Name: GST-Zijn zuivering: een twee-staps Affiniteitszuivering Protocol Meegevende Full-length gezuiverde eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Leer een kosteneffectieve tweestapsaffiniteitszuiveringsmethode voor recombinante eiwitten met GST- en His-tags. Dit protocol gebruikt SF9-insectencellen en metalaffiniteitschromatografie om hoogzuivere, oplosbare eiwitten te verkrijgen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Anne-Marie Dion-Cote voor beraadslagingen die leiden tot de ontwikkeling van de methode. JK en RB zijn FQNRT doctorale geleerden, M.-MG is een Vanier CIHR geleerde, en J.-YM is een FRSQ senior onderzoeker. Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Natural Sciences and Engineering Research Council om JY. M.

1. Productie van Recombinant Baculovirus Baculovirussen worden gegenereerd met de Bac-to-Bac Baculovirus Expression System van Invitrogen voornamelijk volgens protocol van de fabrikant met slechts geringe wijzigingen: <ol><li> Een gewijzigde pFastBac 1 vector (Gibco, leven) werd opgericht met de GST en His-labels (figuur 2). De multikloneringsplaats (MCS) van een PET-52b (+) vector (Novagen), met daarin een 10xHis-tag, werd ingebracht in de MCS van een pFastBac 1 vector om pFastBac 1-Strep-10xHis genereren. De pET-52b (+) MCS sequentie werd met PCR geamplificeerd tussen de Xbal en Blpl restrictieplaatsen, het toevoegen van een BglII-restrictieplaats aan het 5&#39;-uiteinde en een HindIII restrictieplaats aan het 3 &#39;uiteinde. Het PCR product werd vervolgens gekloneerd tussen HindIII en BamHI restrictieplaats van pFastBac 1, waarbij de verenigbaarheid van BamHI en BglII restrictie sequenties. Aangezien het doel was om een ​​pFastBac 1 die de expressie van genererenrecombinant eiwit met streptavidine-en 10xHis-labels, de BamHI restrictieplaats van de PET-52b (+) MCS sequentie werd niet gebruikt. Ook werd het Xbal restrictieplaats niet gebruikt om de redundantie van restrictieplaatsen die tussen de plaatsen reeds in de MCS van pFastBac 1 en deze ingebracht met de MCS van pET-52b (+) voorkomen. De GST coderende sequentie met de website PreScission Protease erkenning (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) werd vervolgens in pFastBac 1-Strep-10xHis. De GST cDNA sequentie van pGEX-6P-2 (GE Healthcare) werd PCR geamplificeerd met primers die NcoI en KpnI-restrictieplaatsen aan het 5 &#39;en 3&#39; uiteinden respectievelijk. De NcoI-plaats kan de toevoeging van een startcodon maar ook een alanine aan het GST. Het PCR product werd vervolgens gekloneerd in pFastBac 1-Strep-10xHis tussen de NcoI en KpnI-restrictieplaatsen, waardoor het verwijderen van de Streptavidine-tag. De aldus verkregen nieuwe fusievector werd genoemd pFastBac 1-GST-10xHis. </li><li> Kloon het cDNA dat codeert voor het protein van belang in de pFastBac-GST-10xHis vector tussen de GST (N-terminal) en de His-tag (C-terminal). Let op de cDNA stopcodon verwijderen om de fusie met het C-terminale His-tag mogelijk. </li><li> Transform E. DH10Bac coli met het recombinante pFastBac (verkregen bij stap 1.2) aan de bacmide genereren. Laat kolonies overnacht groeien bij 37 ° C en enige uren bij 30 ° C op selectieplaten met Bluo-gal en IPTG (10 ug / ml tetracycline, 50 ug / ml kanamycine, 7 ug / ml gentamycine, 100 ug / ml Bluo- Gal, 40 pg / ml IPTG). </li><li> Pick en restreak 2 witte kolonies (uit stap 1.3) over de selectie platen om de witte fenotype bevestigen. </li><li> Inoculeer 2 ml LB dat 10 ug / ml tetracycline, 50 ug / ml kanamycine, 10 ug / ml gentamycine met de twee witte kolonies van stap 1.4 en laat ze gedurende de nacht groeien onder schudden (250 rpm) bij 37 ° C. </li><li> Om de bacmide DNA zuiveren pellet bacteriën van stap 1.5,resuspendeer de cellen in 300 ul van oplossing I en voeg 300 ul van oplossing II (Maxiprep kit van Qiagen). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, voeg 300 pl 3 M KOAc pH 5,5 en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Centrifugeer de monsters bij 4 ° C, maximale snelheid gedurende 10 minuten. Voeg 800 ul isopropanol aan de supernatanten en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Centrifugeer de monsters gedurende 15 min bij 4 ° C en was het pellet met 500 ui 70% ethanol. Laat het pellet droog en resuspendeer het onder steriele omstandigheden in 40 pl Tris-EDTA pH 8,0. De bacmide DNA moet bij 4 ° C worden bewaard </li><li> Genereer baculovirussen zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. Baculovirussen kan worden opgeslagen bij 4 ° C beschermd tegen licht. </li></ol> 2. Recombinante eiwitexpressie <ol><li> Om de meest efficiënte baculovirus voor zuivering kiezen en te controleren hoe laat de piek van eiwitexpressie wordt bereikt, voert een mini-infectie assay eens volgt: Infect 2 x 10 7 van Sf9 geïnfecteerde cellen gekweekt bij 27 ° C in Grace&#39;s medium (aangevuld met 10% FBS en 1% P / S) met 133 pl (1/150) van baculovirus. Verzamel fracties van 1,5 ml bij 0, 24, 48 en 72 uur na infectie. Pellet de cellen en de expressie van het eiwit van belang door western blotting met behulp van anti-tag antilichamen te analyseren. </li><li> Gebruik de meest efficiënte baculovirus van stap 2.1 een spinner die 1,0 x 10 6 Sf9 cellen per ml in 500 ml medium in een verhouding van 1/150 tussen virus en media infecteren. Laat de geïnfecteerde cellen groeien in suspensie bij 27 ° C en oogst de cellen wanneer de maximale eiwitexpressie (zoals bepaald in stap 2.1) wordt bereikt. Gepelleteerde cellen worden opgeslagen bij -80 ° C tot verder gebruik. </li></ol> 3. Bereiding van oplosbaar cellysaat Alle volgende incubatiestappen worden uitgevoerd bij 4 ° C uitgevoerd onder milde rotatie. <ol><li> Lyse Sf9 cellen die de proteïne van belang in ~ 20 ml GST bindingsbuffer (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% Triton-X-100, 1 mM DTT PBS1X een eindconcentratie van NaCI van 250 mM, en proteaseremmer cocktail (Roche). In een ijswaterbad, dounce de oplossing 20x met een dounce homogeniseerapparaat, ultrasone trillingen 3x 30 seconden (70% vermogen), en Dounce weer 20x. </li><li> (Optioneel). Incubeer de totale cellysaat met 1 mM MgCl2 en Benzonase 7 nuclease (2,5 U / ml) gedurende 30 min bij 4 ° C aan DNA of RNA verontreiniging te verwijderen. </li><li> Centrifugeer bij 18.000 rpm gedurende 30 min bij 4 ° C. Houd de bovenstaande vloeistof. </li><li> (Optioneel). Centrifugeer de supernatant opnieuw voor 30 min bij 18.000 rpm bij 4 ° C om een ​​heldere oplosbare lysaat krijgen. Passeren de bovenstaande vloeistof op een 0,2 of 0,45 pm filter om verstopping te voorkomen. </li></ol> 4. Binding van eiwit op GST Beads <ol><li> Incubeer de oplosbare cellysaat met 1 ml GST-parels (vooraf gewassen tweemaal met10 ml GST bindingsbuffer) gedurende 1 uur bij 4 ° C onder voorzichtige rotatie. </li></ol> Opmerking: De incubatietijd moet worden geoptimaliseerd overeenkomstig de stabiliteit van het eiwit en bindingsefficiëntie. <ol start="2"><li> Snel centrifugeren op 700 toeren per minuut en supernatant die ongebonden eiwitten (dit kan voor verdere analyse worden bewaard). Was de GST-gebonden eiwitten (Figuur 3B, baan 1) met GST wasbuffer (GST binding buffer met 350 mM NaCl definitief). </li><li> Herhaal stap 4.2 2x. Bij de laatste wasbeurt, verwijder zoveel supernatant mogelijk. </li><li> Incubeer de kralen met 5 