De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Het algemene doel van deze procedure is om cefale neuronen te genereren uit humane embryonale stamcellen of H ESCs door checkpointen te doorlopen die vergelijkbaar zijn met die welke worden waargenomen tijdens de menselijke ontwikkeling. Dit wordt bereikt door eerst HSCs spontaan te laten differentiëren in suspensie in HESC-medium en ze vervolgens over te brengen naar een neurale inductiemedium om selectiever te differentiëren. Vervolgens worden embryolichamen of PSC-aggregaten toegestaan ​​om zich te hechten aan op weefsel gekweekte, behandelde platen waar de cellen zich uitbreiden en differentiëren tot een monolaag.

Met de centra die neuro-epitheelcellen vormen die morfologisch vergelijkbaar zijn met kilometercellen. Vervolgens worden de neuro-epitheelcellen geïsoleerd en in suspensiecultuur geplaatst waar ze neurosferen vormen. Ten slotte worden de neurosferen op coverslips geplaat waar ze zich verder kunnen differentiëren.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de specifieke typen neuronen laten zien die zijn gevormd door immunokleuring of elektrofysiologie. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot een breed scala aan genetisch geërfde ziekten omdat patiëntspecifieke neuronen ook kunnen worden gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen waarbij het werkingsmechanisme en potentiële therapieën kunnen worden verduidelijkt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de ontwikkeling van talon cefale neurosubtypen uit pluripotente stamcellen.

Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals menselijke ziekten die gerelateerd zijn aan talon cefale neuronen Om humane pluripotente stamcelaggregaten te genereren, begint u met het kweken van humane pluripotente stamcellen op feederlagen van muis embryonale fibroblasten in HESC-medium aangevuld met basis FGF gedurende vijf tot zeven dagen, de kolonies zullen groot zijn, maar nog steeds ongedifferentieerd. Wanneer de kolonies de juiste fase hebben bereikt in een buis van 50 milliliter. Bereid een oplossing van één milligram per milliliter dis bays in D-M-E-M-F 12-medium volgens het tekstprotocol.

Zuig het medium van de cellen en spoel ze vervolgens eenmaal met D-M-E-M-F 12. Na het verwijderen van de was, voegt u één milliliter dis bays toe aan elke put en incubeert u bij 37 graden Celsius gedurende drie tot vijf minuten. Bij de drie minuten markering, controleert u onder de microscoop op opgerolde randen die er wat donkerder uitzien.

Indien nodig, incubeer de cellen langer. Wanneer de cellen klaar zijn, verwijdert u de dase-oplossing en spoelt u de cellen eenmaal met D-M-E-M-F 12 voordat u de was vervangt door 1,5 milliliter HESC-medium om de cellen los te maken en te breken. Plaats de punt van een glazen pipet van 10 milliliter op de cellen richting de onderste rechterwand van een put, en beweeg met een kleine op en neer beweging over de put naar de andere kant voordat u in de tegenovergestelde richting terugkeert.

Zodra alle cellen in suspensie zijn, plaatst u ze in buizen van 15 milliliter en centrifugeert u ze gedurende twee minuten bij 200 G voordat u het medium uit het pellet verwijdert. Gebruik HESC-medium om de cellen over te brengen naar een fles voor cultivering. Bijvoorbeeld, voor cellen uit zes putten van HSCs, gebruikt u een T 75 fles met 50 milliliter HESC.Medium.

Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende 12 uur. Vervolgens om eventuele cellulaire puinhopen te verwijderen, brengt u de cellen en het medium over naar een buis van 50 milliliter en was de cellen eenmaal voordat u ze overbrengt met 50 milliliter vers medium naar een nieuwe fles. Blijf de cellen op deze manier voeden tot dag vijf.

Op dag vijf, centrifugeert u de cellen en brengt u ze over naar een nieuwe T 75 fles. Met 50 milliliter neuraalinductiemedium of NIM, incubeert u ze gedurende twee tot drie dagen waarbij u de helft van de NIM elke dag na de incubatieplaat vervangt, de cellen met behulp van laminine of FBS om ze te helpen aan de platen te hechten. Met behulp van FBS, voegt u 1,5 milliliter medium met cellen toe aan elk.

Schud de plaat voorzichtig om de aggregaten te verspreiden en laat de cellen een nacht lang aanhechten. Bij 37 graden Celsius de volgende dag, vervangt u al het medium met twee milliliter NIM per put. Na een of twee dagen incubatie, zal elke aggregate zich verspreiden om een ​​monolaag te vormen en binnen een paar dagen zullen de centra van de meeste van deze cellen morfologisch vergelijkbaar zijn met columercellen.

Rond dagen 14 tot 17 zullen columercellen compacter lijken. Soms vormen de cellen richels of ringen met een zichtbaar lumen binnenin. Voordat u de cellen isoleert, onderzoekt u ze op de aanwezigheid van niet-EU epitheelcellen en gebruikt u een pipetpunt om ze eraf te schraap.

Om de neuro-epitheelcellen te isoleren die zich in het centrum van de kolonies bevinden. Gebruik een micropipet en een steriele gefilterde pipet van één milliliter om druk uit te oefenen op het centrum van de kolonie zodat deze loslaat. Zorg ervoor dat het buitenste deel van de kolonie niet loslaat.

Breng twee platen met geïsoleerde cellen over naar een buis van 15 milliliter en centrifugeert u gedurende twee minuten bij 200 G. Na het verwijderen van het medium, brengt u de cellen over naar een niet op weefsel gekweekte T 25 fles met 10 milliliter NIM. Met de toevoeging van B 27, incubeert u 's nachts. De cellen zouden een sferachtige verschijning moeten hebben.

Soms zullen de perifere cellen ook worden geïsoleerd en ze zullen zich meestal aan de bodem van de fles hechten. Als dit gebeurt, brengt u de sferische cellen over naar een nieuwe fles en laat u de aangehechte cellen achter om te cultiveren. De neurosferen en suspensie gedurende een week in NIMB 27 om celuithouding en proliferatie te bevorderen.

Voeg cyclisch A MP en insuline-achtig groeifactor een toe. Aan het einde van de week zullen de neurosferen cefale progenitors bevatten en zijn ze klaar om op coverslips te worden geplaatst voor terminale differentiatie. Om gecoate coverslips van polyurethaan laminine in platen van 24 putten voor te