot het oppervlak om de spotsgrootte te verminderen.

Begin ongeveer vijf micrometer met het afdrukproces zoals beschreven in de gebruiksaanwijzing van het dip pen lithography-instrument. Alle bedrukte oppervlakken in een dessicaat. Een commercieel verkrijgbare microfluïdische apparaat wordt gebruikt om oppervlaktegradiënten te creëren.

Hecht deze tritin-gecoate of gepaterde glazen deksels op de plakkerige kant van het apparaat om ervoor te zorgen dat er gedurende enkele uren geen lekkage is. Verzegeld de randen van het apparaat met de dunne laag verwarmde vaseline en met een tweede laag van een mengsel van één deel vaseline op één deel paraffinewas. Vul het kanaal van het apparaat met zes microliters PBS om twee tegenover elkaar liggende gradiënten te creëren.

Vul de twee reservoirs, één met 70 microliters biotin, vier fluoresceïne en de andere met 70 microliters biotin geconjugeerd aan biotinyleerd peptide arginine glycine spartic acid of RGD, incubeer de monsters op kamertemperatuur in het donker gedurende één uur. Het spoelen van biotin, RGD en biotin fitsy van het microfluïdische apparaat is het moeilijkste aspect van deze