mM ATP en 15 mM MgCl2 (in 10 ml GST bindingsbuffer) gedurende 1 uur bij 4 ° C te voorkomen specifieke binding van heat-shock eiwitten 8. Was de kralen drie keer met GST wasbuffer. </li></ol> 5. PreScission Splitsing van GST <ol><li> Centrifugeer de GST kralen, verwijder het supernatant en was de GST kralen met P5 buffer (50 mM NaHPO 4 pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 0,05% Triton-X-100, 5 mM imidazool). </li><li> Incubeer de GST-parels PreScission enzym in P5 buffer van 3 uur tot overnacht bij 4 ° C. (Verdeel het GST kralen in fracties van 100 ui en voeg 4-8 eenheden (2-4 pl) enzym verdund in 100 pl buffer P5). </li></ol> Opmerking: De incubatietijd van de PreScission stap moet worden geoptimaliseerd volgens het molecuulgewicht en de stabiliteit van het eiwit. Indien wordt waargenomen, kan de incubatietijd nachts worden verlaagd tot ten minste 2 uur in plaats van. <ol start="3"><li> Snelle draai en verzamel de bovenstaande vloeistof. Herhaal deze stap tweemaal na toevoeging van 100 ui P5 buffer op de kralen en bundelen alle fracties (Figuur 3B, baan 2). </li></ol> Opmerking: De resterende parels worden gebruikt voor analyse van splitsing efficiëntie (Figuur 3B </strong&gt;, baan 3). Meestal wordt 70-80% van het eiwit gesplitst. 6. -Eiwit binding aan TALON metaalaffiniteitshars <ol><li> Verdeel de elutie van bovenaf in 3 fracties van 1 ml en incubeer elk met 100 ul Talon metaalaffiniteitshars droge parels (vooraf gewassen tweemaal met P5 buffer) gedurende 1 uur onder rotatie. </li></ol> Commentaar: Het verdelen van de elutie in verschillende fracties verhoogt binding / wasbeurten efficiëntie. <ol start="2"><li> Was de hars 5 minuten met P30 buffer (P5 buffer met een eindconcentratie van 30 mM imidazool). </li><li> Herhaal stap 6.2 2x en bundelen de kralen in een enkele buis. Vóór de laatste wasbeurt, verwijder zoveel supernatant mogelijk. </li></ol> Commentaar: Dit komt overeen met de TALON gebonden monster (Figuur 3B, laan 4). 7. Elutie van het gezuiverde eiwit <ol><li> Incubeer de eiwitgebonden TALON hars gedurende 5 minuten onder rotatie met P500 buffer (P5 buffer met een eindconcentratie van 500 mM imidazool). Gebruik een verhouding tussen buffer en kralen van 1:01 v / v. (Bijvoorbeeld, als je 200 pl droog kralen had genomen, moet je 200 ul P500 toevoegen). Herhaal deze stap twee keer en houden elkaar geëlueerde fractie afzonderlijk (genoemd elutie 1 (E1), elutie 2 (E2) en elutie 3 (E3); Figuur 3B, lanen 5-7). </li></ol> Opmerking: De resterende parels worden gebruikt voor analyse van elutie efficiëntie (Figuur 3B, laan 8). Typisch wordt 60-80% van het eiwit geëlueerd in totaal. <ol start="2"><li> Analyseer de kwantiteit en kwaliteit van uw gezuiverde eiwit door het laden van ongeveer 20-40 ul van elke fractie met een standaard BSA concentratie op een SDS-PAGE en vlek met Coomassieblauw (Figuur 3B) of SYPRO eiwit vlek voor visualisatie. </li></ol> Commentaar: Het eiwit van belang kan ook worden thro gedetecteerdughout de zuiveringsprocedure met anti-GST en anti-His-antilichamen (Figuur 3C). 8. Opslag van het gezuiverde eiwit <ol><li> Dialyseer het gezuiverde eiwit tegen een geschikte opslagbuffer (bijv. 20 mM Tris acetaat pH 8,0, 200 mM KAc, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT) bij 4 ° C. Het is belangrijk om te controleren op precipitatie van het gezuiverde eiwit gedurende de dialyse. We meestal dialyseren 2x gedurende 1 uur bij 4 ° C onder roeren rotatie. </li><li> Maak kleine hoeveelheden van het gezuiverde eiwit (10-20 pi) en bevriezing op droog ijs gedurende 30 minuten. Bewaar de monsters bij -80 ° C en voorkomen dat veel dooi / vries-cycli. </li></ol>

