Name: De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Leer hoe je telencefale glutamaterge neuronen genereert uit menselijke pluripotente stamcellen via differentiatiecheckpoints. Deze methode bootst neurale ontwikkeling na voor neurobiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Dr Y. Sasai bedanken voor royaal verstrekken van de FOXG1 antilichaam. Dit werk werd ondersteund door Connecticut Stem Cell Research Grants (08-SCB-UCHC- 022 en 11-SCB24) en spastische paraplegie Foundation.

1. Generatie van menselijke pluripotente stamcellen Aggregaten (D1-D4) <ol><li> Menselijke pluripotente stamcellen zijn gekweekt op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeders in aanwezigheid van hESC medium aangevuld met basic fibroblast growth factor (bFGF, 4 ng / ml). Na 5-7 dagen kweken bij de kolonies groot, maar nog niet gedifferentieerd zijn ze klaar voor de volgende stap. </li><li> De enzymoplossing moet eerst worden bereid. In een 50 ml buis ontbinden dispase (of collagenase) bij 1 mg / ml concentratie in DMEM/F12 medium. Omdat deze oplossingen te mengen best wanneer verwarmd, zet de buis met het medium en enzym in een 37 ° C waterbad gedurende 10-15 minuten en vervolgens gesteriliseerd met behulp van een Steriflip filter. </li><li> Zuig uit het medium van de cellen, spoel ze met DMEM/F12, en zuig dit dan ook uit. Voeg 1 ml dispase in elk putje en in de incubator gedurende 3-5 min voor hESC &#39;(tot 10 min voor iPSCs). Kijken naar de cellen onder een microscoop, wanneerde randen iets opkrullen / zien er een beetje donkerder, de cellen zijn klaar voor de volgende stap. Het beste is om de cellen te controleren na 3 min en leg ze terug in indien nodig. Bij gebruik van dit protocol voor de eerste keer, het beste met slechts een plaat van cellen beginnen tegelijk, is het belangrijk om de cellen uit de dispase zo snel mogelijk. </li><li> Zuigen van de dispase uit de cellen. Zachtjes (de cellen zijn erg kwetsbaar in dit stadium en weg van de plaat relatief gemakkelijk komen) voeg 1,5 ml DMEM/F12 medium aan elk putje om te spoelen de dispase. Zuigen van de DMEM/F12 en voeg 1,5 ml van hESC medium aan elk putje. </li><li> Om los te maken en breken de cellen, plaats de punt van een 10 ml glazen pipet naar de rechterbenedenhoek van een goed (het aanraken van de cellen) en beweeg de pipet op en neer (verticaal) - de opwaartse stoke moet in de nabijheid om de procedure neerwaartse slag. Nadat de andere zijde van de put bereikt is, herhalen de horizontale directie. </li><li> Zodra alle cellen in suspensie zijn, ze in 15 ml en centrifugeer bij 200 xg ze gedurende 2 minuten. Er moet een pellet van cellen op de bodem van de buis. Zuig uit het medium van boven de pellet. </li><li> De grootte van de celkweek kolf die moeten worden gebruikt om de aggregaten in afhankelijk van de oorspronkelijke hoeveelheid cellen. Voor 6 putten (1 plaat) van hESC &#39;s, een niet-weefselkweek behandeld T75 fles met 50 ml van hESC medium moet worden gebruikt. Breng de cellen van stap 1.6 de kolf en incubeer bij 37 ° C. </li><li> Om te ontdoen van de celresten, moet het celmedium en kolf ongeveer 12 uur later vervangen. Om dit te doen, plaatst al het medium / cellen in een 50 ml buis naar beneden draaien van de cellen (200 xg gedurende 2 min), en zuig de oude medium. Voeg vervolgens 50 ml verse hESC medium aan de cellen, en plaats in een nieuwe T75 kolf. De cellen kunnen vervolgens dagelijks gevoerd volgens dezelfde procedure (tot dag 5). </li></ol><ol><li> Breng de cellen / medium in een 50 ml buis en centrifugeer de cellen gedurende 2 min bij 200 x g. Vervolgens aspireren het supernatant en breng de cellen naar een nieuwe (niet behandeld weefselkweek) T75 kolf met 50 ml van neurale inductie medium (NIM). </li><li> Zodra de cellen in NIM, moet de helft van het medium vervangen om de dag. De aggregaten moet groot genoeg om waar ze naar de bodem van een 50 ml conische buis op zichzelf na enkele minuten (geen centrifugatie vereist). Na 2-3 dagen in NIM (D7 D8-totaal) moeten de cellen klaar voor plaat. Laminine of foetaal runderserum (FBS) kan worden gebruikt om de cellen hechten aan de platen. </li><li> Het aantal weefselkweek behandeld 6 well platen die nodig zijn afhankelijk van de dichtheid van de cellen elk aggregaat moet kunnen op de plaat groeien enkele dagen zonder aan een van de