Stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke Gene Manipulation in de muis Spinal Cord
18 maart 2013
Virale vectoren kunnen gerichte genetische manipulatie. We tonen een werkwijze voor voorwaardelijke genexpressie of ablatie in de muis ruggenmerg, met stereotactische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn, een prominente plaats van synaptische contacten tussen primaire somatosensorische afferenten en neuronen van het centrale zenuwstelsel.
Het algemene doel van deze procedure is om ruimtelijk beperkte genexpressie in het muizenruggenmerg te bereiken door stereotactisch een viraal vector in de lumbale dorsale hoorn te injecteren. De eerste stap van de procedure is het lokaliseren en blootleggen van de lumbale wervel. De tweede stap is het verwijderen van het dorsale deel van de wervel om het ruggenmerg te onthullen.
Een procedure genaamd laminectomie. Vervolgens wordt een glazen pipet, verbonden met een micro-spuitpomp, boven de dorsale hoorn gepositioneerd en in het ruggenmerg neergelaten. De laatste stap is het langzaam injecteren van de vector-suspensie.
Twee weken later wordt transfectie van dorsale hoorn neuronen aangetoond door de expressie van groen fluorescerend eiwit, wat het mogelijk maakt om de verdeling van het virus te volgen. Deze methode helpt bij het verduidelijken van de functie van neuronen in een deel van de sensorische route. We gebruiken het in studies die zich specifiek richten op de ontwikkeling van inflammatoire of neuropathische pijn.
Visuele demonstratie is cruciaal voor het leren hoe de muis in het stereotactische frame te positioneren. Het is essentieel voor het succes van de procedure dat de wervelkolom goed is gefixeerd omdat de laminectomie zo'n delicate techniek is. Martin Mole, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren.
John Wang, een onderzoeksassistent, zal hem helpen. Eén of twee dagen voorafgaand aan de procedure. Trek glas pipetten om een tipdiameter van 40 micrometer te verkrijgen en schuin de tip op een hoek van 20 graden op de dag van de operatie. Begin de procedure met het desinfecteren van de chirurgische apparatuur en het voorbereiden van de steriele chirurgische gereedschappen om het stereotactische frame op te zetten.
Monteer de micro-spuitinjector op de manipulator en sluit het apparaat aan. Bevestig een van de glas pipetten aan de micro-spuit met behulp van de compressiefitting. Verwijder nu de plunjer van de micro-spuit.
Vul de spuit met de minerale olie en plaats de plunjer opnieuw in en duw hem helemaal naar de punt. Zorg er zorgvuldig voor dat er geen luchtbellen ontstaan. Plaats vervolgens de micro-spuit in de houder op de injector.
Vervolgens haalt u het virus uit de vriezer en bereidt u de virusdeeltjessuspensie net voor gebruik voor door deze te verdunnen met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing tot de gewenste deeltjesconcentratie. Pipetteer vijf microliter van de virussuspensie op een klein stukje param. Laat vervolgens de punt van de glaspipet in de druppel zakken en trek de plunjer om de micro-spuit te vullen.
Aan het einde. Maak een kleine luchtbel bij de pipettenpunt om verstopping te voorkomen. Bereid in deze stap het operatiegebied voor door de tafel in het verwarmingskussen af te vegen met ontsmettingsmiddel.
Vervolgens verdooft u de muis door isofluraan in te ademen. Breng vervolgens glijmiddel aan op elk oog om ze tijdens de operatie te beschermen tegen uitdroging. Scheer daarna het haar van de onderrug tot de nek van de muis. Desinfecteer de huid met afwisselende wissers van een topisch antisepticum, zoals chloorhexidine of povidon-jodium, en 70% ethanol.
Infiltreer vervolgens de incisieplaats met 0,25% bupivacaïne verdund met een verhouding van één op tien met fysiologische zoutoplossing. Insnijdt vervolgens de huid aan het coddle-uiteinde van de ribbenkast, twee tot drie centimeter langs de middellijn en scheidt de fascia die de wervelkolom bedekt. Identificeer wervel L één, die zich coddled bevindt bij de wervel, die het laatste paar ribben vasthoudt en onthult deze door de kleine spinale spieren en ligamenten die aan zijn dorsale oppervlak zijn gehecht te verwijderen.