<ol><li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li>
<li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li>
<li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis%2C+using+three+different+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li>
<li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li>
<li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li>
<li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li>
<li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2%2B+in+the+hydrolysis+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li>
<li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li>
<li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li>
<li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+vector+system%3A+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li>
</ol>

De GST-His zuiveringsprotocol hier gepresenteerde geschikt voor de zuivering van een breed gebied van afmetingen van recombinant eiwit: We succesvol gezuiverd Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), en een instabiele hoog molecuulgewicht eiwit Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Bovendien, de eiwitten gezuiverd met dit protocol waren biochemisch actief 6. Het succes van deze werkwijze hangt uitsluitend af van de expressie, oplosbaarheid en stabiliteit van het g...

De zuivering van recombinante eiwitten is cruciaal om fundamentele vragen in de biochemie aan te pakken. Gebruikelijke manieren eiwitzuivering zoals ionenuitwisselingschromatografie en gelfiltratie afhankelijk fysische eigenschappen van het doeleiwit zoals de iso-elektrische punt en heffingen of grootte, respectievelijk. Deze proteïne kenmerken gedeeld door een verscheidenheid van eiwitten, die aanzienlijk de kans verontreinigende proteïnen in gebruikelijke eiwitzuivering strategieën toe. Dit probleem kan worden omzeild door het gebruik van meerdere kolommen zuivering, hetgeen tijdrovend. Tegelijkertijd, deze chromatografie methoden vereisen dure experimentele opstelling. Affiniteit-zuivering tag sterk toeneemt doel-specificiteit, zoals in de meeste gevallen het label uniek het eiwit van belang zijn. In recente studies is vlag-of HA-affiniteitszuivering grote schaal gebruikt. In tegenstelling tot bestaande recombinant eiwitzuivering protocollen waarin enkele tags worden gebruikt, hebben we de unieke combinatie van twee tags. Onze werkwijze omvat de fusie van een GST-tag aan de N-terminus en een His-tag aan het C-uiteinde van het eiwit van belang, voor een optimale verhouding tussen de hoeveelheid en zuiverheid van het gewenste eiwit. De GST is een lange markering (29 kDa), die zeer efficiënt voor zuivering op glutathion Sepharose kralen. Bovendien gebruiken GST garandeert kosteneffectiviteit van onze methode 1. De mogelijkheid splitsen van de GST met PreScission enzym (met herkenningssequentie LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, waardoor de toevoeging van twee aminozuren) heeft vele voordelen, bijvoorbeeld, en vermijdt veranderingen van de fysiologische functies eiwit door allosterische belemmering. De kleine His-tag gefuseerd met het andere eiwit uiteinde dient in een tweede zuiveringsstap eiwit zuiverheid te verhogen door het wassen van de gesplitste GST, alsmede afgebroken eiwitten en andere<html> verontreinigingen. Bovendien wordt het protocol geen dialyse stap nodig bij het overschakelen van de GST naar de kolom Zijn-zuiveringsstap (TALON hars). Gemeenschappelijke verontreinigingen dergelijke zuiveringswerkwijzen zijn heat shock eiwitten (HSP). De toevoeging van een incubatiestap met MgCl2 en ATP maakt de verwijdering van deze verontreinigingen (figuur 1). Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) zijn gangbare technieken die afhankelijk zijn van dure instrumentatie hoge opbrengst van het gezuiverde eiwit van belang te genereren. De batch zuiveringsprotocol hier geïntroduceerde daarentegen is handmatig en niet dure instrumentele opstelling vereist. Een hoge opbrengst van eiwit kan worden bereikt door het opschalen van het protocol. Tegelijkertijd, partijnummer zuiveringsprotocol, het elutievolume kan worden aangepast om eiwitconcentratie, die niet wordt gegeven met FPLC en HPLC verbeteren. ntent &quot;&gt; Ook, partijnummer GST-His zuiveringsprotocol, eiwitten met een grootte-bereik van ~ 10-300 kDa kunnen worden gezuiverd. Een van de grootste voordelen is gegeven door het feit dat een aantal eiwitten kunnen zuiveren tegelijkertijd bijvoorbeeld, zowel wild-type en de mutante eiwitten. Het succes van de gepresenteerde protocol alleen afhankelijk van het expressieniveau en de oplosbaarheid van het eiwit van belang.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>E.Coli DH10Bac (competent)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Solution I en II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco (Life)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco (Life)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 infected cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>PreScission enzyme</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Grace's infected medium supplemented</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum characterized</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td><td>Gibco (Life)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose resin</td><td>GE bioscience</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clontech</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>BioShop</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco (Life)</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal GST-antibody</td><td>Production in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 6X-His-antibody</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer (tight)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td><td>Fisher</td><td>Model 150</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis bag (50 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>2115217</td><td></td></tr></tbody></table>