anderen. Gemiddeld de cellen van eenT75 fles levert ongeveer 4-6 6 goed platen ter waarde van cellen. </li><li><ol class="ualpha"><li> Bij gebruik laminine, verdund in NIM tot 10-20 ug / ml het bekleden van de plaat met 6 putjes (~ 0,5 ml / putje). Na coating voor 2-3 uur, celaggregaten plaat op platen met 6 putjes (~ 20-30 aggregaten per well). Na de aggregaten hebben gehecht, voeg 1,5 ml van NIM. </li><li> Bij gebruik FBS, een mengsel van 90% NIM en 10% FBS (1,5 ml / putje). Voeg 1,5 ml medium met de cellen in elk putje, schud de plaat heen en weer te spreiden de aggregaten, en laat de cellen om O / N hechten in een incubator. Zorg ervoor dat u het medium (2 ml / putje van NIM) veranderen de volgende ochtend aan de FBS te verwijderen. </li></ol></li><li> Na een dag of twee van zijn verguld, zal ieder aggregaat verspreid naar een monolaag vormen. Binnen een paar dagen, zal de centra van de meeste van deze cellen morfologisch lijken op zuilvormige cellen (langwerpig). Tijdens deze periode, wijzigt u de NIM om de andere dag. Sommige PSC lijnen (especially IPSC), kunnen vormen zuilvormige cellen minder efficiënt. Als dit gebeurt, kan de toevoeging van BMP en TGF remmers (Dorsomorphin 29, SB431542 19 bij 2 uM) gedurende fase 2 nuttig zijn. </li><li> Rond dag 14-17, zal de zuilvormige cellen blijken compacter. Soms zijn deze cellen vormen ruggen of ringen met zichtbare lumen binnen. Naast de kolomvormige morfologie, cellen in dit stadium neuro markers zoals PAX6 en SOX1 12,26. </li><li> Voor de isolatie kan beginnen moet men eerst onderzoeken cellen om te bepalen of er niet neuro cellen aanwezig. Een objectieve marker kan worden gebruikt om de niet-neuro kolonies geven. Deze kunnen vervolgens worden geëlimineerd door schrapen ze af met een pipet tip. </li></ol> 3. Generatie van Telencephalic voorouders (D17-D24) <ol><li> De middens van de kolonies bevatten de neuro cellen en worden geïsoleerd van de rest van de kolonie. Dit kan meteen micropipet en een steriele 1 ml gefilterd pipetpunt. Wanneer een kleine hoeveelheid druk wordt uitgeoefend op het centrale deel van de kolonie, tilt algemeen af ​​heel gemakkelijk. Wees voorzichtig niet te laten het buitenste gedeelte van de kolonie los ook. Als de centra koppig en niet loskomen als zodanig kunnen ze worden verwijderd door uitsnijden met behulp van een naald onder een microscoop in een steriele kap. Breng de centrale delen van de kolonies naar een 15 ml buis en draaien bij 200 xg gedurende 2 minuten. </li><li> Het medium moet worden afgezogen van de cellen. Twee platen waarde van cellen kan vervolgens worden overgedragen aan een niet-weefselkweek behandeld T25 kolf met 10 ml van NIM met de toevoeging van B27 (zonder vitamine A, 1:50). Gebruik 5-10 ml medium per een plaat van cellen. </li><li> Wanneer de cellen gezien de volgende dag worden ze als een bol uiterlijk. Het is noodzakelijk deze cellen over in een nieuwe kolf (in aanwezigheid van NIM en B27, 1:50) zoals vaak het perifere cellensluipen en die hechten aan de bodem van de kolf. </li><li> De neurosferen moet dan in suspensie gekweekt gedurende een week met NIM aangevuld met B27 (1:50). Om celduurzaamheid bevorderen en proliferatie, cyclische AMP (cAMP, 1 uM) en insuline-groeifactor (IGF1, 10 ng / ml) worden toegevoegd aan het medium tijdens suspensiekweek. Op dit punt, de neurosferen bevatten telencephalic voorlopercellen (FOXG1 +) en zijn klaar om te worden uitgeplaat op dekglaasjes voor terminale differentiatie. </li></ol> 4. Verdere differentiatie in de Telencephalic Neuronen (D25 +) <ol><li><ol class="ualpha"><li> Bereid de poly-ornithine/laminin beklede dekglaasjes (in 24-well platen) voor het uitplaten van de cellen. Dekglaasjes worden eerst gereinigd en worden vervolgens bekleed met truc-ornithine (bij 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, en opgeslagen in de vriezer). Poly-ornithine coating: <ol><li> Steriliseer de dekglaasjes: Plaats de dekglaasjes in eenbeker die salpeterzuur en voorzichtig in de zuurkast schud gedurende een uur. Giet het salpeterzuur, meerdere malen afspoelen met DI-water, en laat de dekglaasjes onder stromend DI water gedurende tenminste 15 minuten. Plaats de dekglaasjes in 95% ethanol en schud gedurende 30 minuten (bij gebruik direct) of opslag in ethanol bij kamertemperatuur. </li><li> In een steriele kap, giet de inhoud van de buis