Name: Stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke Gene Manipulation in de muis Spinal Cord (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke genmanipulatie in het ruggenmerg van de muis. Deze methode maakt gerichte genexpressie mogelijk in de lumbale dorsale hoorn voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Bakhos A. Tannous, Ph.D., directeur van Vector Ontwikkeling en Productie in de Neuroscience Center van het Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, voor het verstrekken van ons met de rAAV-EGFP vector, en John Whang voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies R01 NS050408 (naar JS) van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke.

De beschreven chirurgische procedure is goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Columbia University. 1. Voorbereiding van apparatuur en Virus deeltjessuspensie <ol><li> Reinig en desinfecteer de apparatuur, steriliseren van de chirurgische instrumenten en de V notch spikes die zullen worden gebruikt om de wervel L1 op te lossen. </li><li> Trek en schuine glazen pipetten. Wij gebruiken pipetten die een tip diameter van 40 urn en afgeschuind onder een hoek van 20 °. Steriliseer de glazen pipetten. </li><li> Stel de stereotactische frame, monteer de micro-injector op de manipulator en sluit de injector naar de controller. </li><li> Bevestig een van de glazen pipetten om de micro met behulp van de compressie montageset. </li><li> Verwijder de zuiger uit de micro en vul de spuit met minerale olie. Oil Red O (1 - (2,5-dimethyl-4-(2,5-dimethylphenylazo) fenylazo)-2-naftol) worden toegevoegd aan de minerale olie de v verhogenisibility. Plaats de zuiger en duw het helemaal naar de top. Zorg ervoor, het creëren van een luchtbel. </li><li> Bereid het virusdeeltje suspensie in een bioveiligheid kast. Ontdooi de bevroren virus op ijs en vlak voor gebruik te verdunnen met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing om de gewenste deeltjesconcentratie. </li><li> Plaats de micro in de houder op de injector. </li><li> Pipetteer 5 ul van de virus suspensie op een plastic plaat, bijv. Parafilm. Laat de glazen pipet tip in de drop en trek de zuiger naar de micro te vullen. Maak een kleine luchtbel in de pipetpunt om te voorkomen dat verstopping. </li></ol> 2. Laminectomie <ol><li> Bereid de operatie gebied schoon door bank en verwarming pad met een desinfecterend middel. </li><li> Verdoof de muis. We maken gebruik van inhalatie-anesthesie met isofluraan (3% tijdens de inductie, 2% -3% tijdens onderhoudswerkzaamheden). </li><li> Plaats glijmiddel op elk oog om de ogen te beschermen tegen uitdrogen tijdens dewerking. </li><li> Scheren de vacht van de lagere naar de hals van de muis en ontsmet de huid met afwisselende doekjes van een topisch antisepticum zoals chloorhexidine of povidon-jood en 70% ethanol. Isoleer de aseptisch bereide site met chirurgische doek en infiltreren de incisie site met bupivacaïne (0,25%, 1:10 verdund met een fysiologische zoutoplossing). </li><li> Insnijden van de huid aan het caudale einde van de ribbenkast langs de middellijn (2-3 cm) en scheid de fascia die de wervelkolom. </li><li> Omdat het ruggenmerg stopt met groeien eerder tijdens de postnatale ontwikkeling dan wervelkolom, spinale segment L4 ligt onder de eerste lendenwervel (L1). Wervel L1 ligt caudaal van de wervel dat de laatste paar ribben heeft. Identificeer en bloot wervel L1 door het verwijderen van de kleine spinale spieren en ligamenten gehecht aan zijn dorsale oppervlak. </li><li> Iets optillen en wervel L1 vast te houden met een Adson tang. Gebruik een speciale laminectomie een tang om de dorsale portio verwijderenn van de wervel (wervelkolom en lamina) en bloot het ruggenmerg. Voorkom beschadiging van het ruggenmerg. </li><li> Breng de muis op de verwarmingsplaat in de stereotactische frame. De temperatuur van de muis tijdens de volgende bewerking. </li></ol> 3. Injectie <ol><li> Fix wervel L1 met V inkeping spikes. De spikes moeten stabiliseren de wervelkolom, zodat de wervels niet beweegt tijdens de ademhaling. </li><li> Breng de micro-dichter, zodat de pipet tip is boven de laminectomie site. Laat de zuiger totdat u de virussuspensie het verlaten van de pipet. Verwijder de druppel met een steriele wattenstaafje. </li><li> Plaats de pipetpunt in de rostrale meest deel van de blootgestelde ruggenmerg. Centreer de pipet boven de achterste mediaan sulcus, verplaats dan de tip 500 um lateraal. Laat de tip naar het oppervlak van het snoer en prik de dura mater, of, als u werkt met een unbeveled glazen pipet, een afgeschuinde stalen canule gebruiken om het doorprikken van de dura. Laat de uiteinde van de glazen pipet 300 pm in het ruggenmerg. </li><li> Injecteer 1 pl virussuspensie met een snelheid van 200 nl / min. </li><li> Aan het einde van de injectie, wacht tenminste 2 min voordat langzaam terugtrekken van de pipet. </li><li> Herhaal stap 3,3 tot 3,5 bij de caudale grootste deel van de blootgestelde ruggenmerg volledige verdeling van de virale vector in spinale segment L4 bereiken. De twee injectieplaatsen liggen rostrale en caudale van het segment L4 tot weefselschade in het doelgebied voorkomen. </li></ol> 4. Wondsluiting <ol><li> Op de markt wervel L1 van de V notch klemmen en verwijder de muis van de stereotactische frame. </li><li> Hecht het fascia met 5,0 Vicryl. De gesloten fascia biedt dekking voor de laminectomie site. </li><li> Sluit de huid met nylon hechtingen of chirurgische nietjes. </li></ol> 5. Postoperatieve zorg <ol><li> Breng de muis om een ​​herstel kooi met zachte, nonparticular beddengoed. Plaats het op thij kant voor comfortabele ademhaling. Bewaak het dier totdat het volledig alert, ambulante en begint te drinken. </li><li> Wij postoperatieve analgesie gedurende 72 uur met dagelijkse subcutane injecties van carprofen (5,0 mg / kg). </li><li> Monitor postoperatieve herstel door dagelijkse inspectie voor de eerste 3 dagen, daarna om de dag of 3 dagen per week tot het experiment is voltooid. </li><li> Verwijder de huid hechtingen of nieten 7 tot 10 dagen na de operatie, bij wondgenezing is voltooid. </li><li> Euthanaseren het dier na afloop van het experiment. </li></ol>