gst-zijn zuivering: een twee-staps affiniteitszuivering protocol meegevende full-length gezuiverde eiwitten

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Toets assays Enzymology de biochemische karakterisatie van eiwitten in vitro noodzakelijk hoge concentraties van het gezuiverde eiwit van belang. Eiwitzuivering protocollen te efficiency, eenvoud en kosteneffectiviteit 1 combineren. Hier beschrijven we de GST-His Werkwijze nieuw kleinschalig affiniteit zuiveringssysteem voor recombinante proteïnen, op basis van een N-terminale Glutathion Sepharose tag (GST) 2,3 en een C-terminaal tag 10xHis 4, die beide gefuseerd het eiwit van belang. De laatste construct wordt gebruikt om baculovirussen genereren voor infectie van Sf9-geïnfecteerde cellen voor eiwitexpressie 5. GST is een vrij lange tag (29 kDa) die dient om de zuivering efficiëntie te garanderen. Toch kan het fysiologische eigenschappen van het eiwit te beïnvloeden. Daarom is het vervolgens afgesplitst het eiwit met het enzym PreScission 6. Om maximale zuiverheid te verzekeren en de gesplitste GST te verwijderen, wevoegde een tweede affiniteitszuiveringsfase gebaseerd op de relatief kleine His-tag. Belangrijk is onze techniek waarbij twee verschillende labels aan weerszijden van de twee uiteinden van het eiwit, dat een efficiënt middel om gedegradeerde eiwitten te verwijderen en bijgevolg verrijkt full-length eiwitten. De hier gepresenteerde methode heeft een dure instrumentale setup, zoals FPLC niet nodig. Daarnaast hebben we opgenomen MgCl2 en ATP wast om heat shock protein onzuiverheden en nucleasebehandeling afschaffen verontreinigende nucleïnezuren te verwijderen. Samengevat, de combinatie van twee verschillende labels weerszijden van de N-en C-terminale en de mogelijkheid om splitsen van een van de labels, garandeert het herstel van een sterk gezuiverd en full-length eiwit van belang.

Teneinde de doelmatigheid van de GST-His zuiveringsprotocol illustreren we gezuiverd Rec14 een S. pombe eiwit van 32,9 kDa. De Rec14 cDNA werd gekloneerd in onze gemodificeerde pFastBac 1 vector waardoor de toevoeging van GST-en His-tag aan de N-en C-termini, respectievelijk (figuur 1A). Recombinant baculovirus werden vervolgens bereid en gebruikt om SF9 geïnfecteerde cellen te infecteren voor eiwitexpressie. De oplosbare cellysaten werden geïncubeerd met GST-parels en gebonden eiwitten werden ...

In het huidige protocol, demonstreren we een zeer efficiënte en kosteneffectieve kleinschalige eiwitreiniging methode, die de zuivering van recombinante eiwitten mogelijk maakt door de unieke combinatie van een splitsbaar GST-tag en een kleine His-tag.

