Opnemen van elektrische activiteit van geïdentificeerde neuronen in de intacte hersenen van transgene Fish

Het algemene doel van deze procedure is het registreren van elektrische activiteiten van neuronen in een intacte preparatie van een vissenbrein. Dit wordt bereikt door eerst een transgene meca vis van vier tot zes maanden oud te anesthetiseren in MS 2 22, om vervolgens het brein te disseceren. Vervolgens wordt een van de neuronen van belang, gelabeld met GFP, gecontacteerd met een registratie-elektrode, waarna de elektrische activiteiten worden geregistreerd via loose patch of whole cell patch clamp elektrofysiologie.

Uiteindelijk kunnen de resultaten veranderingen laten zien in de vuurfrequentie van actiepotentialen of veranderingen in het membraanpotentiaal als reactie op verschillende behandelingen in het intacte brein. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals elektrofysiologie van cellen en culturen of hersenplakpreparaten, is dat we de elektrische eigenschappen van neuronen kunnen karakteriseren in een preparaat van het gehele brein met intacte neurale circuits. Hoewel deze metingen inzicht bieden in de reproductieve neuroendocrinologie, kunnen ze ook worden toegepast op andere neurologische systemen door gebruik te maken van vissen zoals zilverkarpers, bijvoorbeeld voor neuronen die motivatie en affectief gedrag aansturen.

In deze demonstratie worden transgene zebravisjes gebruikt waarin GnRH3-neuronen genetisch zijn gelabeld met GFP. Begin met het anesthetiseren van een volwassen zebravis door deze onder te dompelen in 5 mL MS-222. Zodra de kieuwbewegingen na enkele minuten zijn gestopt, wordt de vis overgebracht naar een Petri-schaal van 60 mm met visfysiologische zoutoplossing. Gebruik vervolgens een schaar om de vis te onthoofden bij het kieuwendeelte van het anterieure uiteinde.

Breng de kop over naar een Petrischaal van 35 millimeter diameter, die half gevuld is met visseksnelzout en bekleed is met yl guard. De schaal vereist een centrale verdieping waarin de kop met de dorsale zijde naar boven kan worden gepositioneerd en vastgezet met insectenspelden. Snijd voorzichtig het dorsale deel van de schedel open langs de rand.

Verwijder vervolgens voorzichtig de schedel met een pincet om het dorsale deel van de hersenen bloot te leggen, inclusief het anterieure deel van het ruggenmerg. Til nu voorzichtig het ruggenmerg op met een fijne pincet en knip vervolgens de bilaterale verbindingszenuwen door met een fijne schaar. Dit omvat het doorsnijden van de hersenzenuwen, de spinale zenuwen, de optische zenuwen aan de ventrale zijde en de anterieure reukzenuwen.

Plaats de volledig gedissecteerde hersenen onder een microscoop in een nieuwe Petrischaal gevuld met verse visfysiologische zoutoplossing. Controleer zorgvuldig of de gehele hersenen en de hypofyse intact zijn en niet zijn doorgesneden of doorprikt. Gooi beschadigde hersenen weg en begin opnieuw met behulp van een naald.

Plaats een kleine druppel snelhardende lijm, zoals cyanoacrylaat, in het midden van de registratiekamer. Verspreid de lijmdruppel over een oppervlakte van één vierkante centimeter. Breng vervolgens de hersenen snel over naar de lijm.

Bevestig het met de ventrale zijde naar boven. Vul de registratiekamer nu met ongeveer een milliliter vissensaline om de hersenen te bedekken. Verwijder met de fijne pincet voorzichtig de meninges over het oppervlak van het registratiegebied van de hersenen in voorwaartse richting.

Perfuseer de hersenen continu met beluchte visse-zoutoplossing met een snelheid van ten minste 200 microliters per minuut. Maak enkele glazen micro-elektroden van zes tot 10 mega ohm en vul deze voor ongeveer de helft met loose patch-registratie-oplossing. Lokaliseer met een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop met een gekoelde CCD-camera de GFP-expresserende terminale zenuwen gn RH drie neuronen, beginnend met het 10 x objectief.

