Name: In vivo meting van de muis Pulmonary Endothelial oppervlaktelaag (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Leer de dikte van de endotheliale oppervlaktelaag meten in de longmicrovasculatuur van muizen met behulp van intravitale microscopie. Deze techniek maakt nauwkeurige metingen mogelijk in bewegende organen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Drs. Arata Tabuchi en Wolfgang Kuebler (Universiteit van Toronto) voor instructies over intravitale microscopie. Wij danken Andrew Cahill (Nikon Instruments) voor hulp bij het microscopie ontwerp en uitvoering. Dit werk werd gefinancierd door NIH / NHLBI subsidies P30 HL101295 en K08 HL105538 (naar EPS).

1. Voorbereiding van chirurgische Tubing, vasculaire katheters, Borst Muur Raam <ol><li> Intravitale microscopie podium. We custom-made een plexiglas stadium waarop de verdoofde muis ligt tijdens microscopie. Deze fase geschikt zowel een 15 x 10 cm flexibele kunststof snijplank (waarop de muis ligt tijdens de inductie van de anesthesie, tracheostomie plaatsing en veneuze catheterisatie) en een even grote verwarmingselement (onder de snijplank). </li><li> Muis thoracostomy tube preparaat (figuur 1). Een 10 cm lang PE 50 buis (Intramedic, inwendige diameter 0,58 mm, 0,965 mm buitendiameter) wordt gesneden. Een uiteinde is bevestigd aan het stompe uiteinde van een gebogen 23 gauge naald, deze naald wordt gebruikt om de buis door het borstwand (binnen → buiten) vóór het sluiten van de thoracale venster. Het distale einde van de buis (1,5 cm lang, tegenover de bijgevoegde 23 gaugenaald) wordt herhaaldelijk doorboord door een naald van 30 gauge, het creëren van &quot;poorten aan de zijkant&quot; om effectieve aspiratie van intrathoracale lucht te vergemakkelijken. Deze fenestratie deel wordt vervolgens gescheiden van de rest van de buis door verscheidene perifere lussen van 4:00 zijden hechtdraad, deze lussen zal als &quot;stopper&quot; uiteindelijk verankering van 1,5 cm fenestratie gedeelte in de borstholte. </li><li> Jugulaire katheters. Twee 15 cm lengte van PE 10 buis (Intramedic, inwendige diameter 0,28 mm, buitendiameter 0,61 mm) worden afgesneden. Een scalpel wordt gebruikt om de schuine uiteinden van de buis, waardoor het gemak van venapunctie. De buis wordt gespoeld met een 1 ml spuit met 6% 150 kDa dextranoplossing (in PBS) aan de niet-afgeschuinde uiteinde van de buis. </li><li> Borstwand venster bereiding (figuur 2). Transparent polyvinylideen membraan (New Kure Wrap, Kuresha, Tokyo) wordt gesneden in een ovale vorm (6 cm hoofdas, nevenas 4 cm). Een ronde 5 mm # 1 dekglaasje (Bellco) is bevestigd aan het membraan met behulp α-cyanoacrylaat lijm (Pattex Flüssig, Henkel, Düsseldorf). </li><li> . Buis voor pneumothorax inductie (&quot;blow tube&quot;) Een 10 cm stuk buis (inwendige diameter 3 mm, buitendiameter 5 mm) is bevestigd aan een 5 ml spuit, het andere uiteinde wordt gebruikt om lucht in het dier borstkas voorafgaand aan de borstwand venster aanslaan. </li><li> Injectiespuit voor water ondergedompeld doel. Een 23 gauge naald bevestigd aan een 30 ml spuit met gedestilleerd water. De punt van de naald wordt tegengewerkt (met een metalen vijl) om schade aan de doelstelling te voorkomen. </li></ol> 2. Muis Anesthesie <ol><li> Een muis wordt verdoofd met een mengsel van ketamine (10 mg / ml) en xylazine (2 mg / ml), intraperitoneaal toegediend in een dosis van 8 pi per muis gram lichaamsgewicht. Sedatie duurt 3 - 6 min en mogen op geen spontane ademhaling. </li><li> Met behulp van een elektrisch scheerapparaat, scherende keel, borst, buik en rechterzijde van de muis. </li><li> Met behulp van tape, zet de muis om een ​​dun plastic snijplank. Het hoofd van de muis