met 50 ml gesteriliseerd dekglaasjes in de deksel van een 6-well plaat. Gebruik een steriele tang, pick-up een dekglaasje op een moment en zet rechtop in een putje van een 24-wells plaat. Herhalen zodat elk putje een dekglaasje heeft. </li><li> Nadat ze volledig droog, tikt u op de platen tot dekglaasjes zijn gevallen flat in elk putje. Voeg vervolgens 100 pl poly-ornithine (0,1 mg / ml in steriele dH 2 O) aan elk dekglaasje en incubeer de platen O / N bij 37 ° C. </li><li> De volgende dag verwijderd platen uit de incubator en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Verstuif poly-ornithine af van elkaar dekglaasje (vanaf de rand van thij dekglaasje) en zorg ervoor niet aan te raken of de dekglaasjes krassen in het proces. Laat de coverslips drogen gedurende ongeveer 30 minuten voor het wassen. </li><li> Voeg 1 ml steriel dH 2 O goed aan elk laten staan ​​gedurende 10 min, en zuig het water uit elk putje. Herhaal deze wasstap nog twee keer. Nadat de platen drogen, (verlof dekt af in de kap) plaats de deksels op, dek af met aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C. </li></ol></li><li><ol><li> Het bekleden van de dekglaasjes met laminine, voeg 50 ul van een mengsel van neurale differentiatiemedium en laminine (uiteindelijke concentratie van 20 ug / ml) aan elk poly-ornithine behandeld dekglaasje zorg dat alleen de vloeistof raken dekglaasje zelf (en niet morsen uit). Incubeer ze bij 37 ° C gedurende 1-2 uur voor het bereiden van de cellen voor bevestiging. </li></ol></li></ol></li><li> Verzamel en centrifugeer de neurosferen bij 200 xg gedurende 2 minuten in een 15 ml buis. Zuig het supernatant. </li> &lt;li&gt; <ol class="ualpha"><li> Spoel de cellen met DMEM-F12 en opnieuw gecentrifugeerd cellen. Als de neurosferen te groot om goed hechten, kunnen ze gescheiden in Accutase ten deze stap. </li><li> Bij gebruik Accutase: Na wassen van de cellen met DMEM-F12, de neurosferen worden gescheiden van kleine clusters door toevoeging Accutase (~ 2 ml) en de cellen te incuberen bij 37 ° C gedurende 3 minuten. Voeg vervolgens dezelfde hoeveelheid trypsine inhibitor (~ 2 ml) en gecentrifugeerd bij 200 xg cellen gedurende 3 minuten. De cellen moeten vervolgens geresuspendeerd in NDM en gebroken met een P200 pipet. De kleine clusters kan vervolgens worden uitgeplaat op vooraf beklede dekglaasjes. </li></ol></li><li> Zuigen van de meerderheid van het medium en zet de cellen op een 6 cm Petrischaal in een paar druppels medium zodat ze gemakkelijker te selecteren. Voeg ongeveer 4-5 neurosferen aan elke pre-coated dekglaasje aan. Er is geen behoefte om te zuigen uit de laminine eerste. </li><li> Laat de neurosferen hechten ten minste 2-4 uur. Zodra ze eengoed ttached, moet meer medium (0,5 ml / dekglaasje) worden toegevoegd. Het moet bestaan ​​uit neurale differentiatie medium aangevuld met B27 (1:50), cAMP (1 uM), en neurotrofe factoren (BDNF, GDNF en IGF, alle bij 10 ng / ml). Op dit punt helft van het medium kan worden om de andere dag en deze cellen kunnen gedurende meerdere maanden. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Tanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+specification+in+the+spinal+cord%3A+inductive+signals+and+transcriptional+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes.</a> Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).</li>
<li>Wilson, S. I., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction%3A+toward+a+unifying+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural induction: toward a unifying mechanism.</a> Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li>
<li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).</li>
<li>Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).</li>
<li>Singh Roy, N., Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer-specified+GFP-based+FACS+purification+of+human+spinal+motor+neurons+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).</li>
<li>Lee, H., Shamy, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons.</a> Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).</li>
<li>Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).</li>
<li>Li, X. J., Du, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).</li>
<li>Perrier, A. L., Tabar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).</li>