<ol><li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).</li>
<li>Couto, L. B., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector-mediated+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Viral vector-mediated RNA interference.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li>
<li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Lo, L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent%2C+anterograde+transsynaptic+viral+tracer+for+mapping+output+pathways+of+genetically+marked+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons.</a> Neuron. 72, 938-950 (2011).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8, 745-752 (2011).</li>
<li>Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+sensory+axon+regeneration+in+adult+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord.</a> J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).</li>
<li>Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+intraspinal+plasticity+after+spinal+cord+injury+alters+the+severity+of+autonomic+dysreflexia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia.</a> J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-targeted+gene+therapy+improves+survival+and+motor+function+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).</li>
<li>Lutz, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsymptomatic+restoration+of+SMN+rescues+the+disease+phenotype+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).</li>
<li>Chen, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dsAAV+type+2-mediated+gene+transfer+of+MORS196A-EGFP+into+spinal+cord+as+a+pain+management+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).</li>
<li>South, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+deletion+of+the+NR1+subunit+of+the+NMDA+receptor+in+adult+spinal+cord+dorsal+horn+reduces+NMDA+currents+and+injury-induced+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain.</a> J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).</li>
<li>Tappe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaffolding+protein+Homer1a+protects+against+chronic+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain.</a> Nat. Med. 12, 677-681 (2006).</li>
<li>Colle, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+intracerebral+delivery+of+AAV5+vector+encoding+human+ARSA+in+non-human+primate%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate.</a> Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).</li>
<li>Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+Transplantation+of+Mouse+Neural+Stem+Cells+into+the+Spinal+Cords+of+Mice+Infected+with+Neurotropic+Mouse+Hepatitis+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus.</a> J. Vis. Exp. (53), e2834(2011).</li>
<li>Snyder, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+for+spinal+cord+and+motor+neuron+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery.</a> Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).</li>
<li>Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+serotype+6+%28rAAV2%2F6%29-mediated+gene+transfer+to+nociceptive+neurons+through+different+routes+of+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pain%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery.</a> Mol. Pain. 5, 52(2009).</li>
<li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian.</a> 8, 148-154 (1994).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Stereotactische injectie vector kan gericht ruggenmerg neuronen voor toepassingen zoals neuronale netwerk mapping op basis transsynaptic virusverspreiding 6,7 of optogenetic dissectie 8, axon begeleiding tijdens regeneratie van letsel 9,10 of gentherapie voor de preventie of behandeling van neurodegeneratie 11, 12. Virale vectoren zijn gebruikt voor genetische manipulatie in het ruggenmerg te bestuderen somatosensorische, motorische en autonome wegen 9,10,13-15. De ...

