Cel Bevolking Analyses Tijdens Skin Carcinogenesis

Het algemene doel van deze procedure is om celpopulatieanalyses uit te voeren in het muismodel van basaalcelcarcinomen, een type huidkanker. Dit wordt bereikt door eerst de expressie van doelgenen in muizen te induceren. In de tweede stap wordt de epidermis geïsoleerd uit de muishuid.

Na het genereren van een enkele celsuspensie, worden de epidermale cellen gelabeld met specifieke celmarkers. Uiteindelijk kunnen celpopulatie veranderingen tijdens tumorontwikkeling in de huid worden gemonitord door middel van flowcytometrische analyse. Kankerontwikkeling is een proces dat veel celtypen omvat.

Het doel van deze procedure is om onderzoekers te helpen onderzoeken hoe verschillende cellen bijdragen aan de ontwikkeling van huidkanker. Deze methode kan inzicht geven in cellulaire interacties tijdens de ontwikkeling van huidkanker, maar kan ook worden toegepast op andere systemen zoals pancreaskanker. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat het moeilijk is om te bepalen wanneer het experiment moet worden beëindigd zonder visuele evaluatie.

Om te beginnen, kruis ma keratin 14 Cree ER muizen, aangeduid als K 14 muizen met Rosa 26 muizen die het YFP-gelabelde mutante smoothened-gen SMU M twee, aangeduid als SMU.Mice, bevatten. Vervolgens worden staartspecimens van 0,5 centimeter lang, afkomstig van drie tot zes weken oude dubbel positieve muizen, ondergedompeld in directe PCR-staartlyseoplossing met één milligram per milliliter proteinase K. Daarna worden de specimens overnacht bij 55 graden Celsius geïncubeerd met schudden. De volgende dag worden de weefsels op topsnelheid in een microcentrifuge gedraaid om puin te verwijderen.

Vervolgens om elk dier te genotypen, gebruikt u één microliter van de SNAT van elk specimen in individuele PCR-reacties met de primers en omstandigheden zoals aanbevolen door de leverancier. Gebruik een gebogen 20 gauge-voedingsnaald om tamoxifen toe te dienen aan dieren. Dubbel positief voor K 14 C er en ROSA 26 via orale gavages gedurende vijf opeenvolgende dagen om OO M twee expressie in de keratinocyten te induceren.

In het algemeen zijn de fenotypes ernstiger op het oor en de staart van GFP-gelabelde K 14 OO muizen om de huid voor celanalyse te oogsten. Gebruik eerst een tremor om de vacht van het geëuthaniseerde dier te verwijderen. Verwijder vervolgens de muishuid en dompel het weefsel in disbe-oplossing bij 37 graden Celsius gedurende één tot twee uur.

Na de dispa-behandeling, gebruikt u een paar pincetten om de epidermis van de dermis te scheiden. Gebruik nu een paar schaar om de epidermis in stukjes te snijden. Dompel vervolgens het weefsel gedurende één tot twee uur bij 37 graden Celsius in een 50 milliliterbuis in collagenase vier-oplossing.

Zwiep voorzichtig met de buis om de cellen los te maken elke 20 minuten. Gebruik een microscoop om celdissociatie te bevestigen wanneer enkele cellen in het collagenase-medium kunnen worden gedetecteerd. Incubeer het specimen nog eens 30 minuten om de celopbrengst te verhogen.

Filtreer vervolgens het weefselmengsel door een 70 micron celzeef en was de cellen gedurende 10 minuten bij 500 keer G en kamertemperatuur om de cellen te labelen. Begin met het resuspenderen van het net gewassen pellet in PBS aangevuld met 10% FBS bij 2,5 keer 10 van de zes cellen per milliliter. Plaats vervolgens de celoplossing 30 minuten op ijs om eventuele niet-specifieke binding te blokkeren. Breng vervolgens aliquoten van de cellen over naar 1,5 milliliter microbuizen voor specifieke antilichaamlabeling.

Voeg de antilichamen toe aan elke buis met een uiteindelijke concentratie van twee microgram per milliliter. Vortex de buizen voorzichtig enkele seconden om de antilichamen met de cellen te mengen en plaats de buizen vervolgens nogmaals 30 minuten op ijs. Na het wassen van de buizen in één milliliter PBS, resuspendeer de pellets in PBS en voeg vervolgens DPI toe met een uiteindelijke concentratie van één milligram per milliliter.

Bij het analyseren van de gegevens, selecteert u eerst enkele cellen op basis van de voorwaartse verstrooiing versus zijwaartse verstrooiing grafiek, waarbij de DABI-positieve dode cellen worden uitgesloten. Muizen ontwikkelen geen basaalcelcarcinomen, behalve wanneer hedgehog-signalering wordt geactiveerd zoals te zien is in deze afbeeldingen. De door tamoxifen geïnduceerde expressie van het oncogeen smoothened smooth M twee YFP resulteert in een huidfenotypus die duidelijk zichtbaar is, zelfs op het anatomische groeiniveau in de huid h en e-gekleurde specimens van deze dieren.

Huidtumoren kunnen worden waargenomen in K 14 SMU muizen. Zonder SMU M twee YFP-inductie, vertoonde de dierenhuid geen abnormale morfologie door h en e. Kleuring van deze puntplots toont een representatieve analyse van myeloide cellen in normale en tumordragende muizen.

De CD 11 B-positieve GR een positieve cellen zijn afgeleid van myeloide cellen, waarvan sommige myeloide-afgeleide onderdrukkende cellen zijn in normale en niet SMU M twee YFP-geïnduceerde muizen. De CD 11 B-positieve GR een positieve celpopulatie is nauwelijks detecteerbaar, maar neemt toe als reactie op ontsteking of tumorontwikkeling. In K 14 SMU muizen.

De geïnduceerde expressie van smu M twee YFP en keratinocyten in de huid resulteert in een toename van de CD 11 B-positieve GR een positieve celpopulatie. Deze techniek zal onderzoekers op het gebied van huidbiologie in staat stellen om moleculaire analyse van B-celcelcarcinoom bij muizen uit te voeren.