moet naar de operator (figuur 3). Gentle spanning geleverd door een lus van hechtdraad passeren onder de bovenste tanden dient te onderhouden hoofd extensie. De snijplank is geplaatst op een verwarmingselement, het onderhouden van de muis euthermia tijdens tracheostomie en veneuze katheter. </li><li> Natte geschoren gebieden met 100% ethanol. </li><li> Bevestig adequate anesthesie met een staart / poot knijpen. Ga als minimale respons; zorgen voor een extra bolus van ketamine / xylazine als onvoldoende verdoofd. </li></ol> 3. Tracheostomie <ol><li> A 1 cm incisie gemaakt over de keel. Onderliggende bindweefsel wordt ontleed en de speekselklieren worden gescheiden en zijdelings gereflecteerd. De sternohyoid spier direct anterieur van de trachea is weggesneden. </li><li> Een lus van 04:00 hechtdraad wordt voortbewogen onder ee trachea (figuur 4). De lus wordt vervolgens gesneden, het creëren van twee aparte strengen van hechtdraad ten grondslag liggen aan de luchtpijp. De caudale hechtdraad wordt gebruikt om de tracheotomiecanule waarborgen; de schedelholte hechtdraad wordt gebruikt om spanning op de trachea bieden tijdens tracheostomie plaatsing. </li><li> Met twee vingers, wordt de bovenste hechting vastgegrepen en zachte spanning op de trachea. Een horizontale incisie gemaakt in de trachea tussen bovenste en onderste hechtingen. Deze incisie moeten elkaar kruisen ongeveer twee derde van de tracheale omtrek. Een flens tracheotomiecanule (Harvard Apparatus, 1,22 mm buitendiameter) wordt in de distale trachea en vastgezet vast met de caudale tracheale hechtdraad. </li><li> Tracheostomie is verbonden met een in volume geregelde ventilator klein dier (Inspira, Harvard Apparatus), en de muis ventilatie met 40% ingeademde zuurstof en 9 ml / kg teugvolumes (geoptimaliseerd voldoende zuurstof / ventilatie in ons laboratorium te houden). Positieve eind-expiratoire druk (PEEP) is niet begonnen op dit punt. Van de nota, dient ventilator instellingen worden geoptimaliseerd om unieke omstandigheden binnen de afzonderlijke laboratoria. Verschillende lengtes van overtollige buis (geplaatst tussen de ventilator buis Y-connector en tracheostomie) kan gebruikt worden om dode ruimte passen, een stabiele alveolaire ventilatie voor gekozen tidal volume. </li></ol> 4. Veneuze catheterisatie <ol><li> Het verbindingspunt van de interne en externe halsader kunnen worden geïdentificeerd door het volgen distale veneuze vertakkingen proximaal. De externe jugularis wordt gevonden onder de gereflecteerde speekselklieren, dit kan proximaal terug te voeren op de externe-interne halsader knooppunt te vinden. </li><li> Gebruik zachte stompe dissectie tot de halsader knooppunt te scheiden van de omliggende bindweefsel. </li><li> Met behulp van 04:00 hechtingen, binden uit de externe halsslagader en de interne jugular aderen distale (craniale) aan de halsader knooppunt. </li><li> Maak een kleine incisie in de carinavan de jugulaire junctie; bloeding minimaal. </li><li> Twee katheters kan stapsgewijs worden voortbewogen door de insnijding en in de halsader stam. Na een zachte aspiratie om bloed terugkeer te verzekeren, worden katheters bevestigd in de ader met behulp van 04:00 hechtingen. </li><li> Tape veneuze katheters om de snijplank om te voorkomen dat tegen het per ongeluk losraken. </li></ol> 5. Intravitale Mouse Lung Microscopie Chirurgie (overgenomen van Tabuchi et al. 18). <ol><li> De snijplank (met de ingehouden verdoofde muis en opgenomen veneuze katheters) is overgezet naar de intravitale microscopie fase waarin de resterende chirurgische ingrepen worden uitgevoerd. Een rectale temperatuur sonde wordt geplaatst, dit interfaces met een adaptieve verwarmingssysteem (onder