<li>Roy, N. S., Cleren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).</li>
<li>Yan, Y., Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+dopaminergic+neuronal+subtypes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 781-790 (2005).</li>
<li>Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).</li>
<li>Osakada, F., Ikeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li>
<li>Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+neurons+and+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).</li>
<li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Chambers, S. M., Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).</li>
<li>Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li>
<li>Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Patterning of the embryonic forebrain.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).</li>
<li>Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+in+glutamatergic+neurogenesis%3A+conserved+programs+in+neocortex%2C+cerebellum%2C+and+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus.</a> Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).</li>
<li>Watanabe, K., Kamiya, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li>
<li>Li, X. J., Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136, 4055-4063 (2009).</li>
<li>Zeng, H., Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5, e11853(2010).</li>
<li>Kim, D. S., Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+enhancement+of+neural+differentiation+from+human+ES+and+iPS+cells+regardless+of+their+innate+difference+in+differentiation+propensity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.</a> Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).</li>
<li>Zhang, X., Huang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6+is+a+human+neuroectoderm+cell+fate+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant.</a> Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).</li>
<li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+patterning+of+the+central+nervous+system%3A+how+many+organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Initial patterning of the central nervous system: how many organizers.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).</li>
<li>Ma, L., Hu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+GABA+neurons+correct+locomotion+deficits+in+quinolinic+acid-lesioned+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).</li>
<li>Li, W., Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Lowry, W. E., Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li>
<li>Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Ebert, A. D., Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457, 277-280 (2009).</li>
<li>Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+models+of+the+genomic+imprinting+disorders+Angelman+and+Prader-Willi+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).</li>
<li>Kiskinis, E., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+toward+the+clinical+application+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).</li>
<li>Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin-1+L166P+mutant+human+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+exhibit+partial+loss+of+gamma-secretase+activity+in+endogenous+amyloid-beta+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation.</a> Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).</li>
<li>Walsh, R. M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Rett+syndrome+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Rett syndrome with stem cells.</a> Cell. 143, 499-500 (2010).</li>
<li>Egawa, N., Kitaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Screening+for+ALS+Using+Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+pharmaceutical+industry+reduce+attrition+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Er zijn verschillende kritische stappen tijdens het neurale differentiatieproces. Het is belangrijk dat de menselijke loketten pluripotent zijn omdat anders de cellen al voorgespannen richting van een niet-neuronale oorsprong. Dit wordt bevestigd door het kleuren van de menselijke loketten met antilichamen tegen pluripotentie markers zoals Oct4, SOX2, NANOG en Tra-1-60 1-3. Als de menselijke PSC&#39;s niet goed hechten na passage hen kan ROCK inhibitor (Y27632) worden toegevoegd om te helpen. Voor diegenen di...