Til vervolgens lichtjes en houd wervel L één vast met een paar add en forceps. Gebruik vervolgens een speciale laminectomie forceps om het dorsale deel van de wervel te verwijderen, inclusief het spinaas en de lamina om het ruggenmerg bloot te leggen. Vermijd schade aan de duur moeder of het ruggenmerg tijdens deze procedure.
Breng vervolgens de muis over naar een verwarmingsplaat in het stereotactische frame en bewaak de temperatuur van de muis tijdens de volgende operatie. Gebruik nu de v-notch spikes om de wervelkolom te stabiliseren, zodat de wervel niet beweegt tijdens het ademen. Breng vervolgens de micro-spuit dichterbij zodat de punt van de pipet zich boven de laminectomie-site bevindt.
Laat de plunjer zakken totdat u de virussuspensie uit de pipet ziet stromen. Verwijder de druppel met steriele gaas. Plaats vervolgens de punt van de pipet op het rostrale deel van het blootgestelde ruggenmerg.
Centreer de pipet boven de achterste mediane sulcus en beweeg de punt 500 micrometer lateraal. Laat daarna de punt naar het oppervlak van het koord zakken en prik de duur moeder. Laat vervolgens de punt van de glaspipet 300 micrometer in het ruggenmerg zakken.
Injecteer één microliter virussuspensie met een snelheid van 200 nanoliter per minuut. Wacht aan het einde van de injectie minimaal twee minuten voordat u de pipet langzaam terugtrekt. Herhaal de injectieprocedure op het coddle-uiteinde van het blootgestelde ruggenmerg om een volledige verdeling van de virale vector in het spinale segment L vier te bereiken.
De twee injectieplaatsen bevinden zich rostrale en coddle ten opzichte van het L vier-segment. Om weefselschade in het doelgebied na de injectie te voorkomen, verwijdert u wervel L één uit de V-notchklemmen en verwijdert u de muis uit het stereotactische frame. Naai vervolgens de fascia met vijf oh Vicryl.
De gesloten fascia biedt bescherming voor de laminectomie-site. Sluit vervolgens de huid met nylonnaden of chirurgische hechtingen. Zorg voor post-operatieve pijnstilling gedurende 72 uur met dagelijkse subcutane injecties van carprofen bij vijf milligram per kilogram.
Breng de muis over naar een herstelkooi met zachte, niet-specifieke bedden. Plaats de muis op zijn zij voor comfortabel ademen. Bewaak vervolgens het dier totdat het volledig alert
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert een methode voor het bereiken van ruimtelijk beperkte genexpressie in het ruggenmerg van de muis door middel van stereotaxische injectie van een virale vector in het dorsale hoorn van de lendenregio. Deze techniek maakt gerichte genmanipulatie mogelijk, in het bijzonder in gebieden met synaptisch contact tussen primaire somatosensorische afferenten en neuronen van het centraal zenuwstelsel.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Gentherapie
- Ruggenmergonderzoek
Achtergrond
- Virale vectoren worden gebruikt voor genmanipulatie.
- De lumbalen dorsale hoorn is een belangrijke plek voor synaptische interacties.
- Conditionele genexpressie kan helpen bij het begrijpen van neurale mechanismen.
- Stereotaxische injectie is een nauwkeurige methode voor het targeten van specifieke hersenregio's.
Doel van de studie
- Om gerichte genexpressie in het ruggenmerg te bereiken.
- Om de effecten van genmanipulatie op de functie van het ruggenmerg te onderzoeken.
- Om een methodologisch kader te bieden voor toekomstig onderzoek.
Gebruikte methoden
- Het lokaliseren en blootleggen van de lumbale wervel.
- Het uitvoeren van een laminectomie om toegang te krijgen tot het ruggenmerg.
- Het gebruik van een glazen pipet verbonden met een micro-spuitenpomp.
- Het injecteren van de virale vectorsuspensie in de dorsale hoorn.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle injectie van de virale vector in de dorsale hoorn van het lumbale ruggenmerg.
- Conditionele genexpressie waargenomen in de gerichte neuronen.
- Methode bewees effectief te zijn voor ruimtelijk beperkte manipulatie.