Geavanceerde technologieën voor voorwaardelijke genmanipulatie in de muis kan veelzijdige benaderingen van de exploratie van synaptische paden en functionele verbindingen in het centrale zenuwstelsel. Transgenen kan worden geregeld door kleine molecule effectoren zoals doxycycline die op een door tetracycline gecontroleerde transactivator, die kunnen worden ontworpen om als een repressor of activator van gentranscriptie, tamoxifen of herkennen van een gemuteerd ligand-bindend domein van de oestrogeen receptor 1 . Onomkeerbare transgene modificatie wordt meestal bereikt door desoxyribonucleïnezuur (DNA) recombinases. Cre (oorzaken recombinatie) en Flp (flippase recombinatie enzym) katalyseren de excisie, inversie of translocatie van DNA-fragmenten die worden geflankeerd door loxP (locus of kruising x over, P1) of Frt (flippase erkenning doel) sites, respectievelijk 1. Toepassingen omvatten genactivering of silencing en induceerbare ribonucleïnezuur (RNA) interferentie <sup&gt; 2. Conditionele expressie van fluorescerende of enzymatische reporters zoals β-galactosidase of alkaline fosfatase kan worden gebruikt om neuronen labelen en onderzoek naar de actuele organisatie en verbinding 3. Grootschalige projecten mutagenese in Noord-Amerika ( <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ) en Europa ( <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a> ) produceren van bibliotheken van muis embryonale stamcellen klonen met conditionele gen doelen en valkuilen die uiteindelijk de gehele muis genoom. Muizen gegenereerd uit deze klonen kunnen worden gekruist met een toenemend aantal muizenlijnen die uitdrukken DNA recombinases onder promoters of loci specifiek voor een bepaalde populatie neuronen voor selectieve genmanipulatie ( <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php</a> ). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; evenwel beperkt genmanipulatie tot afzonderlijke populaties van neuronen of bepaalde gebieden plaats niet worden bereikt door genetische richten alleen als een promotor specifiek voor de populatie neuron plaats niet bekend is of niet die door alle neuronen in de regio van belang. In het ruggenmerg kan experimenteel ontwerpen vereisen ruimtelijke beperking van de genetische manipulatie een of twee craniocaudale segmenten. Stereotactische injectie van een virale vector die Cre of Flp expressie kan beperken gen recombinatie regio in het ruggenmerg van muizen waarbij DNA-fragmenten worden geflankeerd door loxP of Frt sites, zogenaamde floxed of flrted allelen. In tegenstelling tot de constitutieve DNA herschikking, die zou voortvloeien uit kruisingen van de dieren met recombinase uitdrukken muizen, deze strategie biedt ook tijdelijke controle over gen-activatie of silencing. Virale vectoren die coderen floxed of flirtte transgenen bieden een omgekeerde optie van genetische manipulatie in muizen die het corresponding recombinase stroomafwaarts van een neuron-specifieke promoter. Verschillende recombinante vectoren met affiniteit voor neuronen zijn 4. Hoge capaciteit (laf) adenovirus, adeno-geassocieerd virus, herpes simplex virus en lentivirus worden gebruikt neurotrope vectoren. Het selecteren van de juiste virus voor een onderzoeks-vraag is een cruciaal onderdeel van de experimentele opzet. Grootte van het transgen levering route, specificiteit van de infectie neuronen in tegenstelling tot gliacellen, infectie efficiëntie, ontstekings-en toxische bijwerkingen moeten worden overwogen 4. Hier beschrijven we de stereotaxische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn van het ruggenmerg, een techniek die we gebruiken voor voorwaardelijke genregulatie in ons onderzoek naar de neurobiologie van pijn. De dorsale hoorn ontvangt afferente input van primaire somatosensorische neuronen inclusief nociceptieve neuronen. Lokale interneuronen verwerken de informatie voordat projectie neuronen het overbrengen vande dorsale hoorn naar de hersenen 5. We demonstreren de infectie van dorsale hoorn neuronen spinale segmentale niveau L4 met een neurotrope recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) die versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) tot expressie brengt onder een constitutief actieve promoter cytomegalovirus.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiaalnaam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td></td></tr><tr><td> Spinal bodemplaat </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> Klein dier stereotaxische instrument </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> Muis gas narcose hoofd houder </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td> Verstelbare voet mounts </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> V notch spikes </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> Kleine dieren temperatuur controle systeem </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td> Adson forceps </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.006-12 </td><td></td></tr><tr><td> Laminectomie tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.223-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump (een) met SYS-Micro4 Controller </td><td> Wereld Precisie-instrumenten </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-injectiespuit, 65RN </td><td> Hamilton </td><td> 7633 tot 01 </td><td></td></tr><tr><td> RN knelkoppeling, 1 mm </td><td> Hamilton </td><td> 55.750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicaatglas haarvaten </td><td> Wereld Precisie-instrumenten </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke gene manipulation in de muis spinal cord