de snijplank), waardoor het onderhoud van de muis euthermia. </li><li> Een jugular veneuze katheter bevestigd aan een spuitpomp met een ketamine (10 mg / ml)-xylazine (2 mg / ml) levertmengsel bij 200 ui per uur. Adequate anesthesie wordt opnieuw bevestigd met behulp van de staart / poot knijpen. </li><li> De incisie wordt verlengd vanaf de hals naar de xyphoid proces verloopt dan zijdelings naar rechts (figuur 5). </li><li> Met elektrocauterisatie, wordt de borstmuskulatuur verwijderd, waardoor de borstkas. Zorg is genomen om volledige hemostase te garanderen. </li><li> Steek de muis recht achterbeen over de linker kant en band naar beneden. De resulterende abdominale torsie draait de thorax licht, een vereenvoudigd de operatie. </li><li> Plaats de fase een hoek van 45 graden (figuur 6); deze positionering kan de long afvallen van de borstwand wanneer de pneumothorax wordt geïnduceerd. </li><li> De 1 e rib (meest inferieure rib) wordt vastgepakt met een pincet en getogen, een gebogen pincet wordt botweg geduwd onder de rib. Dit scheidt pariëtale pleura van de borstwand. Het borstvlies moet blijven unpunctured. </li><li> Met de blaaspijp eneen spuit, wordt de lucht met kracht ingezet tegen de pariëtale pleura. Dit leidt tot breuk van de pleurale oppervlak en pneumothorax zonder de onderliggende long. De onderliggende long zullen afvallen van de borstwand, waardoor invoering van een elektrocauterisatie pincet zonder beschadiging van de longen. Een afname in ventilator slagvolume is meestal niet nodig tijdens deze stap. </li><li> Met behulp van elektrocauterisatie tang, ontleden de borstwand spieren en dwars door de 5 e en 6 e ribben / pariëtale pleura, het maken van een ~ 8 mm rond gat in de borstwand. Het is essentieel dat volledige hemostase wordt gehandhaafd, aangezien de aanwezigheid van bloeding zal verduisteren microscopie (figuur 7). </li><li> Met behulp van een naald driver, plaatst u de thoracostomy buis in de borstwand gat. De naald moet doorprikken de borstwand en verlaat de borstholte inferieur en lateraal van de thoracale venster (Figuur 7). Pas op dat aanprikken van de membraan. Debuis wordt vervolgens voorzichtig teruggetrokken uit de borstwand totdat weerstand optreedt van het hechtmateriaal &quot;stop&quot; aan de rand van de fenestratie van de buis. </li><li> Plaats het podium plat. </li><li> Voeg 3 cm H 2 O PEEP om de ventilator te helpen te helpen long reexpansion. </li><li> Lijm (Pattex gel, Henkel) is de omtrek geplaatst rond de borst venster. Het membraan is bevestigd, met de glazen dekglaasje naar buiten naar de borstholte. Voorzichtig (en in omtreksrichting) bij benadering het membraan naar de lijm met een katoenen applicator. </li><li> Tijdens het uitvoeren van een long recruitment manoeuvre (3 teugvolumes waarin de PEEP ventilator poort geblokkeerd wordt), is -3 mm Hg zuigkracht toegepast op de thoraxdrain. De long moet voortdurend bij benadering het membraan terwijl ze vrij bewegen tijdens het getij ventilatie (figuur 8). </li><li> De rechter voorpoot van de muis overgestoken naar links, waardoor de laterale decubitus positie van de muis.Spons wiggen kan worden gebruikt om de juiste positie muis zodat de borst venster uitgelijnd met de microscopie water immersie objectief. </li><li> Gedestilleerd water wordt op het dekglaasje voor microscopie, waardoor visualisatie van de long met een water immersie objectief. Water moet met tussenpozen worden aangevuld door beeldvorming. </li></ol> 6. Meting van de Pulmonary endotheeloppervlak Laagdikte <ol><li> Onmiddellijk na sluiting borstwand wordt 500 ul FITC-gelabelde 150 kDa dextran (6% oplossing in PBS) toegediend via de tweede (niet-anesthesie) jugulaire veneuze katheter. Deze