Menselijke pluripotente stamcellen (PSC), zowel menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), de capaciteit om elk celtype in het lichaam, waaronder neuronen 1-3 genereren. Gerichte differentiatie van verschillende neuronale subtypes van menselijke PSC heeft de sleutel voor de toepassing van deze cellen in de regeneratieve geneeskunde. De productie van functionele neuronale subtypes tijdens ontwikkeling een complex proces, waarbij de inductie van neurale stam, de specificatie van regionale progenitors langs de rostro-caudale as en de differentiatie van post-mitotische neuronen types van de regionale progenitoren 4,5. Vanaf 2001 zijn er verschillende systemen opgezet om neurale afstamming genereren uit hESC &#39;s, die een platform hebben voor de volgende generatie van neuronale subtypes 6,7. Op basis ontwikkelingsprincipes verschillende types neuron zoals spinale motorische neuronen 8-12, midbrain dopaminerge neuronen 13-15, en neurale retinale cellen 16,17 zijn efficiënt opgegeven vanaf het menselijk PSC&#39;s. Dit werd gedaan door kritische morfogenen die belangrijk zijn voor de specificatie van deze types neuron tijdens in vivo ontwikkeling. Andere protocollen zijn ook ontwikkeld om de differentiatie van hESC &#39;via in neuronen met behulp van aanvullende factoren 18-20 zoals kleine moleculen of co-kweken met andere celtypen om differentiatie 21 bevorderen. De menselijke neocortex is sterk ontwikkeld en bevat vele soorten cellen, met inbegrip van glutamaat neuronen die een belangrijke rol bij het ​​leren, het geheugen en cognitieve functies 22,23 af te spelen. De eerste stap in het genereren glutamaterge neuronen in cultuur te geven telencephalic progenitorcellen. Yoshiki Sasai groep voor het eerst gemeld de gerichte differentiatie van telencephalic voorlopers van muis SER (mESCs) met behulp van een serum-vrij suspension kweken in aanwezigheid van Dkk1 (die remt Wnt signalering) en LeftyA (die remt nodale signalering) 24. Vervolgens hebben verschillende groepen waaronder ons rapporteerden ook de specificatie van telencephalic precursors uit humaan PSC in serumvrij medium 25-27. De generatie van telencephalic precursors van menselijke PSC vereist niet het gebruik van exogene morfogenen en de efficiëntie in het genereren van deze precursors is veel hoger dan van mESCs 26,27. Hier is een chemisch welbepaalde systeem voor neurale inductie die goed werd opgericht door de groep Zhang&#39;s 7 is beschreven. Zonder de toevoeging van exogene caudalizing factoren, dit protocol genereert efficiënt telencephalic voorlopers van menselijke PSC&#39;s 27. Deze voorlopers kunnen dan worden onderscheiden in dorsale of ventrale voorouders door het reguleren van de signalering van Wnt en sonic hedgehog (SHH). De dorsale voorouders kan verder differentiëren in glutamaat neuronen efficiently 27. Daarnaast heeft dit protocol werkt ook goed voor het genereren van glutamaat neuronen van menselijke iPSCs 28, waardoor het genereren van patiëntspecifieke neuronen die kunnen worden gebruikt om het werkingsmechanisme en potentiële therapieën voor een groot scala aan ziekten verkennen . Bovendien ons systeem biedt ook een platform voor de ontwikkeling en specificatie van diverse types neuronale in het telencephalon verkennen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacer</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Non Essential Amino Acids</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapt–thanol (14.3 M)</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)</td><td>Sigma</td><td>116K5103</td><td></td></tr><tr><td>Laminin (human)</td><td>Sigma</td><td>L-6274</td><td></td></tr><tr><td>Laminin (mouse)</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Stemgent</td><td>04-0024</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor</td><td>Gibco</td><td>17075</td><td></td></tr><tr><td>0.1% gelatin</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Foxg1 antibody</td><td>Dr. Y. Sasai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoxb4 antibody (1:50)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>I12</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 antibody (1:5000)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>PAX6</td><td></td></tr><tr><td>Nkx2.1 antibody (1:200)</td><td>Chemicon</td><td>MAB5460</td><td></td></tr><tr><td>Tbr1 antibody (1:2000)</td><td>Chemicon</td><td>AB9616</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT1 antibody (1:100)</td><td>Synaptic Systems</td><td>135302</td><td></td></tr><tr><td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Glial derived neurotrophic factor (GDNF)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Insulin growth factor 1 (IGF1)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>Cyclic AMP (cAMP)</td><td>Sigma</td><td>D-0260</td><td></td></tr><tr><td>Sonic hedgehog (SHH)</td><td>R&D</td><td>1845-SH</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>BD</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>6 well plates</td><td>BD</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24 well plates</td><td>BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>T25 flasks (untreated)</td><td>BD</td><td>353009</td><td></td></tr><tr><td>T75 flasks (untreated)</td><td>BD</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Chemiglass Life Sciences</td><td>1760-012</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Petri dishes</td><td>BD</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>9'' glass pipetes</td><td>Fisher</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip filters (0.22 µM)</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Stericup filters 1,000 ml (0.22 µM)</td><td>Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>Phase contrast microscope (Observer A1)</td><td>Zeiss</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150)</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biosafety hood (Sterilgard III Advance)</td><td>The Baker Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (5702 R)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de specificatie van telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Hier is een stapsgewijze procedure voor het efficiënt genereren telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen (PSC) beschreven. Het differentiatieproces wordt geïnitieerd door het breken van de menselijke loketten tot klonten die afgerond naar aggregaten wanneer de cellen worden geplaatst in een suspensiekweek. De aggregaten worden vervolgens gekweekt in medium hESC van dag 1-4 om voor spontane differentiatie. Gedurende deze tijd de cellen hebben het vermogen te worden elk van de drie kiembladen. Vanaf dag 5-8, werden de cellen in een neurale inductie medium te duwen in de neurale lineage. Rond dag 8 worden de cellen mag hechten op 6 well platen en gedurende welke tijd de cellen neuro vorm differentiëren. Deze neuro cellen kunnen worden geïsoleerd op dag 17. De cellen worden gehouden als neurosferen tot ze gereed zijn uitgeplaat op dekglaasjes. Met behulp van een basisch milieu, zonder enige caudalizing factoren, neuro-epitheliale cellen zijn specified in telencephalic voorlopers, die vervolgens verder kunnen worden onderscheiden in dorsale telencephalic voorouders en glutamaat neuronen efficiënt. Algemeen ons systeem een ​​hulpmiddel om menselijke glutamaat neuronen voor onderzoekers genereren om de ontwikkeling van deze neuronen en de ziekten die hen beïnvloeden bestuderen.

