GST-Zijn zuivering: een twee-staps Affiniteitszuivering Protocol Meegevende Full-length gezuiverde eiwitten
29 oktober 2013
In het huidige protocol, demonstreren we een zeer efficiënte en kosteneffectieve kleinschalige eiwitreiniging methode, die de zuivering van recombinante eiwitten mogelijk maakt door de unieke combinatie van een splitsbaar GST-tag en een kleine His-tag.
Het algemene doel van het volgende experiment is om een hoog gezuiverde, volledige lengte eiwit van belang te verkrijgen. Dit wordt bereikt door een recombinant bao-virus te produceren, dat wordt gebruikt om SF negen insectencellen te infecteren om een hoog geëxprimeerde en oplosbare versie van het eiwit van belang te verkrijgen met twee tags. Vervolgens wordt een tweedelige affiniteitszuivering uitgevoerd, gekenmerkt door zuivering van glutathion, seros-getagd eiwit, gevolgd door metaalaffiniteitschromatografie.
Het resultaat van de zuivering is een hoog zuiver histidine-getagd eiwit. Vervolgens worden gezuiverde eiwitmonsters gedialyseerd om lage zoutconcentraties in de opslagoplossing te garanderen. Er worden resultaten verkregen die de expressiesolubiliteit, hoeveelheid en kwaliteit van het eiwit laten zien op basis van volledige eiwitkleuring van een SDS-page gel.
We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we problemen ondervonden bij het zuiveren van grote en onstabiele eiwitten zoals PAL B twee en BOC twee. Dus het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals een stap affiniteitszuivering, is dat in ons tweedelige affiniteitszuiveringsprotocol het verkregen eiwit zeer zuiver is en over het algemeen vrij is van afbraakproducten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het eiwitbiologieveld, zoals biochemische functies van gezuiverde recombinante eiwitten.
Dit protocol begint met de productie van recombinant bao-virus, gevolgd door de selectie van het meest efficiënte BA-virus zoals beschreven in de tekstprotocol voor infectie. Bereid een spinnercultuurvat voor met tussen de 0,75 tot 1,0 keer 10 tot de zesde SF negen cellen in 500 milliliters media met een verhouding van een tot 150 tussen virus en media. Plaats de spinner onder een celcultuurkap infecteer de cellen door het nodige volume baula-virussuspensie toe te voegen aan de celsuspensie via één arm van de spinner.
Laat de geïnfecteerde cellen groeien in suspensie bij 27 graden Celsius en oogst de cellen wanneer de maximale eiwitexpressie is bereikt, wat wordt bepaald bij het kiezen van het meest efficiënte maculaire virus. Na het oogsten van cellen, lyce SF negen cellen die het eiwit van belang tot expressie brengen in ongeveer 20 milliliters GST-bindende buffer, aangevuld met proteaseremmers in een ijswaterbad. Homogeniseer de oplossing 20 keer met een downhomogenisator en soniceer vervolgens gedurende drie 32ste cycli voordat je het weer 20 keer doet. Centrifugeer vervolgens het cellysaat bij 18.000 RPM gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius en bewaar het supernatant. Incubeer het oplosbare cellysaat met één milliliter voorgewassen GST-kralen gedurende één uur bij vier graden Celsius onder zachte rotatie.
De incubatietijd moet worden geoptimaliseerd op basis van de stabiliteit van het pro en bindingsefficiëntie na binding. Draai snel bij 700 RPM en verwijder het supernatant dat ongebonden eiwitten bevat. Was de GST-gebonden eiwitten met GST-wasbuffer.
Herhaal dit proces twee keer na de laatste wasbeurt. Verwijder zoveel mogelijk supernatant. Incubeer vervolgens de kralen met vijf millimolar A TP en 15 millimolar magnesiumchloride in 10 milliliters GST-bindende buffer gedurende één uur bij vier graden Celsius om niet-specifieke binding van hitteschokeiwitten na incubatie te voorkomen.
Was de kralen drie keer met GST-wasbuffer. Na het centrifugeren van de GST-kralen en verwijderen van het supernatant, was de GST-kralen met P vijf-buffer. Verdeel vervolgens de GST-kralen, infracties van 100 microliters en voeg vier tot acht eenheden precisie-enzym toe, verdund in 100 microliters P vijf-buffer.
Incubeer de GST-kralen met enzym gedurende drie uur tot een nacht bij vier graden Celsius onder zachte rotatie. De incubatietijd moet worden geoptimaliseerd op basis van het molecuulgewicht en de stabiliteit van het eiwit na splitsing. Draai snel en verzamel het supernatant.
Voeg 100 microliters P vijf-buffer toe aan de kralen. Herhaal vervolgens, draai en verzamel het supernatant twee keer. Trek alle fracties.
Verdeel de EIT in drie fracties van één milliliter en incubeer elk met 100 microliters voorgewassen talon-metaalaffiniteitsresin-droge kralen gedurende één uur onder rotatie, waarbij de elutie in verschillende fracties wordt verdeeld, wat de binding en wasefficiëntie verhoogt. Was vervolgens de res in vijf minuten met P 30-buffer bij vier graden Celsius met zachte rotatie. Na het twee keer herhalen van de wasbeurt, trek de kralen in een enkele buis om het gezuiverde eiwit te elueren.
Voeg P 500-buffer toe aan de eiwitgebonden talon-resin. Voeg een buffer toe aan de kralenverhouding van één-op-één volume. Incubeer de suspensie gedurende vijf minuten onder rotatie.
Herhaal deze stap twee keer. Houd elke elueerde fractie gescheiden voor opslag van het gezuiverde eiwit. Dialyseer het eiwit twee keer gedurende één uur bij vier graden Celsius onder beweging tegen een geschikte opslagoplossing.