- Potentiële toepassingen bij het bestuderen van aandoeningen gerelateerd aan het ruggenmerg.
Conclusies
- De methode maakt nauwkeurige genmanipulatie in het ruggenmerg mogelijk.
- Het kan worden gebruikt om de rol van specifieke genen in de neurale functie te onderzoeken.
- Deze benadering kan ons begrip van de fysiologie van het ruggenmerg verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Stereotaxische toediening van virale vectoren maakt nauwkeurige, ruimtelijk beperkte genmanipulatie mogelijk in de achterhoorn van het ruggenmerg bij muizen, een sleutelregio voor onderzoek naar sensorische verwerking en pijnpaden. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie en mechanische risicobeperking bij neurologische ontdekkingen door conditionele genexpressie of silencing in gedefinieerde neuronale populaties mogelijk te maken. De methode biedt een reproduceerbaar platform om genetische targets te koppelen aan functionele fenotypes in preklinische pijnmodellen, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen bij de selectie van targets.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door conditionele genexpressie mogelijk te maken in specifieke populaties neuronen in het ruggenmerg.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde chirurgische benadering voor een consistente targeting van het lumbalen dorsale hoorn over verschillende studies heen.
- Predictieve waarde: Ondersteunt fenotypische screening van genfuncties in pijnpaden, wat bijdraagt aan de beoordeling van de betrouwbaarheid van targets.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare transfectiemetrieken (bijv. EGFP-expressie) om de efficiëntie van vectoraflevering en cellulaire specificiteit te beoordelen.
- Operationele waarde: Maakt de preparatie van gevalideerde biologische systemen mogelijk voor downstream screening van verbindingen of modulatoren in pijnmodellen.
- Schaalbaarheid: De korte procedure (30–40 minuten) en het snelle herstel van het dier ondersteunen een hogere doorvoer in discovery-workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert direct de mechanismen van inflammatoire en neuropathische pijn, wat aansluit bij de prioriteiten van het therapeutische gebied.
- Translationele continuïteit: Verbindt modulatie van doelen in het ruggenmerg met gedragsmatige pijnfenotypes, wat de preklinische validatie ondersteunt.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt mechanistische risicoreductie mogelijk door genspecifieke effecten te isoleren in een ziekterelevante kringloop.
Integratie van Pijplijn en Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelwit hypothesen via lead-identificatie tot preklinische validatie, in het bijzonder voor CNS-doelwitten die betrokken zijn bij sensorische verwerking.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door ruimtelijk beperkte genmanipulatie in gedefinieerde regio's van het ruggenmerg mogelijk te maken.
- Screening: Levert kwantitatieve read-outs (bijv. fluorescentie-intensiteit, cel-specifieke transfectiepercentages) voor het evalueren van de vectorprestaties en het biologische effect.
- Analytics: Maakt correlatie van transfectie-efficiëntie met functionele uitkomsten mogelijk, wat bijdraagt aan beoordelingen van dosis-respons en target engagement.
- Translationeel onderzoek: Verbindt genmanipulatie in het ruggenmerg met pijn-gerelateerde fenotypes, ter ondersteuning van preklinische studies die zijn afgestemd op biomarkers.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar chirurgisch platform dat aanpasbaar is aan verschillende virale vectoren, promotoren of transgenen over meerdere projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door off-target effecten te verminderen en de anatomische precisie in genmanipulatiestudies te vergroten.
- Operationele waarde: Bevordert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde stereotaxische coördinaten, injectieparameters en postoperatieve zorg.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door mechanistische duidelijkheid te verschaffen over de targetfunctie in pijnbanen.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van gevalideerde fenotypes van het ruggenmerg.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in stereotaxische chirurgie bij knaagdieren, microsurgische technieken en het uitvoeren van aseptische procedures.
- Afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder een stereotaxisch frame, een microspuitpomp en schuine glazen pipetten.
- Vereist gestandaardiseerde preparatie van virale vectoren en titerverificatie voor een consistente dosering tussen experimenten.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende segmenten van het ruggenmerg, virale serotypes of transgene payloads.
- Praktische beperkingen omvatten chirurgische variabiliteit en weefselrespons, die moeten worden beheerst door training van de operator en standaardisatie van het protocol.