Hier een protocol differentiëren menselijke loketten in telencephalic glutamaat neuronen via verschillende belangrijke stappen: de vorming van aggregaten PSC, de inductie van neuroepitheliale cellen, de productie van telencephalic voorlopercellen, en de terminale differentiatie van deze stamcellen in telencephalic neuronen (Figuur 1) beschreven. Dit systeem is robuust en doeltreffend bij het genereren van telencephalic voorlopers en glutamaat neuronen. Als voorbeeld (figuur 2), zonder t...

Deze procedure levert telencephalic neuronen door door checkpoints die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in menselijke ontwikkeling. De cellen mogen spontaan differentiëren blootgesteld aan risicofactoren te duwen naar de neurale stam, geïsoleerd en uitgeplaat op dekglaasjes om voor terminale differentiatie en maturatie.

De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Het algemene doel van deze procedure is om cefale neuronen te genereren uit menselijke embryonale stamcellen of H ESCs door controlepunten te doorlopen die vergelijkbaar zijn met die welke tijdens de menselijke ontwikkeling worden waargenomen. Dit wordt bereikt door HSCs eerst spontaan te laten differentiëren in suspensie in HESC-medium, om ze vervolgens over te brengen naar neurale inductiemedium voor een selectievere differentiatie. Vervolgens krijgen embryo-lichamen of PSC-aggregaten de gelegenheid om zich te hechten aan met weefselkweek behandelde platen, waar de cellen expanderen en differentiëren tot een monolaag.Waarbij de centra neuro-epitheliale cellen vormen die morfologisch vergelijkbaar zijn met kilometer-cellen. Vervolgens worden de neuro-epitheliale cellen geïsoleerd en geplaatst in suspensieculturen, waar zij neurosferen vormen. Tot slot worden de neurosferen geplaatst op dekglasplaatjes, waar zij verder kunnen differentiëren.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die via immunokleuring of elektrofysiologie aantonen welke specifieke typen neuronen zijn gevormd. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot een breed scala aan genetische erfelijke zi

the-specification-telencephalic-glutamatergic-neurons-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We hebben een protocol voor de inductie van neuroblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale voorouders en neuronale celtypes in het ontwikkelen van CNS voor neurale reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Protocollen voor neuronale differentiatie van pluripotente menselijke stamcellen (hPSCs) vaak tijdrovend en vereisen grote celkweek vaardigheden. Hier hebben we een kleine molecule aangepast gebaseerde differentiatie procedure een multititre plaat formaat, zodat eenvoudige, snelle en efficiënte productie van humane neuronen in een gecontroleerde manier.