GST-Zijn zuivering: een twee-staps Affiniteitszuivering Protocol Meegevende Full-length gezuiverde eiwitten

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het verkrijgen van een zeer gezuiverd, volledig eiwit van belang. Dit wordt bereikt door een recombinant baculovirus te produceren, dat wordt gebruikt om SF nine-insectencellen te infecteren om een sterk tot expressie gebrachte en oplosbare, dubbel getagde versie van het eiwit van belang te verkrijgen. Vervolgens wordt een tweestaps affiniteitszuivering uitgevoerd, bestaande uit de zuivering van het glutathione S-transferase-getagde eiwit, gevolgd door metaalaffiniteitschromatografie.Het resultaat van de zuivering is een zeer zuiver histidine-getagd eiwit. Vervolgens worden de gezuiverde eiwitmonsters gedialyseerd om lage zoutconcentraties in de bewaarbuffer te garanderen. Er worden resultaten verkregen die de expressie-oplosbaarheid, hoeveelheid en kwaliteit van het eiwit aantonen op basis van een totale eiwitkleuring van een SDS-PAGE-gel.Het idee voor deze methode ontstond toen we problemen ondervonden bij het zuiveren van grote en instabiele eiwitten, zoals PAL B twee en BOC twee. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals eenstaps affiniteitszuivering, is dat bij ons tweestaps affiniteitszuiveringsprotocol het verkregen eiwit zeer zuiver is en over het algemeen vrij van degradatieproducten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de eiwitbiologie, zoals de biochemische functies van gezuiverde recombinante eiwitten.Dit protocol begint met de productie van recombinant baculovirus, gevolgd door de selectie van het meest efficiënte BA-virus zoals beschreven in het tekstprotocol voor infectie. Bereid een spinner-kweekvat voor met tussen 0,75 en 1,0 × 10⁶ SF9-cellen in 500 milliliter medium met een ratio van 1:150 tussen virus en medium. Plaats de spinner onder een celkweekkap en infecteer de cellen door het benodigde volume baculovirus-suspensie via één arm van de spinner aan de celsuspensie toe te voegen.Laat de geïnfecteerde cellen in suspensie groeien bij 27 °C en oogst de cellen wanneer de maximale eiwitexpressie is bereikt, wat wordt bepaald bij de keuze van het meest efficiënte baculovirus. Lyse na het oogsten de SF nine-cellen die het doeleiwit tot expressie brengen in ongeveer 20 mL GST-bindingsbuffer, aangevuld met proteaseremmers in een ijswaterbad. Homogeniseer de oplossing 20 keer met een homogenisator en soniceer vervolgens gedurende drie cycli van 30 seconden, gevolgd door nogmaals 20 keer homogeniseren. Centrifugeer vervolgens het cellysaat bij 18.000 RPM gedurende 30 minuten bij 4 °C en bewaar het supernatant. Incubeer het oplosbare cellysaat met 1 mL vooraf gewassen GST-beads gedurende één uur bij 4 °C onder zachte rotatie.De incubatietijd moet worden geoptimaliseerd op basis van de stabiliteit van het proteïne en de bindingsefficiëntie na binding. Centrifugeer kort op 700 RPM en verwijder het supernatant dat de ongebonden proteïnen bevat. Was de GST-gebonden proteïnen met GST-wasbuffer.Herhaal dit proces twee keer na de laatste wasbeurt. Verwijder zoveel mogelijk supernatant. Incubeer de beads vervolgens met 5 millimol ATP en 15 millimol magnesiumchloride in 10 milliliter GST-bindingsbuffer gedurende één uur bij 4 °C om aspecifieke binding van hittestokproteïnen na incubatie te voorkomen.Was de kralen drie keer met GST-wasbuffer. Na het centrifugeren van de GST-kralen en het verwijderen van het supernatant, worden de GST-kralen gewassen met P five-buffer. Verdeel vervolgens de GST-kralen in fracties van 100 microliters en voeg vier tot acht eenheden precisie-enzym toe, verdund in 100 microliters P five-buffer.Incubeer de GST-beads met het enzym gedurende drie uur tot overnacht bij vier graden Celsius onder zachte rotatie. De incubatietijd moet worden geoptimaliseerd op basis van het molecuulgewicht en de stabiliteit van het eiwit na splitsing. Centrifugeer kort en verzamel het supernatant.Voeg 100 µL P vijf buffer toe aan de kraaltjes. Herhaal vervolgens het centrifugeren en het verzamelen van het supernatant twee keer. Verzamel alle fracties.Verdeel de EIT in drie fracties van één milliliter en incubeer elke fractie gedurende één uur onder rotatie met 100 microliters vooraf gewassen talon metaalaffiniteithars droge beads; het verdelen van de elutie over meerdere fracties verhoogt de bindings- en wassefficiëntie. Was vervolgens de hars gedurende vijf minuten met P 30 buffer bij vier graden Celsius met zachte rotatie. Nadat de wasstap twee keer is herhaald, worden de beads in één enkele buis verzameld om het gezuiverde eiwit te elueren.Voeg P 500-buffer toe aan de proteïne-gebonden talon-resin. Gebruik een volumeverhouding tussen buffer en beads van één-op-één. Incubeer de suspensie vijf minuten onder rotatie.Herhaal deze stap twee keer. Bewaar elke geëludeerde fractie apart voor de opslag van het gezuiverde eiwit. Dialyseer het eiwit twee keer gedurende één uur bij 4 °C onder agitatie tegen een geschikte opslagbuffer.Het is belangrijk om tijdens de dialyse te controleren op precipitatie van het gezuiverde eiwit. Maak kleine aliquoten van het gezuiverde eiwit en vries deze 30 minuten lang in op droogijs. Bewaar de aliquoten bij -80 °C en vermijd herhaaldelijke dooi-vriescycli.Analyseer het zuiveringsproces door ongeveer 20 tot 40 µL van elke fractie op een SDS-PAGE-gel te laden. Nadat de gel is gerund, wordt deze gekleurd met Coomassie-blauw of een eiwitkleurstof voor visualisatie. De oplosbare en totale cellysaten van Sf9-cellen die waren geïnfecteerd met het REC14-recombinant baculovirus of mock-geïnfecteerd als controle, werden geanalyseerd via Coomassie-blauwkleuring, waardoor de expressie van het GST-RE14-His-eiwit tijdens het zuiveringsproces kon worden bevestigd. Meerdere monsters werden geanalyseerd om de efficiëntie van de methode te volgen middels analyse van deze monsters met Coomassie-blauw.Kleuring laat zien dat tijdens de eerste zuiveringsstap GST Rec 14 correct gebonden was aan GST-beads met een schijnbaar molecuulgewicht van ongeveer 50 kilodaltons als gevolg van de fusie van rec 14 met GST; na precisie-splitsing met G-S-T-G-S-T migreert vrij rec 14 hiss rond de 37 kilodaltons. Hoewel de gesplitste GST gevisualiseerd kan worden op de GST-beads, en een deel van de vrije REC 14 nog steeds gebonden bleef aan de GST-beads, werd een aanzienlijke verrijking van REC 14 hiss bereikt. Deze stap zou kunnen worden verbeterd door de incubatietijd van het eiwit met precisieprotease te verlengen. Analyse van REC 14 hiss gebonden aan Talon-beads vergeleken met de eiwitten na de GST-zuiveringsstap laat zien dat een groot deel van REC 14 hiss gebonden is aan Talon-beads.Na verschillende wasbeurten werd REC 14 hiss geëlueerd en opgevangen, waarbij drie eluties werden uitgevoerd. De analyse toonde een hoge zuiverheid van rec 14 hiss aan en de hoogste concentratie van rec 14 hiss in de eerste elutie; een vergelijking van de geëlueerde fracties met de talon-beads na elutie illustreert de efficiëntie van de elutie, aangezien er weinig gebonden rec 14 hiss op de beads kon worden aangetoond.Deze monsters werden ook onderworpen aan Western blot-analyse met anti-GST- en anti-his-antilichamen om REC 14 te volgen. Gedurende de procedure laat de anti-GST-blot zien dat er enige GST-REC 14 en GST alleen aanwezig waren in de genoemde eiwitten uit de GST-zuiveringsstap en dat contaminanten werden verwijderd door de his-tag affiniteitszuiveringsstap. Deze blot onthult dat GST efficiënt uit REC 14 was verwijderd door de precisiebehandeling en de his-tag zuiveringsstap.De anti-His blot is bedoeld om Rec 14 te detecteren. Deze blot bevestigt dat GST-Rec 14-His en REC 14-His niet volledig waren gesplitst en verwijderd van de GST-beads. Bovendien lijkt REC 14 bij een hoge concentratie te aggregeren.Samenvattend tonen de gepresenteerde resultaten de efficiëntie van GST-his-zuivering voor de zuivering van S palm B rec 14 aan. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u een sterk gezuiverd recombinant eiwit kunt terugwinnen, eenmaal deze methode beheerst.Deze techniek kan in 12 uur worden voltooid na de degeneratie van oplosbaar ly acid, mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om snel en strikt bij vier graden Celsius te werken om proteïnedegradatie na deze procedure te voorkomen. Andere methoden, zoals co-precipitatie-assays of massaspectrometrie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de identificatie van proteïnepartners of post-translationele modificatie van het proteïne van belang.Hoewel we deze methode gebruiken voor DNA-reparatie-eiwitten, zou de strategie kunnen worden aangepast om de functie van eiwitten in andere onderzoeksgebieden te bestuderen.