bolus dient als volume reanimatie en de tracer voor vasculaire ESL meting. De dextran bolus heeft geen invloed op neutrofiele adhesie of longoedeem vorming 2. </li><li> Het water immersie objectief gecentreerd is over de dekglas. De keuze van objectieve essentieel te visualiseren kleine verschillen in dikte ESL, een hoge numeriekcal diafragma nodig is (&gt; 0,8) met behoud van een 2 - 3 mm werkafstand (waardoor penetratie door de longen raam en pleurale oppervlak). We maken gebruik van de Nikon Gerecht van eerste aanleg 75 LWD 16x (NA 0,8) en CFI 75 LWD 25x (NA 1,1) doelstellingen voor dit doel. </li><li> Een nauwkeurige meting ESL dikte in een bewegend orgaan, is het essentieel dat helderveld en fluorescent vasculaire breedtes gelijktijdig worden uitgevoerd. Dit kan worden bereikt met behulp van een afbeelding splitter (Dual View, Photometrics) waarmee tegelijkertijd nemen van gereflecteerd licht differentieel interferentie contrast (DIC, helderveld) en FITC beelden (Figuur 9). </li><li> Tijdens een 5 sec inspiratoire pauze wordt continue beeldvorming uitgevoerd en opgenomen. Later kunnen deze beelden worden herzien om in-focus frames te identificeren. </li><li> Met behulp van een in-scherpstelkader, subpleural microvaten (&lt;20 micrometer diameter) worden geïdentificeerd; minstens 3 microvaten zijn meestal te vinden op een enkel frame. Na voltooiing van het experiment, DICen FITC-dextran vasculaire breedten worden gemeten (door een geblindeerde waarnemer) door het gemiddelde lengte van drie loodrechte intercepts per microvaatje. Bij gelijke dikte ESL aan beide randen van het vaartuig kan de ESL afmetingen worden bepaald door de helft van het verschil tussen DIC en FITC-dextran vasculaire breedtes, zoals beschreven in de sectie Representatieve resultaten. </li><li> Meestal kan intravitale microscopie worden uitgevoerd voor&gt; 90 min zonder enig bewijs van longschade of hypotensie 2. Voorlopige experimenten moeten worden uitgevoerd om de muis stabiliteit (bloeddruk, oxygenatie, ventilatie, longbeschadiging) bevestigen in de periode van waarneming. Experimentele geneesmiddelen worden via de tweede (niet-verdoving) jugulaire catheter op enig moment tijdens de procedure. </li></ol> 7. Meting van de alternatieve Pulmonary Endothelial oppervlaktelaag Integrity De intacte endotheliale oppervlaktelaag functies (gedeeltelijk) te circulat sluitening elementen uit het endotheliale oppervlak 2. ESL integriteit kan derhalve worden gemeten door het vermogen van een circulerende element (bijv. een fluorescerend microbolletje) toegankelijk en interactie met celoppervlak adhesiemoleculen (zoals ICAM-1). <ol><li> Anti-ICAM-1 gemerkte fluorescerende microbolletjes worden voorbereid vóór chirurgie. Streptavidine beklede 0,97 um fluorescerende microbolletjes worden geïncubeerd met gebiotinyleerd anti-ICAM-1 (YN1/1.7.4 kloon, 1:50, eBioscience) of isotype controle antilichaam gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De microsferen worden driemaal gewassen en gesuspendeerd in PBS met 1 x 10 9 microbolletjes per ml. </li><li> Tijdens intravitale microscopie wordt de microsferensuspensie (100 ui) geïnjecteerd in de halsader katheter. Na 15 min van het verkeer, zijn fluorescerende beelden die zijn vastgelegd in 5 minuten. Microsferen onbeweeglijk gedurende&gt; 5 min worden beschouwd als aanhanger en gekwantificeerd met behulp van beeldverwerking software. </li></ol> 8. Euthanasia &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Na afloop van de procedure, zijn verdoofde muizen gedood door verbloeding via directe hartpunctie. Euthanasie wordt bevestigd via bilaterale pneumothorax, waarna longen worden geoogst en snap-bevroren voor latere analyse.