Het is belangrijk om te controleren op precipitatie van het gezuiverde eiwit tijdens de dialyse. Maak kleine aliquoten van het gezuiverde eiwit en bevries op droog ijs gedurende 30 minuten. Bewaar de aliquoten bij min 80 graden Celsius en vermijd veel bevriezingscycli.
Analyseer het zuiveringsproces door ongeveer 20 tot 40 microliters van elke fractie op een SDS-page gel te laden. Na het kleuren van de gel met kumasi blauw of eiwitkleuring voor visualisatie, werden de oplosbare en totale cellysaten van SF negen cellen geïnfecteerd met de REC 14 recombinante valo-virus of mock geïnfecteerd als controle geanalyseerd door kumasi blauwe kleuring, waardoor bevestiging van de expressie van GST re 14 his-eiwit tijdens het zuiveringsproces mogelijk was. Veel monsters werden geanalyseerd om de efficiëntie van de methode te volgen, analyse van deze monsters door kumasi Blue.
De kleuring toont aan dat tijdens de eerste stap van zuivering GST Rec 14 correct we
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol schetst een kosteneffectieve methode voor kleinschalige eiwitzuivering met behulp van een afbreekbaar GST-tag en een His-tag. De aanpak maakt de efficiënte isolatie van recombinante eiwitten mogelijk, waardoor hoge zuiverheid en oplosbaarheid worden gegarandeerd.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Eiwitzuivering
- Recombinante eiwitexpressie
- Affiniteitschromatografie
Achtergrond
- Recombinante eiwitten zijn essentieel voor verschillende biochemische studies.
- Traditionele zuiveringsmethoden kunnen kostbaar en tijdrovend zijn.
- Het combineren van tags kan de zuiveringsefficiëntie verbeteren.
- Insectencellen worden vaak gebruikt voor hoogwaardige eiwitexpressie.
Doel van het onderzoek
- Om een zeer efficiënt eiwitzuiveringsprotocol te ontwikkelen.
- Om een volledige eiwit van belang in een oplosbare vorm te produceren.
- Om de kwaliteit en kwantiteit van het gezuiverde eiwit te evalueren.
Gebruikte methoden
- Productie van recombinant bao-virus voor eiwitexpressie.
- Besmetting van SF9-insectencellen om getagged eiwitten te produceren.
- Twee-staps affiniteitszuivering met glutathion en metaalaffiniteitschromatografie.
- Dialyse van gezuiverde eiwitmonsters om zoutconcentraties te verlagen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle zuivering van een zeer zuiver histidine-getagged eiwit.
- Beoordeling van eiwitexpressie, oplosbaarheid en kwaliteit via SDS-PAGE.
- Demonstratie van de efficiëntie van de zuiveringsmethode.
- Resultaten wijzen op het potentieel van de methode voor bredere toepassingen in eiwitstudies.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is efficiënt en kosteneffectief voor eiwitzuivering.
- Het combineren van GST en His-tags verbetert de zuiveringsresultaten.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende recombinante eiwitten in onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Protein purification remains a critical bottleneck in early-stage target validation, where obtaining full-length, highly pure recombinant proteins is essential for reliable biochemical and functional assays. The GST-His two-step affinity method addresses this challenge by combining orthogonal tags to enrich intact protein species and remove degradation products, thereby improving data quality in downstream screening and mechanistic studies. This approach supports predictive confidence in target validation by reducing false negatives caused by impure or truncated protein preparations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using full-length proteins, reducing mechanistic ambiguity from proteolytic fragments.
- Operational Value: Provides a cost-effective, small-scale purification workflow compatible with baculovirus expression in insect cells.
- Predictive Value: Increases confidence in assay results by enriching for intact protein species, supporting reliable target engagement and enzymatic readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers highly purified protein suitable for quantitative enzymatic assays and binding studies.
- Operational Value: Eliminates need for expensive FPLC systems, enabling scalable implementation in academic and industrial labs.
- Reproducibility: Dual-tag strategy and cleavage step reduce batch variability from degraded protein contaminants.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Purified full-length proteins support preclinical functional validation and biomarker assay development.
- Mechanistic De-risking: Removal of GST tag after initial purification minimizes potential tag-induced artifacts in functional studies.
- Nucleic Acid & HSP Removal: ATP/MgCl2 washes and nuclease treatment reduce common contaminants that interfere with downstream applications.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from recombinant protein expression to assay-ready protein supply, enabling reliable transition from target hit confirmation to lead characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing soluble, full-length protein for enzymatic and interaction assays.
- Screening: Produces assay-ready protein with high purity and low salt content after dialysis, suitable for high-concentration screening formats.
- Analytics: Enables clear SDS-PAGE and Western blot analysis to confirm purity, cleavage efficiency, and absence of degradation products.
- Translational Research: Purified protein can be used in preclinical models to validate target function and mechanism of action.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable across multiple recombinant proteins, reducing re-optimization effort in protein production pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Full-length protein enrichment improves target validation reliability and reduces false structure-activity relationships.
- Operational Value: Two-step affinity purification increases yield of pure protein while minimizing reagent waste and instrument dependency.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions by providing clean biochemical data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Reduces late-stage attrition risk by improving target confidence through rigorous protein quality control.
Implementation Considerations
- Requires expertise in baculovirus production and insect cell culture for recombinant protein expression.
- Dependent on access to glutathione and nickel-affinity resins, protease cleavage enzymes, and standard chromatography equipment.
- Needs standardization of cleavage efficiency and wash conditions across protein targets to ensure consistent tag removal.
- Adaptation may be needed for proteins sensitive to GST tag presence or cleavage conditions.
- Practical limitations include potential incomplete cleavage and residual tag presence, requiring validation via Western blot for each target.
