Name: Micro-stromingsvisualisatie voor Velocity Profiel Metingen van Micro Blood Flows (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Leer micro-stromingsvisualisatie voor snelheidsprofielmetingen van bloedstromen in microkanalen. Deze methode helpt onderzoekers stromingsdynamica analyseren voor biomedische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag NSERC (Natural Sciences and Engineering Council of Canada) bedanken voor financiering, Catherine Pagiatikis voor haar hulp in de eerste runs, Sura Abu-Mallouh en Frederick Fahim voor het testen van het protocol, Richard Prevost van LaVision, Inc voor technische ondersteuning, en Guy Cloutier van de Universiteit van Montreal voor de lening van de Dalsa high-speed camera.

1. Microchip Fabrication De eerste stap is het maken of kopen van uw microchannel. Er zijn vele mogelijkheden voor microchip materiaal. Een van de meest voorkomende materialen gekozen poly (dimethylsiloxaan) (PDMS). Er zijn vele publicaties over aanwijzingen voor PDMS fabricage door zachte lithografie 16,17,18. Zodra de PDMS kanaal wordt vervaardigd, zijn er verschillende oppervlaktebehandelingen beschikbaar zijn natuurlijke hydrofobiciteit keren. Zuurstofrijk plasma behandeling is een veel voorkomende optie. Zhou, Ellis, en Voelcker (2009) geven een overzicht van oppervlaktebehandelingen en hoe ze PDMS beïnvloeden. Deze resultaten zijn voor water echter, en bloed heeft verschillende eigenschappen. Een studie over wat dat betekent voor oppervlaktebehandeling bloed is gedaan door Pitts et al.. (2012a). Voor de hier gepresenteerde resultaten, microchip oppervlakken en de glaasjes warengebonden aan beide werden blootgesteld aan zuurstof plasma gedurende 45 seconden en vervolgens samengeperst stevig resulteert in een permanente hechting. 2. Blood Bereiding <ol><li> Verzamelen bloedmonsters van een geaccrediteerde faciliteit. Bijvoorbeeld varkensbloed kan met ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) als antistollingsmiddel. Voeg 1 g EDTA met 4 ml water en voeg vervolgens de oplossing tot 1 liter volbloed, voorzichtig mengen 10x. </li></ol> Bij het opzuigen van bloedmonsters, laat ze langzaam afkoelen tot kamertemperatuur. Bloedmonsters moet vers zijn, en idealiter gebruikt de dag dat zij worden verzameld om de reologische eigenschappen van het bloed te behouden. Monsters kan eenmaal worden gekoeld op kamertemperatuur, maar bloed zonder antistollingsmiddel onbruikbaar na koeling zal zijn. Afhankelijk van het antistollingsmiddel, kan RBCs gekoeld bewaard tot 42 dagen, en volbloed koelkast nog 35 dagen bewaard, maar contaminatie in een niet-m mogelijkedische faciliteit 21. Bovendien, wees voorzichtig van de methode voor het verzamelen van runderen of varkens monsters, en vervuiling door het beenmerg te voorkomen. <ol start="2"><li> Centrifugeer de bloedmonsters 3x bij 3000 rpm gedurende 10 minuten per keer. Na de eerste centrifugeren, verwijder het plasma en buffy coat, weggooien. Het is doorgaans handiger om het plasma eerst te verwijderen, en vervolgens weggooien of bewaren voor toekomstig gebruik, dan is het buffycoat alleen te verwijderen. </li></ol> Steek de pipet langzaam, om niet de bufferlaag terug te mengen in het bloed. Nadat de bufferlaag wordt ongeveer 20 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en meng voorzichtig recentrifuge. Herhaal laatste stap. Na de derde centrifugeren, verwijder de PBS-en overige buffycoat, weggooien. Het is ook mogelijk om het natieve plasma in plaats van PBS als u wenst te aggregeren eigenschappen van het bloed behouden. Zorg ervoor dat u alle buffycoat of wit door elkaarbloedcellen in het plasma. <ol start="3"><li> Neem schoongemaakt rode bloedcellen (RBC&#39;s) en schorten in PBS of plasma bij gewenste concentraties (hematocriet). Controleer hematocrietwaarden met een microcentrifuge (CritSpin FisherSci, USA). </li></ol> Bloed bij 10 tot 20% hematocriet moeten gemakkelijker te visualiseren dan 40 of 50% (fysiologische hematocriet) zijn. In de microcirculatie, het bloed in het algemeen de helft van de hematocriet macro circulatie, zodat H = 20 voldoende 15. <ol start="4"><li> Voeg fluorescerende tracer deeltjes bij de gewenste concentratie bloedmonsters. Een algemene regel is tot en met 10 deeltjes in een correlatie venster, dat van tevoren kan worden berekend hebben. </li></ol> Zo worden 30 pl deeltjes toegevoegd aan 1 ml bloed oplossing voor de set-up afgebeeld in de video. Als alternatief kan de RBC zelf fluorescent gelabeld worden. <ol start="5"><li> Daarnaast maakt een kalibratie-oplossing met water en grieporescing deeltjes. Het zal nodig zijn om het systeem te kalibreren met een Newtoniaanse oplossing. </li></ol> Bijvoorbeeld, bij gebruik van een 10x objectief met een kanaal op de schaal van 100 urn, een geschikte concentratie is 300 gl deeltjes gemengd met 15 ml gedestilleerd water. Een andere optie is om glycerol verdund met gedestilleerd water tot een viscositeit van 3cP, die dichter bij bloed macro viscositeit te gebruiken. 3. μPIV Metingen <ol><li> Laserveiligheid: Controleer de temperatuur en vochtigheid. Draag geschikte laser veiligheidsbril. Sluit de laser gordijn of schakel de laser bordje op de deur lab op om mensen niet beschermd tegen blootstelling te voorkomen. </li><li> Procedure met Davis software wordt in beeld. Voor meer details, zie de handleiding van een specifiek systeem. </li><li> Alvorens de gegevens, moet de schaal camera te worden gekalibreerd met behulp van een micrometer. </li><li> Om de naleving van het systeem te verminderen, gebruikt u de kortste buis eend de kleinste stijve spuit mogelijk is, zoals een 15 of 50 ul Hamilton Gasdichte spuit. Om lekkage van bloed of lucht in het systeem te verminderen, sluit de slang aan de injectiespuit en de chip. Dit kan gedaan worden met lijm, PDMS of vaseline (en let niet om het bloed te besmetten). </li></ol> Om de micro-injectiespuit te vullen met water geregen met tracer deeltjes gebruikt terugstroming methode omdat het volume van de micro-injectiespuit is meestal