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eiwit transductie maakt de directe levering van biologisch actieve eiwitten in cellen. In tegenstelling tot conventionele methoden, zoals DNA-transfectie of virale transductie deze niet-invasieve paradigma maakt zeer efficiënte cellulaire manipulatie in een titreerbare manier te omzeilen cellulaire toxiciteit en het risico van oncogene transformatie door permanente genetische modificatie.

Technische Cel-permeabel Protein

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering van zeer actieve Hsp104, een hexamere AAA + eiwit van gist, die koppels ATP hydrolyse aan eiwit desaggregatie. Deze regeling maakt gebruik van een His6-gelabeld bouwen voor affiniteitszuivering...

Zuivering van Hsp104, een eiwit Disaggregase

Een roman en zeer efficiënte twee-staps affiniteitschromatografie protocol is ontwikkeld en wordt in detail beschreven. De methode is gebaseerd op een kleine zuivering tag met twee inherente affiniteit en is van toepassing op een breed scala van target eiwitten met verschillende eigenschappen.

Orthogonale Protein Purification Gesteund door een Small Bispecifieke Affiniteit Tag

We beschrijven een werkwijze voor de affiniteit-gemerkte zuivering van recombinante eiwitten met vloeistof handling robotica. Deze methode is algemeen toepasbaar op de kleinschalige zuivering van oplosbare His-gemerkte eiwitten in een high-throughput format.

High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten

Source: Becker, B., et al. A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the purification of a polyhistidine-tagged recombinant protein using nickel-based affinity chromatography. It outlines key steps, including bacterial lysis by sonication, clarification and filtration of the lysate, and selective binding and elution of the target protein using imidazole.

 An Affinity Chromatography Technique for the Purification of a Recombinant Bacterial Protein

In this video, we demonstrate the nickel affinity chromatography technique to purify histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes from Clostridium difficile bacteria.

Nickel Affinity Chromatography-Based Protein Purification: A Technique to Purify Polyhistidine-Tagged Recombinant Proteins from Bacterial Cell Lysate

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Een procedure wordt gepresenteerd voor het uiteinde van de dCACHE periplasmische ligand bindend domein van Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 van integratie-organen en de zuivering aan opbrengst milligram hoeveelheden eiwit.

Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

De zuivering van ionenkanalen is vaak uitdagend, maar eenmaal bereikt, kan het potentieel toestaan in vitro onderzoeken van de functies en structuren van de kanalen. Hier beschrijven we de stapsgewijze procedures voor de expressie en de zuivering van eiwitten van zoogdieren bestrophin, een familie van Ca2 +-geactiveerd Cl- -kanalen.

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

Op basis van het assemblagemechanisme van het INAD-eiwitcomplex werd in dit protocol een aangepaste affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het endogene Drosophila TRP-kanaal te zuiveren.

Zuivering van endogene Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Dit artikel biedt een procedure voor de affiniteitszuivering van een humaan recombinant eiwit, flap endonuclease 1 (FEN1), dat is gelabeld met een 6X-histidine-tag. Het protocol omvat het gebruik van twee afzonderlijke geïmmobiliseerde metaalionkolommen voor de zuivering van het gelabelde eiwit.

Affiniteitszuivering van een 6X-His-gelabeld eiwit met behulp van een snel eiwitvloeistofchromatografiesysteem 

Leer een kosteneffectieve tweestapsaffiniteitszuiveringsmethode voor recombinante eiwitten met GST- en His-tags. Dit protocol gebruikt SF9-insectencellen en metalaffiniteitschromatografie om hoogzuivere, oplosbare eiwitten te verkrijgen.

GST-Zijn zuivering: een twee-staps Affiniteitszuivering Protocol Meegevende Full-length gezuiverde eiwitten

Meer video's verkennen