Schakel vervolgens over naar het 40 x objectief en lokaliseer de neuronen op of nabij het ventrale oppervlak van de olfactory bulbs, net anterieur van het cephalon. Schakel nu over naar een videomonitor die real-time beelden van de microscoop weergeeft. De neuroncluster bevat acht tot 10 GnRH-neuronen.

Plaats de micro-elektrode in het bad van de registratiekamer met de punt van de elektrode boven het doelnuron. Breng een constante, lichte positieve druk aan om te voorkomen dat de micro-elektrode verstopt raakt. Benader het doelnuron voorzichtig met de punt van de elektrode en controleer en monitor de elektrodeweerstand met Axo graft-software.

Bij het uitvoeren van de seal-test in voltage-clamp-modus verandert de weerstand van de elektrode licht op het moment dat de punt van de elektrode het oppervlak van het neuron raakt. Laat de positieve druk los om een seal met een lage weerstand te vormen en pas indien nodig een lichte negatieve druk toe. De meest kritische stap voor een goede registratie is het selecteren van een schoon stukje axon, wat helpt bij het creëren van een ideale seal tussen de elektroden en het membraan.

Schakel nu over naar de current clamp-modus. Open Chart, een PowerLab-programma, en begin met het continu registreren van de membraanspanning zonder enige stroominput; pas indien nodig de schaal van de spanning en de registratiesnelheid aan. Registreer de baseline-elektrische activiteit in normale vissensaline gedurende ongeveer vijf minuten voordat er behandelingen worden toegepast. Bath-perfusie van geneesmiddelen, hormonen, peptiden, enzovoort, moet aan de hersenpreparaat worden toegevoegd met een stroomsnelheid van 200 µL per minuut.

Gebruik vervolgens normale visfysiologische zoutoplossing voor een uitspoelperiode nadat een cel is gelokaliseerd en controleer de elektrodeweerstand in voltage-clamp-modus. Wanneer de punt van de elektrode zich op het oppervlak van het neuron bevindt en de elektrodeweerstand licht verandert, wordt de positieve druk weggenomen en wordt er een kleine negatieve druk toegepast om een hoog-resistieve seal op het neuron te vormen.

Pas een zachte mondzuiging toe. Doorbreek het gepatchte celmembraan. De weerstand zal onmiddellijk dalen tot ongeveer 120 tot 250 mega ohm wanneer het membraan breekt.

Schakel nu over naar de current-clamp-modus en registreer de membraanspanning continu met de chart-functie zonder enige stroominjectie. Pas indien nodig opnieuw de schaal van de spanning en de registratiesnelheid aan. Nadat er gedurende ongeveer vijf minuten een basislijnregistratie van de elektrische activiteit in normale vissenzoutoplossing is gemaakt, worden de behandelingen toegepast, gevolgd door een uitwasperiode. De spontane elektrische activiteiten van moca terminale zenuw GNRH drie-neuronen werden geregistreerd in current-clamp-modus.

De typische vuursnelheid bedraagt 0,5 tot zes hertz actiepotentialen. Deze vuren gewoonlijk in een tonisch of kloppend patroon met een vrij regelmatig interspike-interval, waarbij het membraanpotentiaal tussen de spikes gemiddeld ongeveer min 48 millivolts bedraagt. Deze experimentele aanpak is ook succesvol bij het registreren van GFP-gelabelde GNRH-neuronen in de voorhersenen van volwassen transgene dieren.

De elektrische activiteit van neuronen in het uitgesneden, intacte brein van transgene zebravissen werd geregistreerd op een vergelijkbare wijze als beschreven voor een DACA via loose patch. Dezelfde technieken maakten tevens whole-cell registratie mogelijk.

In tegenstelling tot de GnRH-neuronen in de meca terminale zenuw, is het patroon van spontane actiepotentiaalontladingen van zebrafish GnRH-neuronen in het pre-optische gebied, het ventrale cephalon en de hypothalamus vaak onregelmatig. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in één uur worden uitgevoerd voor een opname van 15 minuten, mits deze correct wordt uitgevoerd. Veel succes.