veel kleiner dan het volume te vullen. De terugstroom methode bestaat de micro-injectiespuit en kanalen tezamen vullen via de uitgang van het kanaal een secundaire plastic spuit. Voor dat, eerst de micro-zuiger te verwijderen, druk de vloeistof met behulp van de klassieke plastic spuit bevestigd aan de uitlaat van het kanaal, laat de vloeistofstroom uit de micro-injectiespuit totdat alle microbellen zijn uit de micro-injectiespuit, slang of chip, eindelijk de zuiger terug en haal de plastic spuit. De aanwezigheid or afwezigheid van microbellen kan worden gecontroleerd met een microscoop. <ol start="5"><li> Niveau van de injectiepomp op horizontale leidingen te bereiken. Programmeer de spuit pomp naar de gewenste debiet. </li></ol> Wees bewust van de mogelijke tijdelijke effecten, zoals de &quot;bottleneck effect&quot;, te rigide systeem of de conformiteit van het systeem dat de werkelijke debiet te wijzigen. Karakteristiek tijden van een systeem kan worden geschat als een functie van de materialen en afmetingen van het systeem. (Hoofdstuk 2, pp 77-81, Tabeling, 2005) <ol start="6"><li> Plaats microchip op microscoop podium en start de pomp. Gebruik het water met deeltjes om het systeem te kalibreren naar het midden snelheidsprofiel en kalibreren de dT (de tijd tussen gepulste afbeeldingen). </li></ol> De deeltjes moeten bewegen tussen 5 en 10 pixels tussen de frames voor een goede correlatie 11. Bij het kalibreren, wees voorzichtig om te meten in het midden van het kanaal. De focus vliegtuig in het midden heeft de hoogstesnelheid 8. Bij gebruik van een rond kanaal, wees voorzichtig van schaduweffecten. Een afbeelding monster wordt getoond in figuur 2, met een gepulseerde camera, terwijl de bovenkant van de eerste puls en de onderste afbeelding is de tweede puls. Het kan worden gezien in de figuur dat de helderste punten (fluorescerende deeltjes) zijn de in-focus. <ol start="7"><li> OPTIONEEL: Door het nemen van de gegevens op verschillende hoogtes een 3D snelheidsprofiel kan worden gereconstrueerd door het toevoegen van de verschillende vectoren in een enkel beeld. De video toont een routine die is ontwikkeld voor het automatiseren van het proces. </li><li> Bij het nemen van gegevens van het bloed, vul spuit met de gewenste hoeveelheid bloed in dezelfde werkwijze als het water. Programmeer de spuit pomp naar de gewenste debiet, en neem de gewenste gegevens. Een voorbeeld van rauwe beelden verkregen wordt gepresenteerd Figuur 2. Wees voorzichtig van RBC sedimentatie ook. Bijvullen van de spuit elke run of elkeandere termijn zal de afwikkeling van de RBC verminderen. </li><li> Na het ophalen van afbeeldingen, wordt kruis correlatie uitgevoerd op de afbeelding paren om snelheidsvector velden te verkrijgen tussen de beelden. Het is belangrijk om goede beelden hebben een goede correlatie hebben. Voordat correleren, kan pre-processing worden gedaan om achtergrondruis te verwijderen. </li></ol> Kruiscorrelatie wordt uitgevoerd tussen vensters in de aangrenzende beelden, die kunnen worden gevarieerd in grootte en vorm aan de correlatie beïnvloeden. Na het kruis correlatie, kan afbeelding nabewerking gedaan worden om foutieve vectoren of uitschieters te verwijderen. Een gedetailleerde beschrijving van de verschillende beschikbare opties en hun nauwkeurigheden zijn te vinden in Pitts et al.. (2012b), waar de beste behandeling voor het bloed werd gevonden op de methode van de &quot;image overlappende&quot; met ramen uitgebreid in lengte zijn en in lijn met de stroom . Deze handelingen kunnen handmatig worden gedaan in een programma zoals MATLAB, of binnen het softwarepakket met uw systeem. De<html> software is niet belangrijk, de wiskunde achter de verrichtingen belangrijker en elke activiteit kan de nauwkeurigheid van de uiteindelijke snelheidsprofiel beïnvloeden. De resulterende vectoren kan worden gemiddeld in de ruimte over het kanaal naar instantane snelheid profielen te verkrijgen, en vervolgens gemiddeld weer in de tijd naar een gemiddelde, representatieve snelheid profiel te verkrijgen. Kloosterman et al.. (2011) geven een toelichting op de fout in μPIV metingen waarbij de scherptediepte is groot. Discussies over de fout van de gegevensverwerking hier gepresenteerde is te vinden in Pitts et al.. (2012b) voor de gepulste metingen en Chayer et al.. (2012) voor de hoge snelheid metingen. Voorbeelden van snelheidsprofielen zijn weergegeven in figuren 3 en 4. Figuur 3 toont een enkel profiel velocity de middellijn van 10 ul / uur stroom van RBC bij H = 10 in een 140 urn breed kanaal. tent &quot;&gt; Deze ene profiel is gerealiseerd door het gemiddelde van de gecorreleerde vectoren over het kanaal naar een snelheidsprofiel te krijgen, en dan gemiddeld in de tijd om een ​​representatieve meting te krijgen. In dit geval werden 100 paren gemiddeld in de tijd over het gezichtsveld. Een voorbeeld van de 3D ​​gereconstrueerde profiel genomen voor een water kalibratiestroomplaat in een 100 urn vierkante kanalen met een geprogrammeerde stroomsnelheid van 30 ul / uur wordt gevonden in figuur 4. In figuur 4 zijn de profielen gemeten bij 1 um intervallen. <ol start="10"><li> OPTIE: In de afgebeelde set-up high speed beelden op dezelfde voorwaarden kan worden genomen door over te schakelen camera&#39;s (en data-acquisitie systemen). Dit kan nuttig zijn voor het visualiseren van de celvrije laag in het kanaal en voor het kwantificeren van aggregatie. De gegevensanalyse iets anders (Chayer et al.., 2012). </li></ol> Voorbeelden van wit licht beelden met en zonder RBC aggregatie zijn presented in figuur 5 bij H = 20. De bovenste beelden toont H = 20 in PBS, die het vermogen van de RBC te aggregeren verwijdert op 1 ul / uur. De onderste afbeelding is H = 20 in de moedertaal van het plasma bij 0,5 pl / uur. Afbeelding van de bodem in, aggregatie zichtbaar. <ol start="11"><li> Schakel het systeem op een veilige manier bij de metingen zijn voltooid. Gebruik de juiste laserveiligheidsprocedures totdat laserkrachtbron volledig is stilgelegd. </li></ol>

