GST-Zijn zuivering: een twee-staps Affiniteitszuivering Protocol Meegevende Full-length gezuiverde eiwitten

Het algemene doel van het volgende experiment is het verkrijgen van een zeer gezuiverd, volledig eiwit van belang. Dit wordt bereikt door een recombinant baculovirus te produceren, dat wordt gebruikt om SF nine-insectencellen te infecteren om een sterk tot expressie gebrachte en oplosbare, dubbel getagde versie van het eiwit van belang te verkrijgen. Vervolgens wordt een tweestaps affiniteitszuivering uitgevoerd, bestaande uit de zuivering van het glutathione S-transferase-getagde eiwit, gevolgd door metaalaffiniteitschromatografie.

Het resultaat van de zuivering is een zeer zuiver histidine-getagd eiwit. Vervolgens worden de gezuiverde eiwitmonsters gedialyseerd om lage zoutconcentraties in de bewaarbuffer te garanderen. Er worden resultaten verkregen die de expressie-oplosbaarheid, hoeveelheid en kwaliteit van het eiwit aantonen op basis van een totale eiwitkleuring van een SDS-PAGE-gel.

Het idee voor deze methode ontstond toen we problemen ondervonden bij het zuiveren van grote en instabiele eiwitten, zoals PAL B twee en BOC twee. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals eenstaps affiniteitszuivering, is dat bij ons tweestaps affiniteitszuiveringsprotocol het verkregen eiwit zeer zuiver is en over het algemeen vrij van degradatieproducten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de eiwitbiologie, zoals de biochemische functies van gezuiverde recombinante eiwitten.

Dit protocol begint met de productie van recombinant baculovirus, gevolgd door de selectie van het meest efficiënte BA-virus zoals beschreven in het tekstprotocol voor infectie. Bereid een spinner-kweekvat voor met tussen 0,75 en 1,0 × 10⁶ SF9-cellen in 500 milliliter medium met een ratio van 1:150 tussen virus en medium. Plaats de spinner onder een celkweekkap en infecteer de cellen door het benodigde volume baculovirus-suspensie via één arm van de spinner aan de celsuspensie toe te voegen.

Laat de geïnfecteerde cellen in suspensie groeien bij 27 °C en oogst de cellen wanneer de maximale eiwitexpressie is bereikt, wat wordt bepaald bij de keuze van het meest efficiënte baculovirus. Lyse na het oogsten de SF nine-cellen die het doeleiwit tot expressie brengen in ongeveer 20 mL GST-bindingsbuffer, aangevuld met proteaseremmers in een ijswaterbad. Homogeniseer de oplossing 20 keer met een homogenisator en soniceer vervolgens gedurende drie cycli van 30 seconden, gevolgd door nogmaals 20 keer homogeniseren. Centrifugeer vervolgens het cellysaat bij 18.000 RPM gedurende 30 minuten bij 4 °C en bewaar het supernatant. Incubeer het oplosbare cellysaat met 1 mL vooraf gewassen GST-beads gedurende één uur bij 4 °C onder zachte rotatie.

De incubatietijd moet worden geoptimaliseerd op basis van de stabiliteit van het proteïne en de bindingsefficiëntie na binding. Centrifugeer kort op 700 RPM en verwijder het supernatant dat de ongebonden proteïnen bevat. Was de GST-gebonden proteïnen met GST-wasbuffer.

Herhaal dit proces twee keer na de laatste wasbeurt. Verwijder zoveel mogelijk supernatant. Incubeer de beads vervolgens met 5 millimol ATP en 15 millimol magnesiumchloride in 10 milliliter GST-bindingsbuffer gedurende één uur bij 4 °C om aspecifieke binding van hittestokproteïnen na incubatie te voorkomen.

Was de kralen drie keer met GST-wasbuffer. Na het centrifugeren van de GST-kralen en het verwijderen van het supernatant, worden de GST-kralen gewassen met P five-buffer. Verdeel vervolgens de GST-kralen in fracties van 100 microliters en voeg vier tot acht eenheden precisie-enzym toe, verdund in 100 microliters P five-buffer.

Incubeer de GST-beads met het enzym gedurende drie uur tot overnacht bij vier graden Celsius onder zachte rotatie. De incubatietijd moet worden geoptimaliseerd op basis van het molecuulgewicht en de stabiliteit van het eiwit na splitsing. Centrifugeer kort en verzamel het supernatant.

Voeg 100 µL P vijf buffer toe aan de kraaltjes. Herhaal vervolgens het centrifugeren en het verzamelen van het supernatant twee keer. Verzamel alle fracties.

Verdeel de EIT in drie fracties van één milliliter en incubeer elke fractie gedurende één uur onder rotatie met 100 microliters vooraf gewassen talon metaalaffiniteithars droge beads; het verdelen van de elutie over meerdere fracties verhoogt de bindings- en wassefficiëntie. Was vervolgens de hars gedurende vijf minuten met P 30 buffer bij vier graden Celsius met zachte rotatie. Nadat de wasstap twee keer is herhaald, worden de beads in één enkele buis verzameld om het gezuiverde eiwit te elueren.