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymale injectie van een virale vector kan afhankelijk genmanipulatie in verschillende populaties van neuronen of bepaalde delen van het centrale zenuwstelsel. We tonen een stereotactische injectie techniek gerichte genexpressie of silencing in de dorsale hoorn van het ruggenmerg kan muis. De chirurgische procedure is kort. Het vereist laminectomie van een enkele wervel, die voorziet in een snel herstel van het dier en ongeschonden beweeglijkheid van de wervelkolom. Gecontroleerde injectie van een kleine vector schorsing volume bij lage snelheid en het gebruik van een micro-met afgeschuinde glazen canule minimaliseren het weefsel laesie. De lokale immuunrespons op de vector hangt af van de intrinsieke eigenschappen van de gebruikte virus, in onze ervaring is klein en kort als een recombinant adeno-geassocieerd virus wordt gebruikt. Een reportergen zoals versterkt groen fluorescent eiwit vergemakkelijkt controle ruimtelijke verdeling van de vector en de werkzaamheid en cellulaire specificity van de transfectie.

Succesvolle transfectie levert robuuste genexpressie in neuronen van de geïnjecteerde dorsale hoorn (Figuur 1), sparen de dorsale hoorn van de contralaterale zijde, de ventrale hoorn en de dorsale wortel ganglia. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Transfectie van dorsale hoorn neuronen. (A) Expressie van het fluorescerende reporter EGFP (groen) in de linker dorsale hoorn van het ruggenmerg L4, twee weken na ster...

Virale vectoren kunnen gerichte genetische manipulatie. We tonen een werkwijze voor voorwaardelijke genexpressie of ablatie in de muis ruggenmerg, met stereotactische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn, een prominente plaats van synaptische contacten tussen primaire somatosensorische afferenten en neuronen van het centrale zenuwstelsel.

Stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke Gene Manipulation in de muis Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Het algemene doel van deze procedure is om ruimtelijk beperkte genexpressie in het ruggenmerg van de muis te bereiken door stereotactisch een virale vector in het lumbale dorsale hoorn te injecteren. De eerste stap van de procedure is het lokaliseren en blootleggen van de lumbale wervel. De tweede stap is het verwijderen van het dorsale deel van de wervel om het ruggenmerg zichtbaar te maken.Een procedure die laminectomie wordt genoemd. Vervolgens wordt een glazen pipet, verbonden met een microspuitpomp, boven de dorsale hoorn geplaatst en in het ruggenmerg gebracht. De laatste stap is het langzaam injecteren van de vectorsuspensie.Twee weken later wordt de transfectie van neuronen in de dorsale hoorn aangetoond door de expressie van groen fluorescerend eiwit, wat het mogelijk maakt om de distributie van het virus te volgen. Deze methode helpt bij het verduidelijken van de functie van neuronen in delen van het sensorische pad. We passen dit toe in studies die specifiek gericht zijn op de ontwikkeling van inflammatoire of neuropathische pijn.Een visuele demonstratie is cruciaal om te leren hoe de muis in het stereotactische frame moet worden geplaatst. Voor het slagen van de procedu

stereotaxic-injection-viral-vector-for-conditional-gene-manipulation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Porlan, E., et al. Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates stable genetic modification of neural stem cells (NSCs) in the ventricular-subventricular zone (V-SVZ) through stereotaxic injection of a virus-carrying therapeutic gene in a mouse model. The virus enters NSCs, undergoes reverse transcription, integrates into the genome, and...

Stereotaxic Injection of Viruses for Stable Genetic Modification in a Mouse Model

Source: Chen, S., et al., Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the stereotaxic injection of a viral vector encoding Cre recombinase and green fluorescence protein or GFP into the striatum of a genetically modified mouse pup to achieve gene manipulation by excising a loxP-flanked STOP cassette, activating red fluorescence protein or RFP as a reporter.