<ol><li>Santiago, J. G., Wereley, S. T., Meinhart, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+particle+image+velocimetry+system+for+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Fluids%22%5BJournal%5D)">A particle image velocimetry system for microfluidics.</a> Experiments in Fluids. 25, 316-319 (1998).</li>
<li>Evaluation of Velocity Measurement in Micro Tube by Highly Accurate PIV Technique. Sugii, Y., Okamoto, K., Nishio, S., Nakano, A. 4th International Symposium on Particle Image Velocimetry (PIV '01), 17-19 Sept. 2001, , 1-5 (2001).</li>
<li>Park, J. S., Choi, C. K., Kihm, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sliced+micro-PIV+using+confocal+laser+scanning+microscopy+%28CLSM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Fluids%22%5BJournal%5D)">Optically sliced micro-PIV using confocal laser scanning microscopy (CLSM).</a> Exp. Fluids. 37 (1), 105-119 (2004).</li>
<li>King, M. R., Bansal, D., Kim, M. B., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hematocrit+and+leukocyte+adherence+on+flow+direction+in+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+of+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">The effect of hematocrit and leukocyte adherence on flow direction in the microcirculation.</a> Ann. of Biomed. Eng. 32 (6), 803-814 (2004).</li>
<li>Lima, R., Wada, S., Tsubota, K., Yamaguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+micro-PIV+measurements+of+three-dimensional+profiles+of+cell+suspension+flow+in+a+square+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Meas.+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Confocal micro-PIV measurements of three-dimensional profiles of cell suspension flow in a square microchannel.</a> Meas. Sci. Tech. 17 (4), 797-808 (2006).</li>
<li>Wereley, S. T., Santiago, J. G., Chiu, R., Meinhart, C. D., Adrian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-resolution+particle+image+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Micro-+and+Nanofabricated+Structures+and+Devices+for+Biomedical+Environmental+Applications%22%5BJournal%5D)">Micro-resolution particle image velocimetry.</a> Micro- and Nanofabricated Structures and Devices for Biomedical Environmental Applications. 3258, 122-133 (1998).</li>
<li>Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Gray, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+illumination+for+two-dimensional+particle+image+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Volume illumination for two-dimensional particle image velocimetry.</a> Measurement Science and Technology. 11, 809-814 (2000).</li>
<li>Chayer, B., Pitts, K. L., Cloutier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Velocity+measurement+accuracy+in+optical+microhemodynamics%3A+experiment+and+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Measurement%22%5BJournal%5D)">Velocity measurement accuracy in optical microhemodynamics: experiment and simulation.</a> Physiological Measurement. , In Press (2012).</li>
<li>Tabeling, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTabeling%2C+P+%22Introduction+to+Microfluidics%22">Introduction to Microfluidics</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2005).</li>
<li>Olson, M. G., Adrian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out-of-focus+effects+on+particle+image+visibility+and+correlation+in+microscopic+particle+image+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Fluids%22%5BJournal%5D)">Out-of-focus effects on particle image visibility and correlation in microscopic particle image velocimetry.</a> Experiments in Fluids. 29, S166-S174 (2000).</li>
<li>Wereley, S. T., Meinhart, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+micro-particle+image+velocimetry+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Fluid+Mech%22%5BJournal%5D)">Recent advances in micro-particle image velocimetry techniques.</a> Ann. Rev. Fluid Mech. 42, 557-576 (2010).</li>
<li>Williams, S. J., Park, C., Wereley, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+applications+on+microfluidic+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Advances and applications on microfluidic velocimetry.</a> Microfluid. Nanofluid. 8 (6), 709-726 (2010).</li>
<li>Chiu, J. J., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+disturbed+flow+on+vascular+endothelium%3A+Pathophysiological+basis+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives.</a> Physiol. Rev. 91 (1), 327-387 (2011).</li>
<li>Secomb, T. W., Pries, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microcirculation%3A+Physiology+at+the+mesoscale%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The microcirculation: Physiology at the mesoscale.</a> J. Physiol. 589 (5), 1047-1052 (2011).</li>
<li>Popel, A. S., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+and+hemorheology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Fluid+Mechancis%22%5BJournal%5D)">Microcirculation and hemorheology.</a> Annual Review of Fluid Mechancis. 37, 43-69 (2005).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+England%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 37, 551-577 (1998).</li>
<li>Whitesides, G. M., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+methods+for+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+Today%22%5BJournal%5D)">Flexible methods for microfluidics.</a> Physics Today. , 42-48 (2001).</li>
<li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+fabricated+of+poly%28dimethylsiloxane%29+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices fabricated of poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24, 3563-3576 (2003).</li>
<li>Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+PDMS+surface+modifications+for+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Recent developments in PDMS surface modifications for microfluidic devices.</a> Electrophoresis. 31, 2-16 (2009).</li>
<li>Pitts, K. L., Abu-Mallouh, S., Fenech, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+angle+study+of+blood+dilutions+on+common+microchip+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Contact angle study of blood dilutions on common microchip materials.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. , (2012).</li>
<li>Hovav, T., Yedgar, S., Manny, N., Barshtein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+red+blood+cell+aggregability+and+shape+during+blood+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Alteration of red blood cell aggregability and shape during blood storage.</a> Transfusion. 39, 277-281 (1999).</li>
<li>Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-particle+image+velocimetry+measurement+of+blood+flow%3A+validation+and+analysis+of+data+pre-processing+and+processing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods.</a> Measurement Science and Technology. 23, 105302(2012).</li>
<li>Kloosterman, A., Poelma, C., Westerweel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+rate+estimation+in+large+depth-of-field+micro-PIV%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Fluids%22%5BJournal%5D)">Flow rate estimation in large depth-of-field micro-PIV.</a> Exp. Fluids. 50 (6), 1587-1599 (2011).</li>
<li>Goldsmith, H. L., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Fluid+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 7, 213-247 (1975).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Met behulp μPIV voor bloedstroom metingen op de schaal van de microcirculatie kan inzicht geven in een groot aantal relevante biomedische, mechanische en chemische techniek processen. Enkele van de belangrijkste factoren om rekening te houden met de dichtheid van de RBC zelf, de aggregatie en vervormbaarheid van de RBC, samenvoeging of verplaatsing van de fluorescerende micro-deeltjes, en de regeling van de RBC in de kanalen. Al deze kan worden verklaard indien de hierboven vastgestelde algemene richtlijnen worden gevol...

Het menselijk lichaam bevat talrijke vaten met een diameter kleiner dan 50 urn, die de hoofdcentrale plaats tussen bloed en weefsels. De studie van de bloedstroom in deze vaten een aanzienlijke uitdaging vanwege zowel de omvang van de metingen en de vloeistof eigenschappen van bloed. Deze metingen, waaronder de drukgradiënt, de afschuiving op de muur, en de snelheidsprofielen in arteriolen en venulen, zijn belangrijke factoren in verband met fysiologische reacties. Er zijn nu ongekende mogelijkheden om deze meting uitdagingen op te lossen, dankzij nieuwe experimentele technieken op micro schaal om de microcirculatie te bestuderen en dit multiscale probleem op te lossen. Micro-particle image velocimetry (μPIV) is een deeltje-gebaseerde stroom visualisatie techniek die wordt gebruikt om de snelheidsprofielen van de bloedstroom in microkanalen via kruis correlatie evalueren. μPIV, eerst ontwikkeld door Santiago et al.., is gebruikt met hemorheologystudies sinds Sugii et al.. In 2001 gebruikte de techniek om de bloedstroom te meten bij 100 micrometer ronde glazen buizen 1,2. Verschillende benaderingen van μPIV bestaan. High speed camera&#39;s kunnen worden gebruikt om de beweging van rode bloedcellen (RBC) correleren en gepulste beelden kunnen worden gebruikt om de beweging van tracer deeltjes correleren. Elk van deze opties kan worden gekoppeld met een rechtopstaande of omgekeerde microscoop, afhankelijk van de toepassing. In beide gevallen is het resultaat een 2D snelheidsprofiel. Een andere benadering is een confocale microscoop 2D en 3D profielen bereiken. Deze werkwijze is toegepast om bloed 3,4,5. Microschaal PIV heeft verschillende complicaties in vergelijking met macro PIV. In macro PIV de gegevens kunnen worden beperkt tot een vlak door vellen van licht, maar op microschaal volume verlichting noodzakelijk is. Volume verlichting is een groter probleem voor de beeldvorming van micro bloed stroomt, zoals de RBCs zelf groot in vergelijking met de channels en met RBC als tracer deeltjes tot een diepte van correlatie (DOC) die de nauwkeurigheid van de kruiscorrelatie resultaten 6,7,8 aanzienlijk kan verminderen. Na Wereley et al.. (1998) de DOC voor een 40 micrometer lang kanaal met RBC als tracers is 8,8 micrometer, terwijl met een 1 micrometer tracer deeltje het DOC is 6,7 micrometer. Dit verschil wordt meer uitgesproken bij het wisselen van kanaal hoogte en vergroting. Daarnaast RBC ondoorzichtig en verhogen van de dichtheid van RBC in de stroom veroorzaakt imaging moeilijkheden. Fluorescerende tracer deeltjes, voor het eerst gebruikt door Santiago et al.. (1998), werden bepleit als een instrument om de invloed van de out-of-focus deeltjes, afnemen bij het ​​gebruik van de kleinste deeltjes mogelijk. Gebruik 1 urn diameter fluorescerende microdeeltjes combinatie met een laser is een benadering die de scherptediepte probleem kan afnemen micro bloedstroom beeldvorming 10. Er zijn verschillende lopende beoordelingen van de staat van μPIV technology, die elk benadrukt het belang van μPIV om de bloedstroom studies 11,12. Aantal belangrijke overwegingen moet rekening worden gehouden bij het gebruik μPIV voor bloed. Op microniveau, de omvang van de microcirculatie, bloed niet als een homogene vloeistof, zoals een suspensie van flexibele rode bloedcellen (RBC), grote witte bloedcellen, bloedplaatjes en andere proteïnen gesuspendeerd in een Newtonse vloeistof (plasma) . De snelheidsprofielen hier gemeten kunnen worden gebruikt om bepaalde kenmerken van het micro bloed stroomt te meten. De belangrijke factoren in microhemorheology de stroomsnelheid van het bloed, de vorm van het snelheidsprofiel en de schuifspanning in de wand van het vat. Deze informatie heeft klinische implicaties, zoals de microcirculatie is de site voor nutriënten uitwisseling in het lichaam en deze uitwisseling afschuifafhankelijke. Er zijn verschillende lopende evaluatie studies over de stand van het onderzoek in de microcirculatie en 13,14,15. Hier gepresenteerde is een protocol voor μPIV metingen van bloed stroomt in polydimethylsiloxaan (PDMS) microkanalen. PDMS kanalen werden gefabriceerd in-house na de bronnen in deel 1 van het protocol. Varkens bloedmonsters werden verkregen van een erkend slachthuis en schoongemaakt na deel 2 van het protocol. Alle gegevens werden verkregen met behulp van de LaVision MITAS μPIV systeem, zoals beschreven in paragraaf 3 van het protocol. De opzet bestaat uit een Nd: YAG laser (New Wave Research, USA) en CCD camera (Image Intense, Lavision) bestuurd door een programmeerbare triggering eenheid, een fluorescentiemicroscoop combinatie met een bewegende fase in 3 assen, en een computer, naast een hoge snelheid camera (Dalsa 1M150, Nederland) werd toegevoegd voor visualisatie van RBC zelf. Beide camera&#39;s zijn aangesloten op een 2-poort optische doos (Custom door Zeiss, Duitsland). In typische in vivo metingen van de bloedstroom, wordt een rechtopstaande microscoop gebruikt om RBC volgen demselves, terwijl typische in vitro toepassingen een omgekeerde microscoop wordt gebruikt om de tracer deeltjes volgen. In dit unieke dual set-up, de doos optiek maakt beide tracers worden afgebeeld met behulp van de omgekeerde microscoop. Bloed werd in de microchips via een precisie spuitpomp (Nexus3000, Chemyx Inc, USA). Een diagram van het systeem wordt getoond in figuur 1, waarbij het ​​bovenste gedeelte van de figuur is de 140 urn met 40 urn rechthoekige kanalen gemaakt van PDMS, en het onderste deel betreft het gehele systeem, inclusief beide camera, de laser, de spuitpomp en de microscoop. Huidige μPIV set-ups beschikbaar, meestal met eigen software, onder andere TSI, Dantec Dynamics, en LaVision. Standaard kruiscorrelatie algoritmen kan door talrijke softwareprogramma&#39;s zoals MATLAB. De software is niet de sleutel, te begrijpen wat de dialoog vakjes komen overeen met zal mathematisch het gebruik dienenr veel beter. In dit protocol Davis, zijn eigen software LaVision&#39;s of MATLAB gebruikt. Het protocol is geen software-specifieke, maar de menu-opties zijn mogelijk op verschillende plaatsen in verschillende softwarepakketten.

<table><tbody><tr><td>poly(dimethylsiloxane) (PDMS), d.w.z. Sylgard-184</td><td>Dow-Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>poshphate gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>fluorescerende microdeeltjes</td><td>Microgenics/FisherSci</td><td>R900</td><td></td></tr><tr><td>glycerol (FACULTAtief)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6279-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge, d.w.z. CritSpin</td><td>FisherSci</td><td>22-269-291</td><td></td></tr><tr><td>spuit, d.w.z. 50 &mu;l Gastight</td><td>Hamilton</td><td>80965</td><td></td></tr><tr><td>camera, d.w.z. Imager Intense, hoge snelheid</td><td>LaVision, Dalsa</td><td>Imager Intense</td><td></td></tr><tr><td>microscoop, d.w.z. MITAS</td><td>LaVision</td><td>MITAS</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG-laser</td><td>New Wave Research</td><td>Solo-II</td><td></td></tr><tr><td>spuipomp, d.w.z. Nexus3000</td><td>Chemyx, Inc.</td><td>Nexus-3000</td><td></td></tr><tr><td>flexibele slang, d.w.z. Tygon</td><td>FisherSci</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>dataverwerkingssoftware, d.w.z. DaVis</td><td>LaVision</td><td>DaVis</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge, d.w.z. Thermo Scientific CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr></tbody></table>