Voeg P 500-buffer toe aan de proteïne-gebonden talon-resin. Gebruik een volumeverhouding tussen buffer en beads van één-op-één. Incubeer de suspensie vijf minuten onder rotatie.

Herhaal deze stap twee keer. Bewaar elke geëludeerde fractie apart voor de opslag van het gezuiverde eiwit. Dialyseer het eiwit twee keer gedurende één uur bij 4 °C onder agitatie tegen een geschikte opslagbuffer.

Het is belangrijk om tijdens de dialyse te controleren op precipitatie van het gezuiverde eiwit. Maak kleine aliquoten van het gezuiverde eiwit en vries deze 30 minuten lang in op droogijs. Bewaar de aliquoten bij -80 °C en vermijd herhaaldelijke dooi-vriescycli.

Analyseer het zuiveringsproces door ongeveer 20 tot 40 µL van elke fractie op een SDS-PAGE-gel te laden. Nadat de gel is gerund, wordt deze gekleurd met Coomassie-blauw of een eiwitkleurstof voor visualisatie. De oplosbare en totale cellysaten van Sf9-cellen die waren geïnfecteerd met het REC14-recombinant baculovirus of mock-geïnfecteerd als controle, werden geanalyseerd via Coomassie-blauwkleuring, waardoor de expressie van het GST-RE14-His-eiwit tijdens het zuiveringsproces kon worden bevestigd. Meerdere monsters werden geanalyseerd om de efficiëntie van de methode te volgen middels analyse van deze monsters met Coomassie-blauw.

Kleuring laat zien dat tijdens de eerste zuiveringsstap GST Rec 14 correct gebonden was aan GST-beads met een schijnbaar molecuulgewicht van ongeveer 50 kilodaltons als gevolg van de fusie van rec 14 met GST; na precisie-splitsing met G-S-T-G-S-T migreert vrij rec 14 hiss rond de 37 kilodaltons. Hoewel de gesplitste GST gevisualiseerd kan worden op de GST-beads, en een deel van de vrije REC 14 nog steeds gebonden bleef aan de GST-beads, werd een aanzienlijke verrijking van REC 14 hiss bereikt. Deze stap zou kunnen worden verbeterd door de incubatietijd van het eiwit met precisieprotease te verlengen. Analyse van REC 14 hiss gebonden aan Talon-beads vergeleken met de eiwitten na de GST-zuiveringsstap laat zien dat een groot deel van REC 14 hiss gebonden is aan Talon-beads.

Na verschillende wasbeurten werd REC 14 hiss geëlueerd en opgevangen, waarbij drie eluties werden uitgevoerd. De analyse toonde een hoge zuiverheid van rec 14 hiss aan en de hoogste concentratie van rec 14 hiss in de eerste elutie; een vergelijking van de geëlueerde fracties met de talon-beads na elutie illustreert de efficiëntie van de elutie, aangezien er weinig gebonden rec 14 hiss op de beads kon worden aangetoond.

Deze monsters werden ook onderworpen aan Western blot-analyse met anti-GST- en anti-his-antilichamen om REC 14 te volgen. Gedurende de procedure laat de anti-GST-blot zien dat er enige GST-REC 14 en GST alleen aanwezig waren in de genoemde eiwitten uit de GST-zuiveringsstap en dat contaminanten werden verwijderd door de his-tag affiniteitszuiveringsstap. Deze blot onthult dat GST efficiënt uit REC 14 was verwijderd door de precisiebehandeling en de his-tag zuiveringsstap.

De anti-His blot is bedoeld om Rec 14 te detecteren. Deze blot bevestigt dat GST-Rec 14-His en REC 14-His niet volledig waren gesplitst en verwijderd van de GST-beads. Bovendien lijkt REC 14 bij een hoge concentratie te aggregeren.

Samenvattend tonen de gepresenteerde resultaten de efficiëntie van GST-his-zuivering voor de zuivering van S palm B rec 14 aan. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u een sterk gezuiverd recombinant eiwit kunt terugwinnen, eenmaal deze methode beheerst.

Deze techniek kan in 12 uur worden voltooid na de degeneratie van oplosbaar ly acid, mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om snel en strikt bij vier graden Celsius te werken om proteïnedegradatie na deze procedure te voorkomen. Andere methoden, zoals co-precipitatie-assays of massaspectrometrie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de identificatie van proteïnepartners of post-translationele modificatie van het proteïne van belang.

Hoewel we deze methode gebruiken voor DNA-reparatie-eiwitten, zou de strategie kunnen worden aangepast om de functie van eiwitten in andere onderzoeksgebieden te bestuderen.