<ol><li>Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+degradation+of+matrix+proteoglycans+and+edema+development+in+rabbit+lung%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung.</a> AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).</li>
<li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).</li>
<li>Florian, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycan+is+a+mechanosensor+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells.</a> Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).</li>
<li>Chappell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Glycocalyx+of+the+Human+Umbilical+Vein+Endothelial+Cell%3A+An+Impressive+Structure+Ex+Vivo+but+Not+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture.</a> Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).</li>
<li>Potter, D. R., Damiano, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hydrodynamically+relevant+endothelial+cell+glycocalyx+observed+in+vivo+is+absent+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro.</a> Circ. Res. 102, 770-776 (2008).</li>
<li>Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+and+Function+of+the+Endothelial+Glycocalyx+Layer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).</li>
<li>Pittet, M., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li>
<li>Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+tomato+%28Lycopersicon+esculentum%29+lectin+with+its+deglycosylated+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative.</a> Biochem. J. 220, 843-847 (1984).</li>
<li>Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-wall+micro-PIV+reveals+a+hydrodynamically+relevant+endothelial+surface+layer+in+venules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo.</a> Biophys. J. 85, 637-645 (2003).</li>
<li>Vink, H., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules%2C+Erythrocytes%2C+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circ. Res. 79, 581-589 (1996).</li>
<li>Marechal, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+glycocalyx+damage+during+endotoxemia+coincides+with+microcirculatory+dysfunction+and+vascular+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress.</a> Shock. 29, 572-576 (2008).</li>
<li>Presson, R. G. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Imaging+within+the+Murine+Thorax+without+Respiratory+and+Cardiac+Motion+Artifact%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact.</a> The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).</li>
<li>Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ventilation+on+vascular+permeability+and+cyclic+nucleotide+concentrations+in+ischemic+sheep+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs.</a> J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).</li>
<li>Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nitric+oxide+synthesis+enhances+leukocyte+rolling+and+adhesion+in+human+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature.</a> Journal of Inflammation. 9, 28(2012).</li>
<li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+guanylyl+cyclase+contributes+to+ventilator-induced+lung+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice.</a> AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).</li>
<li>Mead, J., Takishima, T., Leith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+distribution+in+lungs%3A+a+model+of+pulmonary+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity.</a> J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).</li>
<li>Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilator-induced+lung+injury%3A+the+anatomical+and+physiological+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework.</a> Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).</li>
<li>Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Lung+Injury+Causes+Pendelluft+Between+Adjacent+Alveoli+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490(2011).</li>
<li>Roebuck, K. A., Finnegan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1+%28CD54%29+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression.</a> J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Samenvallend met het toenemende gebruik van in vivo microscopie, is er toenemende waardering voor zowel de aanzienlijke omvang van de ESL evenals de talrijke bijdragen tot vasculaire functie. Deze nieuwe gegevens, echter, zijn hoofdzakelijk afkomstig uit studies van de systemische vaatstelsel. Inderdaad, het gebruik van in vivo microscopie in de long technische uitdagingen, aangezien significante pulmonale en cardiale bewegingsartefacten. Verschillende recente technische on...