Snelle en efficiënte generatie van de neuronen van menselijke pluripotente stamcellen in een Multititre Plate Format

This video demonstrates the process of differentiating embryoid bodies (EBs) into neuroepithelial aggregates and their subsequent division into neuronal and glial cells. This method allows the efficient generation of neuronal and glial cells in vitro, which serve as test systems for toxicity testing as well as assessment of different pathways involved in neurotoxicity.

Generating Neurons and Glial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Embryoid Bodies

This video demonstrates the process of inducing human pluripotent stem cells to differentiate into neurons by transfecting them with engineered lentiviruses carrying a neurogenic transcription factor gene under the control of  tetracycline-responsive element, followed by treatment with a tetracycline derivative and maturation medium.

Human Pluripotent Stem Cell Differentiation in Neurons Using Engineered Lentiviruses

Wij hebben, op basis van kennis uit de ontwikkelingsbiologie en gepubliceerd onderzoek, een geoptimaliseerd protocol ontwikkeld om efficiënt A9 middenhersen-dopaminerge neuronen te genereren uit zowel menselijke embryonale stamcellen als menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, wat nuttig zou zijn voor ziektemodellering en celvervangende therapie voor de ziekte van Parkinson.

Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Dendritische stekels van piramidale neuronen zijn de sites van de meest prikkelende synapsen in de hersenen van zoogdieren cortex. Deze methode beschrijft een 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie in menselijke corticale piramidale glutamaat neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) worden beschouwd als een krachtig instrument voor drugs- en chemische screening en voor de ontwikkeling van nieuwe in vitro modellen voor toxiciteitsonderzoek, inclusief neurotoxiciteit. Hier wordt een gedetailleerd protocol voor de differentiatie van hiPSCs in neuronen en glia beschreven.

Protocol voor de differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in gemengde culturen van neuronen en glia voor het testen van neurotoxiciteit

In dit protocol, wij streven ernaar om te beschrijven een reproduceerbare methode voor combineren losgekoppeld menselijke pluripotente stamcel afgeleid neuronen en astrocyten samen in 3D bol cocultures, behoud van deze gebieden vrij zwevende voorwaarden, en daarna het meten van synaptic circuit activiteit van de bollen met immunoanalysis en multielectrode serie opnamen.

Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Verminderde mitochondriale vervoer en morfologie zijn betrokken bij verschillende neurodegeneratieve ziekten. Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide voorhersenen neuronen om mitochondriale vervoer en morfologie in erfelijke spastische dwarslaesie te beoordelen. Dit protocol maakt karakterisering van mitochondriale handel langs axonen en analyse van hun morfologie mogelijk, wat de studie van neurodegeneratieve ziekte zal vergemakkelijken.

Analyseren van mitochondrial transport en morfologie in de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in erfelijke Spastische dwarslaesie

We beschrijven een methode voor het differentiëren van door het ruggenmerg geïnduceerde pluripotent-afgeleide astrocyten en neuronen en hun co-cultuur voor elektrofysiologische registratie.

Oprichting van een elektrofysiologisch platform voor het modelleren van ALS met regionaal specifieke menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten en neuronen

Het afleiden van afstammingslijnen van het enterische zenuwstelsel (ENS) uit menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) biedt een schaalbare bron van cellen om de ontwikkeling en ziekte van ENS te bestuderen en om te gebruiken in regeneratieve geneeskunde. Hier wordt een gedetailleerd in vitro protocol gepresenteerd om enterische neuronen af te leiden uit hPSC's met behulp van chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden.

Differentiatie van afstammingslijnen van het enterische zenuwstelsel van menselijke pluripotente stamcellen

Leer hoe je telencefale glutamaterge neuronen genereert uit menselijke pluripotente stamcellen via differentiatiecheckpoints. Deze methode bootst neurale ontwikkeling na voor neurobiologisch onderzoek.

De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen