Langdurige zwijgen van Intersectin-1s in Muis Longen door Herhaalde levering van een specifiek siRNA via kationische liposomen. Evaluatie van Knockdown Effects van Electron Microscopy

Het algemene doel van het volgende experiment is om de effecten van langdurige knockdown van de expressie van intersecting one s op de structuur en functie van muizenlongen te evalueren. Dit wordt bereikt door in eerste instantie specifieke INA-duplex liposoomcomplexen voor te bereiden om in een tweede stap de vasculatuur van de muizenlongen te targeten. De INA-liposoomcomplexen worden toegediend via retro-orbitale injectie, wat elke 72 uur gedurende 24 opeenvolgende dagen wordt herhaald om een efficiënte inhibitie van de expressie van intersecting one s te bewerkstelligen.

Vervolgens wordt longweefsel van de geïnjecteerde muizen afgenomen voor biochemische analyses en EM-onderzoek om de intersect in one s-eiwit- en mRNA-niveaus te evalueren en uitgebreide morfologische analyses van de longen uit te voeren. De resultaten verkregen via western blot van longlysaten met specifieke intersect in one-antilichamen en Q-R-T-P-C-R-analyses tonen een specifieke en efficiënte intersect in one s-knockdown gedurende 24 opeenvolgende dagen aan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methodologieën zoals rymers of lentivirussen is dat de toediening van onische liposomen aan de longen reproduceerbaar, veilig, niet-toxisch en zeer effectief is in het longendotheel.

We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we besloten de effecten van intersecterende N down in vivo te evalueren en andere methoden voor SRNA-afgifte niet werkten. Voeg voor de bereiding van onic liposomen 315 µL van een voorraadoplossing van dimethyl diod desal ammoniumbromide, of DOAB, toe aan een rondbodemkolf, gevolgd door 200 µL cholesterol-voorraadoplossing en 9,5 mL chloroform, en meng dit door te zwenken. Bevestig de kolf aan de roto vapor ingesteld op 37 °C en 100 of meer omwentelingen per minuut.

Open de eerste argonventiel volledig door deze met de klok mee te draaien. Open en sluit dit ventiel altijd als eerste. Het tweede ventiel regelt de argondruk die in de kolf wordt geblazen.

Open deze gedeeltelijk om een zachte druk te waarborgen. Zodra het droogijs over de buis begint te druppelen die de Argonne-gastank met de roto-vapor verbindt, laat u de roto-vapor in het waterbad zakken tot de kolf het water raakt zonder volledig ondergedompeld te worden. Draai de snelheidsregelaar omhoog naar 100 tot 120 RPM. Wanneer al het chloroform in de kolf is verdampt, stopt u de machine.

Draai de snelheidsregelaar van de roto-vapor naar nul en sluit de afsluiters van de argontank. Verwijder de kolf. Voeg twee milliliter van een 5% glucose-oplossing toe aan de kolf om de lipiden opnieuw te suspenderen.

Kras met een pipettepunt van één milliliter de bodem van de kolf grondig om alle lipiden op te lossen. Incubeer de verkregen oplossing gedurende één uur in een waterbad van 42 °C terwijl de kolf langzaam wordt gevortexd. Sonicate de oplossing gedurende ten minste 20 tot 30 minuten, waarbij de kolf omhoog wordt gehouden en de bodem net het koude water in het sonicatiebad raakt.

Verwarm vervolgens de kolf gedurende 20 minuten bij 42 °C in het waterbad van de rotavapor bij een snelheid van nul, waarbij de ronde bodem in het water is ondergedompeld. Filtreer de liposomen door een spuitfilter van 0,47 µm, gevolgd door een spuitfilter van 0,22 µm. Filtreer de liposomen met behulp van een kleine extruder door een membraan van 50 nm om een homogene populatie unilamellaire liposoomvesikels te genereren.

Breng de liposomen over naar een eppendorfbuisje en plaats deze op ijs. Bereid de liposoom-irna ITSN-complexen in een verhouding van acht mol liposomen per twee microgram RNA. In dit voorbeeld worden 50 microliters I-A-I-T-S-N gebruikt.

Van een 50 µM voorraadoplossing wordt een volume toegevoegd aan 100 µL vers bereide liposomen met behulp van een RNA- en DNA-vrije EOR-buis. Bewaar het mengsel op ijs tot aan de injectie in de muizen. De muizen die in deze studie zijn gebruikt, zijn ongeveer vier tot zes weken oud en wegen rond de 25 g.

Bevestig met de teenknijptest of het dier volledig is geanestheseerd vóór de injectie. De gebruikte spuiten zijn tuberculinespuiten van één milliliter met de naald bevestigd met één hand. Houd de oren van de muis vast en draai de muis op zijn zij om de binnenhoek van het oog bloot te leggen.

Richt mediaal ten opzichte van de PIKA semi lunars en vermijd contact met de oogbol. Benader de lacrimal carle van het oog met de gevulde spuit in een hoek van 45 graden in alle drie de assen. Injecteer het mengsel langzaam, plaats de muis terug in de kooi en laat deze herstellen met de geïnjecteerde zijde.

De muis wordt elke 72 uur gedurende 24 dagen behandeld met siRNA gericht tegen het ITSN1-gen. Om met deze procedure te beginnen, dient te worden vastgesteld dat de muis volledig is geanestheseerd door de afwezigheid van de terugtrekreflex. Start met een laparotomie en exciseer het diafragma.

Voer vervolgens een thoracotomie uit om de longen en het hart bloot te leggen. Verwijder de thymus met behulp van een StereoZoom-microscoop voor een betere nauwkeurigheid. Katheteriseer de arteria pulmonalis.

Voer vervolgens een tracheotomie uit en intubeer de muis via het tracheostoma. Stel de ventilator in op een frequentie van 150 slagen per minuut en een slagvolume van 150 µL. Open de linker atrium als uitlaat met behulp van een peristaltische pomp, ingesteld op 1,5 mL per minuut en Hank's oplossing verwarmd tot 37 °C.

Spoel de bloedvaten van de muizenlongen vijf minuten lang bloedvrij, gevolgd door een perfusie met de tracer gedurende 10 minuten. Na het uitspoelen van de ongebonden tracer wordt een in situ fixatie van de longen uitgevoerd door een perfusie van 10 minuten met 4% formaldehyde, 2,5% glutaaraldehyde en 1% tanninezuur. Neem de longen uit en verwijder overtollig weefsel.

Snijd de longen in kleine blokjes en breng deze over in een gelabelde scintillatiebuis die twee milliliters van een fixatiemengsel bevat. Om met de verwerking van het longweefsel voor elektronenmicroscopie te beginnen, worden de longblokjes eerst kort drie keer gewassen in 0,1 molar natrium-Cate-buffer.

Fixeer de specimens vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur in 4% aldehyde 2,5% glutaraldehyde in 0,1 Pipee-buffer; voer daarna een postfixering uit met 1% Pilate Osmium gedurende één uur in de zuurkast op ijs in het donker, nadat ze eenmaal zijn gespoeld met Callen burger-buffer. Incubeer de specimens gedurende twee uur tot overnacht bij kamertemperatuur in Callen burger-buffer. Spoel eenmaal met 50% ethanol en dehydrateer vervolgens met een oplopende reeks ethanolconcentraties.

70% ethanol gedurende vijf minuten, 95% ethanol gedurende vijf minuten en vervolgens twee keer in 100% ethanol gedurende telkens 15 minuten. Stap daarna over op 100% propyleenoxide voor twee incubaties van 15 minuten.

Verwijder het propyleenoxide en voeg een mengsel toe van 50% propyleenoxide en 50% Epon 812. Laat dit een nacht incuberen terwijl het op een wiel roteert bij kamertemperatuur. Verwijder de volgende ochtend het mengsel en voeg vers Epon 812 toe. Laat dit gedurende ten minste vier tot vijf uur op het wiel roteren.

Voeg geselecteerde preparaten toe aan dubbel taps toelopende mallen die voor de helft gevuld zijn met verse 100%Epon eight 12. Plaats ze tegen de randen, verplaats de mallen naar een incubator van 60 degree Celsius en laat ze 48 tot 72 uur uitharden. Chronische inhibitie van de expressie van ITSN one s gedurende 21 opeenvolgende dagen door herhaalde toediening van I TSN one s siRNA liposoomcomplexen resulteert in significant lagere niveaus van I TSN one proteïne in muizenlongen, zoals te zien is in deze representatieve resultaten hier; longlysaten van een onbehandelde controle en van behandelde muizen werden geblot met antilichamen tegen I TSN one en actine op verschillende tijdstippen na de irna-toediening, zoals aangegeven.

Densitometrische analyse van representatieve high blot CL-films en kwantitatieve R-T-P-C-R van I TSN one s mRNA bevestigen verder dat behandeling met I TSN one s siRNA-liposoomcomplexen de expressie van I TSN one s-eiwit in muizenlongen efficiënt downreguleert. De afname van intersect in one-niveaus leidt tot deficiënte endocytose en T-endotheliaal transportverstoring van de inter-endotheliale barrière en longoedeem. Deze representatieve elektronenmicrografieën van longweefsel tonen open inter-endotheliale juncties of IJs die over hun gehele lengte zijn gelabeld met albuminedeeltjes van acht nanometer goud.

Paneel A1 is een vergroting van paneel A; de pijlpunten wijzen naar drie tot vier goud-albumine-partikels die dicht bij elkaar in hetzelfde vlak liggen. Dit is indicatief voor de weidse opening van de IEJ. Goudpartikels zijn ook geassocieerd met de abluminale uitgang van de IJ, zoals aangegeven door de pijlen in panelen A1 en B. Let ook op het beperkte aantal CVE in A en de dilatatie van de pericapillaire ruimte, aangegeven door het asterisk in paneel A. Een acute downregulatie van de expressie van intersectine 1 leidde tot het upreguleren van alternatieve transportpaden om de deficiënte endocytose te compenseren.

Deze EM-beelden tonen membraanachtige ringen in panel A, pleomorfe tubuli in panel B en vergrote endosomen gefuseerd met typische cve LA in panel C, die actief betrokken zijn bij de opname en het transport van goud-albumine. Een ernstige dilatatie van de perivasculaire ruimte en proteïnerijk oedeem zijn ebenfalls waargenomen. Langdurige inhibitie van intersect in one expressie gedurende 24 dagen vermindert het longoedeem bij muizen door de integriteit van de inter-endotheliale barrière gedeeltelijk te herstellen.

EM-morfologische studies toonden aan dat de goud-albumine tracer van 8 nm op dit tijdstip de IEJ niet kon penetreren, maar in plaats daarvan filtratieresten vormde in de luminale introit van de verbinding, aangegeven door de pijlpunten. De perivasculaire ruimten of PVS vertoonden echter enige dilatatie en mild oedeem, wat suggereert dat verbindingen ondoordringbaar zijn voor deeltjes van deze grootte, maar dat lekkende multivesiculaire lichaampjes of MVB in nauwe nabijheid van het plasmamembraan wel enkele van hun interne kleine blaasjes gelabeld hebben met goud-albumine deeltjes van 8 nm. Deze tabel toont het aantal endocytische trans-cyto structuren in controle- en deficiënte longendotheelcellen van muizen.

Een belangrijke bevinding is de afname van cavi-aantallen in het longendotheel van ITSN1-deficiënte muizen. Chronische inhibitie van de expressie van ITSN1 veroorzaakte de activatie van alternatieve endocytische pathways en gedeeltelijk cavi-aantallen, het aantal membraanringen of tubuli gelabeld met goud-albumine-partikels. In het chronisch deficiënte longendotheel van ITSN1-muizen was dit ook 14-voudig toegenomen in vergelijking met de controles.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals een ELISA op muislonglysaten, worden uitgevoerd om het trans-endotheliale transport van verschillende hnic-tracers kwantitatief te schatten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe complexen van onic-liposomen en sRNA specifiek kunnen worden afgeleverd aan het longendotheel van muizen om het eiwit van belang knock-down te doen en de functie ervan te evalueren.