De endotheliale glycocalyx is een extracellulair laag van proteoglycanen en glycosaminoglycanen verbonden langs de vasculaire intima. In vivo, de glycocalyx is sterk gehydrateerde, die een belangrijke endotheliale oppervlaktelaag (ESL) die een verscheidenheid van functies zoals endotheliale vloeistof permeabiliteit 1, neutrofiel-endotheliale regelt adhesie 2 en de mechanotransductie vloeistof schuifspanning 3. Historisch gezien is de glycocalyx is ondergewaardeerde vanwege zijn aberrance in gekweekte celpreparaten 4, 5 en de afbraak tijdens normale weefsel fixatie en verwerking 6. Het toenemende gebruik 7 van intravitale microscopie (in vivo microscopie, IVM) heeft samen met verhoogde wetenschappelijke belangstelling voor het belang van de ESL tot vaatfunctie bij gezondheid en ziekte. De ESL is onzichtbaar voor lichtmicroscopie en kunnen niet gemakkelijk worden geëtiketteerdvivo, gezien de neiging van fluorescerende glycocalyx-bindende lectinen te RBC agglutinatie 8 en fatale longembolie (niet gepubliceerde observaties) veroorzaken. Verschillende indirecte benaderingen zijn daarom ontwikkeld om ESL dikte (en, bij uitbreiding, glycocalyx integriteit) af te leiden in niet-bewegende vaatbedden zoals de cremasteric en mesenteriale microcirculations. Deze technieken omvatten het meten van verschillen in circulerende microdeeltje snelheid als functie van de afstand tot de endotheliale membraan (micropartikel image velocimetry 9) en het meten van de uitsluiting van volumineuze, fluorescentie-gemerkt vasculaire markers (bijv. dextranen) van het endotheeloppervlak (dextran uitsluiting techniek 10, 11). Van deze technieken alleen dextran uitsluiting kan schatten ESL dikte van metingen op een bepaald tijdstip. Door het gelijktijdig meten van vasculaire breedtes met helderveld microscopie (een breedte inclusive de &quot;onzichtbare&quot; ESL) en fluorescentiemicroscopie van een vasculair tracer buiten de ESL kan ESL dikte worden berekend als de helft van het verschil tussen vasculaire breedtes 2. Het gebruik van een momentane meting van ESL dikte geschikt voor studie van de pulmonale glycocalyx. Intravitale microscopie van de long is een uitdaging, een grote mate van pulmonale en cardiale bewegingsartefact. Hoewel recente vorderingen maken voor immobilisatie van muizenlongen in vivo 12, 13 bestaan ​​zorgen over de fysiologische gevolgen van long stasis. Lung immobiliteit wordt in verband gebracht met een verminderde endotheel NO signalering 14, een signaalweg die zowel neutrofiele adhesie 15 en longschade 16 beïnvloedt. Bovendien immobilisatie van een gebied van long bloot rond mobiele alveolen schadelijke afschuifkrachten (zogenaamde &quot;atelectrauma&quot;), in overeenstemming met de klassieke fysiologische begrippenalveolaire onderlinge afhankelijkheid 17. In 2008, Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler en collega&#39;s ontwikkelden een chirurgische techniek waardoor intravitale microscopie van een vrij bewegende muizenlong 18. Respiratoire artefact als gevolg van deze techniek kan worden teniet gedaan door gebruik van snelle beeldvorming, met inbegrip gelijktijdige meting van helderveld en fluorescentiemicroscopie. In dit verslag wordt beschreven hoe momentane dextran uitsluiting imaging kunnen worden gebruikt om VSV dikte te meten in de subpleural microcirculatie van een vrij bewegende, in vivo muizenlong. Deze techniek kan eenvoudig worden aangepast om glycocalyx bepalen functie-specifiek, het vermogen van een intact ESL uitsluiten circulerende elementen van het endotheeloppervlak. We hebben onlangs deze technieken het belang van pulmonale ESL integriteit van de ontwikkeling van acute longbeschadiging te bepalen tijdens systemische ontstekingsziekten zoals sepsis 2.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Naam van de Reagens </td></tr><tr><td> FITC-dextran (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> FD150S </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-dextran (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> T1287 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidine beklede fluorescerende microbolletjes </td><td> Bangs Laboratories </td><td> CP01F/10428 </td><td> Dragon groene fluorescentie (vergelijkbaar met FITC) </td></tr><tr><td> Ketamine </td><td> Moore Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Moore Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-ICAM-1 antilichaam gebiotinyleerd </td><td> eBioscience </td><td> Clone YN1/1.7.4 </td><td> 1:50 verdunning </td></tr><tr><td> Gebiotinyleerd antilichaam isotype </td><td> eBioscience </td><td> IgG2b eB149/10H5 </td><td> 1:50 verdunning </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> APPARATUUR </td></tr><tr><td> Mechanische ventilator </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Inspira </td><td></td></tr><tr><td> Tracheostomie katheter </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 730028 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrocauterisatie apparatuur </td><td> DRE Medische </td><td> Valleylab SSE-2L </td><td></td></tr><tr><td> Bipolaire cauterisatie tang </td><td> Olsen Medical </td><td> 10-1200I </td><td> 9.9cm McPherson </td></tr><tr><td> Temperatuur control-systeem </td><td> Wereld Precisie-instrumenten </td><td> ATC1000 </td><td></td></tr><tr><td> Injectiepomp </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Pomp 11 Elite </td><td></td></tr><tr><td> Microscoop (groothoek) </td><td> Nikon </td><td> LV-150 </td><td></td></tr><tr><td> Microscoop (confocale) </td><td> Nikon </td><td> A1R </td><td></td></tr><tr><td> Afbeelding splitter </td><td> Lichttechniek </td><td> DV2 </td><td></td></tr><tr><td> CCD camera </td><td> Lichttechniek </td><td> CoolSNAP HQ2 </td><td></td></tr><tr><td> Software voor beeldverwerking </td><td> Nikon </td><td> NIS Elements </td><td></td></tr><tr><td> Polyvinylideenfluoride membraan </td><td> Kure Wrap </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Circulaire dekglas </td><td> Bellco </td><td> 5CIR-1-BEL </td><td> 5 mm, dikte # 1 </td></tr><tr><td> Lijm (cover slip te membraan) </td><td> Pattex </td><td> Flüssig (vloeibaar) </td><td> Voor het aanbrengen dekglas aan membraan </td></tr><tr><td> Lijm (cover slip de muis) </td><td> Pattex </td><td> Gel </td><td> Voor het bevestigen membraan muis </td></tr><tr><td> Chirurgische slang </td><td> Intramedic </td><td> PE50, PE10 </td><td></td></tr><tr><td> Hechten </td><td> Visser </td><td></td><td> 04:00 zijde </td></tr><tr><td> Elektrisch scheerapparaat </td><td> Oster </td><td> 78997 </td><td></td></tr><tr><td> Gebogen chirurgische pincet </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rechte chirurgische pincet </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische schaar </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische microscissors </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische naald driver </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische tape </td><td> Visser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Keuken sponzen (in stukjes gesneden) </td><td> divers </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo meting van de muis pulmonary endothelial oppervlaktelaag