micro-stromingsvisualisatie voor velocity profiel metingen van micro blood flows

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (μPIV) wordt gebruikt om gepaarde beelden van microdeeltjes uitgezaaid in bloed stroomt visualiseren. De beelden zijn cross-gecorreleerde om een ​​nauwkeurige snelheidsprofiel geven. Een protocol wordt gepresenteerd voor μPIV metingen van het bloed stroomt in microkanalen. Aan de omvang van de microcirculatie, kan het bloed niet als een homogene vloeistof, zoals een suspensie van flexibele deeltjes in plasma, een Newtonse vloeistof. Afschuifsnelheid, maximale snelheid, snelheid profielvorm en debiet kan worden afgeleid uit deze metingen. Een aantal belangrijke parameters zoals scherptediepte, deeltje concentratie, en compliance-systeem, worden gepresenteerd in om ervoor te zorgen accurate, bruikbare gegevens samen met voorbeelden en representatieve resultaten voor de verschillende hematocrietwaarden en stromingscondities.

In alle figuren, wordt doorstroming van links naar rechts in rauwe beelden, en omhoog in berekende snelheidsprofielen. Een voorbeeld van de ruwe data verkregen met bloed in hematocriet H = 10 stroomsnelheid van 10 ul / uur wordt getoond in figuur 2. Ruwe data kan worden kruislings gecorreleerd zonder enige verwerking van gegevens om snelheidsprofielen bereiken. De impact van de pre-processing en data verwerkingsmethoden wordt besproken door Pitts, et al.., (2012b). Een voorbeeld van een resulte...

Micro-stromingsvisualisatie (μPIV) wordt gebruikt om gepaarde beelden microdeeltjes uitgezet in bloedstromen die kruis-gecorreleerde een accurate snelheidsprofiel geven visualiseren. Afschuifsnelheid, maximale snelheid, snelheid profielvorm en debiet, die elk klinische toepassingen kan worden afgeleid uit deze metingen.