Stereotactic Microinjection of a Viral Vector for Gene Manipulation in a Mouse Pup Striatum

Source: Tadokoro, T., et al. Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates a subpial injection technique for gene delivery to the spinal cord in mice. The procedure involves exposing the dura mater, puncturing the pia mater, and injecting a recombinant adeno-associated virus (rAAV) carrying a fluorescent protein-expressing gene into the subpial space. Following injection and recovery, the virus facilitates gene expression in...

Subpial Gene Delivery in the Mouse Spinal Cord to Evaluate Gene Expression

Source: Pereira, M. et. al., In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates stereotaxic injection of an adeno-associated virus into the cerebral cortex of a transgenic mouse to deliver Cre-dependent neuronal reprogramming and fluorescent reporter genes into glial cells.

Stereotaxic Injection of Viral Vectors for Glial Cell Reprogramming in a Mouse Model

Source: Fricano-Kugler, C. J., et al. Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates stereotaxic viral injection for precise neuronal gene editing in the mouse brain. The protocol ensures accurate virus delivery to the dentate gyrus, enabling fluorescent labeling and CRISPR-mediated gene knockout to study neural circuits, gene function, and disease mechanisms in vivo.

Stereotaxic Viral Injection for Targeted Neuronal Gene Editing in the Mouse Brain

Source: Li, D., et al. Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for the intrathecal injection of adeno-associated viruses (AAV) into the cerebrospinal fluid (CSF) of an awake mouse, covering syringe preparation, spinal alignment, and precise needle insertion. This method validates targeted gene delivery, supporting its potential for CNS therapies.

Intrathecal Delivery of Viruses in a Mouse Model for Treating Central Nervous System Diseases

De CRISPR / Cas9 systeem biedt de mogelijkheid om gerichte genoom bewerken toegankelijk en betaalbaar voor de wetenschappelijke gemeenschap. Dit protocol is bedoeld om te demonstreren hoe virussen die een gen van belang met behulp van de CRISPR / Cas9 systeem zal knock-out, en dan injecteren ze stereotaxically in de volwassen hersenen van muizen te creëren.

Ontwerpen, Verpakkingen en Levering van hoge titer CRISPR Retro en Lentivirussen via Stereotaxische Injection

Intraspinal injectie van recombinase afhankelijk recombinante adeno-associated virus (rAAV) kan worden gebruikt om te manipuleren alle genetisch gelabelde celtype in het ruggenmerg. Hier beschrijven we hoe transduce van neuronen in de dorsale Hoorn van het lumbale ruggenmerg. Deze techniek maakt functionele ondervraging van het subtype gemanipuleerde neuron.

Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

Dit protocol toont injectie van een retrogradely vervoerbare virale vector in rat ruggenmerg weefsel. De vector is overgenomen in de synaps en vervoerd naar de cel lichaam van doel neuronen. Dit model is geschikt voor retrograde tracering van belangrijke spinale trajecten of targeting cellen voor gen-therapie-toepassingen.

Directe inspuiting van een lentivirale Vector hoogtepunten meerdere Motor trajecten in het ruggenmerg Rat

Dit protocol demonstreert een nieuwe methode voor het toepassen van gentherapieën op subpopulaties van cellen bij neonatale ratten in de postnatale leeftijd van 5-10 dagen door een anterograde chemogenetische modifier in de somatomotorische cortex en een retrograde transporteerbaar Cre-recombinase in het cervicale ruggenmerg te injecteren.

Gericht op het corticospinale kanaal bij neonatale ratten met een dubbel-virale vector met behulp van gecombineerde hersen- en wervelkolomchirurgie

Een lumbale intrathecale injectie vertegenwoordigt een translationeel relevante toedieningsweg voor het toedienen van gentherapie aan het centrale zenuwstelsel. Dit uitgebreide gestandaardiseerde protocol voor lumbale intrathecale injecties bij neonatale, juveniele en volwassen muizen en ratten is bedoeld om onderzoekers te begeleiden bij het toepassen van deze techniek voor preklinische gentherapiestudies.

Lumbale intrathecale injectie van gentherapievectoren voor targeting van het centrale zenuwstelsel bij muizen en ratten

Leer stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke genmanipulatie in het ruggenmerg van de muis. Deze methode maakt gerichte genexpressie mogelijk in de lumbale dorsale hoorn voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke Gene Manipulation in de muis Spinal Cord

Meer video's verkennen