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

De endotheliale glycocalyx is een laag van proteoglycanen en glycosaminoglycanen verbonden langs de vasculaire lumen. In vivo, de glycocalyx is sterk gehydrateerde, die een belangrijke endotheliale oppervlaktelaag (ESL) die bijdraagt ​​aan het behoud van de endotheelfunctie. Aangezien de endotheliale glycocalyx is vaak afwijkend in vitro en gaat verloren tijdens normale weefsel fixatie technieken, studie van de ESL vereist het gebruik van intravitale microscopie. Om zo goed mogelijk benadert de complexe fysiologie van de alveolaire microvasculatuur, wordt pulmonale intravitale beeldvorming idealiter uitgevoerd op een vrij bewegende long. Deze preparaten echter gewoonlijk lijden uitgebreide bewegingsartefacten. We zien hoe closed-chest intravitale microscopie van een vrij bewegende muizenlong kan worden gebruikt om glycocalyx integriteit meten via ESL uitsluiting van fluorescentie-gemerkt hoog molecuulgewicht dextranen van het endotheeloppervlak. Dit terminaal chirurgische techniek, die vereistgelijktijdige helderveld en fluorescerende beeldvorming van de muis long, zorgt voor een longitudinale observatie van de subpleural microvasculatuur zonder aanwijzingen voor het induceren van confounding longschade.

De experimentele benadering beschreven in de stappen 1-6 zal vangst van meerdere frames van gelijktijdige DIC (helderveld) en fluorescerende beelden. Om ESL dikte ervan, worden opnamen beoordeeld door een geblindeerde waarnemer na voltooiing van de experimentele protocol. Met een in-focus frame, subpleural microvaatjes (&lt;20 urn diameter) worden geïdentificeerd, tenminste 3 microvaatjes worden meestal op een frame (Figuur 10). Met beeldanalyse software (NIS Elements, Nikon) zijn vasculaire breedte gem...

De endotheliale glycocalyx / endotheliale oppervlaktelaag is ideaal bestudeerd met behulp van intravitale microscopie. Intravitale microscopie is technisch uitdagend in een bewegend orgaan zoals de longen. We zien hoe gelijktijdige helderveld en fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om endotheeloppervlak laagdikte schatten in een vrij bewegende<em&gt; In vivo</em&gt; Muis long.

In vivo meting van de muis Pulmonary Endothelial oppervlaktelaag

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de breedte van de endotheliale oppervlaktelaag (ESL) van de pulmonale microvasculatuur te meten door de uitsluiting van fluorescentie-gelabelde dextrinen met een hoog molecuulgewicht van het vaatoppervlak te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst intravitale DIC-microscopie uit te voeren om de endotheliale celmembranen van subpleurale microvaten in een bewegende muizenlong te identificeren. Vervolgens worden de muizen geïnjecteerd met een fluorescentie-gelabelde dextrine met een hoog molecuulgewicht, die door de anders onzichtbare endotheliale oppervlaktelaag van de vaatwand wordt uitgesloten.Vervolgens worden gelijktijdige DIC- en fluorescentiebeelden vastgelegd vanuit één enkel scherpgesteld frame, waardoor de vasculaire breedtes kunnen worden gemeten die respectievelijk inclusief en exclusief de dikte van de ESL zijn. Het verschil tussen de DIC- en fluorescentie vasculaire breedtes wordt gebruikt om de dikte van de subpleurale microvasculaire ESL af te leiden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals microparticle velocimetry, is dat deze nauwkeurig kan worden uitgevoerd in een bewe

in-vivo-measurement-of-the-mouse-pulmonary-endothelial-surface-layer

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een nieuwe veelzijdige methode voor het observeren van de microcirculatie wordt gepresenteerd. Het wordt beschouwd als geschikt voor waarneming op lange termijn, en voor de combinatie met pharmacophysiological of moleculaire biologische interventies.