Micro-stromingsvisualisatie voor Velocity Profiel Metingen van Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Het algemene doel van deze procedure is om het snelheidsprofiel van een bloedoplossing in een microkanaal te meten met behulp van microparticle Image LOC symmetry. Dit wordt bereikt door eerst het systeem te kalibreren met een Newtoniaanse oplossing in het microkanaal om de schaal in te stellen, het beeld en de timing aan te passen en het middenvlak van het kanaal te bepalen. De tweede stap is het introduceren van de bloedoplossing in de kanaalopstelling en het waarborgen dat er geen microbubbels aanwezig zijn.Vervolgens wordt de bloedstroom in beeld gebracht op de gewenste vlakken in het kanaal, met behulp van beeldparen van een gepulste camera of video van een hogesnelheidscamera. De laatste stap is het kruiscorreleren tussen de beeldparen of de videosequentie om het verplaatsingsvectorveld binnen het kanaal te verkrijgen. Uiteindelijk kan het verplaatsingsvectorveld over het kanaal en over het tijdsbestek van de meting worden gemiddeld om een indicatief snelheidsprofiel te verkrijgen.Dit profiel kan verder worden geanalyseerd of worden gebruikt voor berekeningen. Deze methode kan belangrijke vragen in het biomedische veld en het veld van biovloeistoffen beantwoorden, zoals de vorm van het snelheidsprofiel en de afschuifsnelheid bij de wand van microvaten. Over het algemeen worstelen gebruikers die nieuw zijn met deze methode met de moeilijkheden die gepaard gaan met het gebruik van biologische monsters zoals bloed en de complexiteit van het uitvoeren van nauwkeurige metingen.De eerste stap is het verkrijgen van een microkanaal in polymethyl SUBOXANE of PDMS. De microkanalen in dit experiment zijn ongeveer 50 microns diep en 150 microns breed. Stel de vloeistofcontactzijde van het PDMS en de glazen plaat waarop het gebonden zal worden 45 seconden bloot aan zuurstofplasma.Druk ze vervolgens stevig tegen elkaar aan om een permanente verbinding te verkrijgen. In dit experiment wordt vers verzameld porciebloed gebruikt. Om dit voor te bereiden, voegt u 0,5 gram EDTA toe aan twee milliliter water.Voeg vervolgens de oplossing toe aan één liter warm volbloed, agiteer dit voorzichtig 10 keer en laat het afkoelen tot kamertemperatuur wanneer het bloed op kamertemperatuur is. Centrifugeer bloedmonsters van 50 milliliter bij 3000 RPM gedurende 10 minuten. Verwijder daarna het plasma met een pipet.Breng vervolgens voorzichtig een pipette aan om de buffy coat te verwijderen, zodat deze na verwijdering niet opnieuw met het bloed wordt gemengd. Voeg ongeveer 20 milliliters fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS toe en meng dit voorzichtig; herhaal de centrifugatie, het verwijderen van het plasma en de buffy coat en het toevoegen van PBS nog twee keer. Verwijder na de laatste centrifugatie de PBS samen met de resterende buffy coat.Neem de gereinigde rode bloedcellen en suspendeer deze in PBS of plasma in de gewenste concentraties. Het monster hier bevat 10% rode bloedcellen of een hematocriet van 10. Voeg vervolgens fluorescente tracerdeeltjes van één micron in de gewenste concentratie toe aan de bloedmonsters, ongeveer 30 µL per 1 mL bloed in dit systeem.Maak op dit punt daarnaast een kalibratie-oplossing met gedeïoniseerd water en de fluorescerende deeltjes. De gegevens voor dit experiment worden verzameld met een lavis laser-beeldvormingssysteem met een gepulseerde camera. Dit is gekoppeld aan een ND YAG-laser.Neem vóór het verzamelen van gegevens alle nodige veiligheidsvoorzorgsmaatregelen voor laserwerk. Bereid de microchip voor door deze te bevestigen aan het spuitensysteem met behulp van de kleinst mogelijke spuit, hier 50 microliters, en de kortst mogelijke hoeveelheid slang. Afdichten de slang aan de spuit in de chip met PDMS-lijm of vaseline om vloeistoflekkage en luchtinlaat te verminderen.Zorg ervoor dat potentiële contaminatie van de vloeistof wordt voorkomen. Om het systeem eerst te kalibreren, wordt de kalibratieoplossing gebruikt om de microspuit te vullen. Vul eerst een standaardspuit met de oplossing van water en fluorescerende deeltjes. Verwijder de zuiger uit de microspuit.Gebruik de standaardspuit om de kalibratie-oplossing in de uitlaat van het microkanaal te injecteren. Hierdoor zal de vloeistof de microspuit vullen en uit het open uiteinde ontsnappen. Ga door met het injecteren van de vloeistof totdat er geen microbubbels meer in de microchip-slang of de microspuit aanwezig zijn.Om de afwezigheid van microbellen te verifiëren, plaatst u de zuiger van de microspuit terug en inspecteert u het systeem met een microscoop. Hier worden voorbeelden van microbellen getoond; wanneer er geen microbellen in het systeem aanwezig zijn, koppelt u de standaardspuit los en vervangt u deze door een spuit om de uitstroom op te vangen. Bevestig vervolgens de microspuit met kalibratievloeistof aan de spuitpomp en stel de pomp waterpas.Zorg ervoor dat de slang horizontaal ligt. Programmeer de spuitpomp op de gewenste stroomsnelheid. Plaats de microchip op de tafel van de omgekeerde microscoop.Kalibreer nu het systeem. Meet eerst het snelheidsprofiel in het centrum van het kanaal. Kalibreer daarnaast de tijd tussen de gepulseerde beelden.Deeltjes moeten tussen de vijf en 10 pixels tussen frames bewegen. Voor een goede correlatie dient men zorgvuldig in het midden van het kanaal te meten. Zodra de kalibratie is voltooid, verwijdert u de microspuit, de zuiger en de uitstroomspuit en spoelt u het systeem met zuiver water.Vul het systeem vervolgens met het geprepareerde bloed door dit met een standaardspuit in de uitlaat van het microkanaal te injecteren. Ga door tot er, zoals bevestigd via de microscoop, geen microbellen meer aanwezig zijn. Plaats daarna de zuiger van de microspuit terug.Plaats vervolgens de microspuit met bloed in de spuitpomp en stel deze waterpas. Behoud dezelfde pompinstellingen. Plaats de microchip op de microscopietafel en start de pomp.Begin met het verzamelen van gegevens en vul de spuit na elke één of twee runs bij om te voorkomen dat de rode bloedcellen bezinken. Zodra alle gegevens zijn verzameld, zien de beelden er als hier getoond uit. Dit zijn ruwe gegevens verkregen bij een concentratie rode bloedcellen van 10% en een stroomsnelheid van 10 microliters per uur.De bovenste afbeelding is de eerste. De onderste afbeelding is 1/100 seconde later genomen. Deze afbeeldingen zijn voorbewerkt om achtergrondruis te verwijderen na de voorbewerking.Kruiscorrelatie tussen de beelden wordt uitgevoerd om snelheidsvelden te verkrijgen. Dit is een voorbeeld van een resultaat in het snelheidsprofiel van een systeem met 10% rode bloedcellen en een stroomsnelheid van 10 µL per uur. Let op, de verticale as geeft de snelheid weer.Door verschillende camera's en datas acquisitiesystemen te gebruiken, kunnen beelden met hoge snelheid worden gemaakt. Dit kan nuttig zijn voor het visualiseren van de celvrije laag in het kanaal en voor het kwantificeren van aggregatie. Deze beelden zijn van monsters met 20% rode bloedcellen in de bovenste afbeelding.De stroomsnelheid bedraagt één microliter per uur en de bloedcellen zijn gesuspendeerd in PBS, waardoor hun vermogen om te aggregeren wordt weggenomen. In de onderste afbeelding is de stroomsnelheid 0,5 microliter per uur en zijn de bloedcellen gesuspendeerd in natief plasma.In dit geval is aggregatie zichtbaar. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat scherpe beelden in focus zullen leiden tot de beste correlatie tussen paren van opeenvolgende beelden. Na het bekijken van deze video zou u een beter begrip moeten hebben van hoe microparticle image velocity symmetrie kan worden toegepast op bloedmicrostromingen, ondanks de inherente moeilijkheden van bloed als werkmedium.