In vivo micro-circulatie meting in de skeletspier door Intra-vitale Microscopie

Een<em&gt; In vivo</em&gt; Assay naar Blood Vessel Permeabiliteit Test

De geïsoleerde bloed geperfundeerd long bereiding maakt het mogelijk om microvaatje netwerken visualiseren op het longoppervlak. Hier beschrijven we een aanpak om de permeabiliteit van enkele bloedvaten in geïsoleerde longen te kwantificeren met behulp van real-time fluorescentie beeldvorming.

Kwantificeren Single microvessel permeabiliteit in Geïsoleerde-Blood geperfuseerde Rat Lung Voorbereiding

Het doel van dit protocol is om geautomatiseerde methoden te bieden om chronische longpathologieën te kwantificeren in een muismodel van COPD. Het protocol omvat het blootstellen van muizen aan sigarettenrook (CS), het meten van longfunctie, het opblazen van de longen en het gebruik van morfometrische methoden om emfyseem en kleine luchtwegremodellering bij muizen te meten.

Geautomatiseerde Meting van longemfyseem en Kleine luchtweg remodeling in sigarettenrook blootgesteld Muizen

Hier presenteren we een protocol om eenvoudig en betrouwbaar de longdruk-volumecurve bij muizen te meten, waaruit blijkt dat het voldoende gevoelig is om fenotyische parenchymveranderingen in twee veelvoorkomende longaandoeningen, pulmonaire fibrose en emfyseem, te detecteren. Deze metrische biedt een middel om de structurele veranderingen in de long te kwantificeren met de zich ontwikkelende pathologie.

Meting van de druk-volume curve in muizenlongen

We presenteren een protocol voor humane endotheliale pericyte-interacties in muizen te bestuderen onder toepassing van een variatie van de matrix gel plug angiogenese assay.

In vivo studie van humane endotheliale-pericyte Interaction Met behulp van de Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Veel visie-bedreigende oogbeschadigingen en/of ziekten worden geassocieerd met disfunctionele retinale microvessels. De meting van de retinale arteriole reacties is daarom belangrijk om te onderzoeken van de onderliggende pathofysiologische mechanismen. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor muis retinale arteriole isolatie en voorbereiding te beoordelen van de effecten van vasoactieve stoffen op vasculaire diameter.

Voorbereiding stappen voor meting van reactiviteit in muis retinale arteriolen Ex Vivo

Hier presenteren we een protocol voor immunofluorescentie kleuring om de endotheliale cellen van de muis aorta direct te observeren. Deze techniek is nuttig bij het bestuderen van het cellulaire en moleculaire fenotype van endotheel cellen in verschillende stromingspatronen en in de ontwikkeling van atherosclerose.

Met en gezichts immunofluorescentie kleuring om vasculaire endotheel cellen direct te observeren

In dit artikel werden primaire longendotheelcellen geïsoleerd en gekweekt uit neonatale muizen.

Isolatie van primaire longendotheelcellen van muizen

In dit protocol werd de endotheelbarrièrefunctie van de submandibulaire klier (SMG) geëvalueerd door verschillende moleculair gewogen fluorescerende tracers in vivo in de hoekaders van proefdiermodellen te injecteren onder een laserscanmicroscoop met twee fotonen.

In vivo Vasculaire permeabiliteitsdetectie bij submandibulaire klier van muizen

Hier beschrijven we een eenvoudig en economisch protocol om onbevooroordeelde kwantificering van de pulmonale microvasculaire dichtheid voor longweefsel van hele muizen uit te voeren met behulp van enkelvoudige kleuring van isolectine B4.

Kwantificering van pulmonale microvasculaire dichtheid bij muizen over lobben

Leer de dikte van de endotheliale oppervlaktelaag meten in de longmicrovasculatuur van muizen met behulp van intravitale microscopie. Deze techniek maakt nauwkeurige metingen mogelijk in bewegende organen.

In vivo meting van de muis Pulmonary Endothelial oppervlaktelaag

Meer video's verkennen