micro-particle-image-velocimetry-for-velocity-profile-measurements

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Intravitale microscopie om temporele en ruimtelijke hemodynamische en inflammatoire gebeurtenissen in de pial microcirculatie te volgen.

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

Een echo particle image velocimetry (EPIV) systeem dat in staat de overname van twee-dimensionale velden van snelheid in optisch ondoorzichtige vloeistoffen of via optisch ondoorzichtige geometrieën wordt beschreven, en validatie metingen in pijpstroming worden gerapporteerd.

Echo Particle Image Velocimetry

Een procedure voor het bestuderen van voorbijgaande stromen dichtbij grenzen met behulp van hoge-resolutie, high-speed particle image velocimetry (PIV) wordt hier beschreven. PIV is een niet-opdringerige meettechniek toepasbaar op elk optisch toegankelijke stroom door het optimaliseren van verschillende parameters beperkingen, zoals het beeld en de opname-eigenschappen, de laser blad eigenschappen en analyse algoritmes.

High-speed stromingsvisualisatie Dichtbij Surfaces

Intravitale microscopie kan bij dieren worden gebruikt om retinale vaatdiameters, bloedstroomsnelheden en totale retinale bloedstroom te visualiseren en te meten.

Intravitale Video Microscopie Metingen van retinale bloedstroom in Muizen

Het protocol beschreven gegevens een experimentele procedure om rode bloedcel (RBC) aggregaten kwantificeren onder gecontroleerde en constante afschuifsnelheid, gebaseerd op beeldverwerkingstechnieken. Het doel van dit protocol is het RBC totale afmetingen naar de desbetreffende afschuifsnelheid in een gecontroleerde omgeving microfluidic.

Gecontroleerde Microfluïdische Milieu voor Dynamic Onderzoek van Red Blood Cell Aggregation

Deze studie introduceert een nieuwe techniek voor de meting en analyse van wisselende snelheden van bloed microcirculatie in een enkele experiment met behulp van een laser spikkel contrast imager.

Een nieuwe benadering voor het overwinnen van Movement Artifact bij het gebruik van een Laser spikkel Contrast Imaging systeem voor wisselende snelheden van bloed microcirculatie

Een experimenteel toegankelijk analoge methode voor de studie van moleculaire hydrodynamische processen in dichte vloeistoffen wordt gepresenteerd. De techniek maakt gebruik van particle image velocimetry universele, hoge-restitutie graan palen en kunt direct, macroscopische observatie van dynamische processen bekend en voorspelde bestaan in sterk interactie, hoge dichtheid gassen en vloeistoffen.

Een analoge macroscopische techniek voor de studie van moleculaire hydrodynamische processen in dichte gassen en vloeistoffen

De hier beschreven techniek biedt een goedkope en relatief eenvoudige methode om tegelijkertijd deeltje kinematica en turbulentie in stromen met lage deeltje concentraties. De turbulentie is gemeten met behulp van de particle image velocimetry (PIV) en deeltje kinematica zijn berekend uit de beelden verkregen met een high-speed camera in een overlappende veld-of-view.

Gelijktijdige meting van turbulentie en Particle Kinematics met behulp van stroom beeldvormende technieken

Hier presenteren we vereenvoudigde methoden voor het fabriceren van transparante neurovasculaire fantomen en daarin het karakteriseren van de stroom. Wij wijzen op verschillende belangrijke parameters en tonen hun relatie tot veld nauwkeurigheid.

Meso-schaal Particle Image Velocimetry Studies van neurovasculaire stroomt In Vitro

Om de microvasculaire stroom te kwantificeren uit hoge snelheid capillaire flow beeld sequenties, ontwikkelden we medewerkers (ruimtelijke temporele analyse van Fieldwise flow) software. In het volledige afbeeldingsveld en na verloop van tijd evalueert het personeel stroomsnelheden en genereert het een reeks ruimtelijke kaarten met kleurcodering voor visualisatie en tabellaire uitvoer voor kwantitatieve analyses.

Ruimtelijke temporele analyse van Fieldwise flow in Microvasculatuur

Het huidige protocol beschrijft deeltjesbeeld velocimetrie (PIV) metingen die worden uitgevoerd om de sinusstroom door de in vitro opstelling van de transkatheter aortaklep (TAV) te onderzoeken. De hemodynamische parameters op basis van snelheid worden ook bepaald.

Deeltjesbeeld Velocimetrie Onderzoek van hemodynamiek via aortafantoom

Leer micro-stromingsvisualisatie voor snelheidsprofielmetingen van bloedstromen in microkanalen. Deze methode helpt onderzoekers stromingsdynamica analyseren voor biomedische toepassingen.

Micro-stromingsvisualisatie voor Velocity Profiel Metingen van Micro Blood Flows

Meer video's verkennen