Onderzoek van Macrophage Polarisatie behulp beenmerg afgeleide Macrofagen
23 juni 2013
Het artikel beschrijft een gemakkelijk gemakkelijk adaptieve In vitro Model om macrofaag polarisatie te onderzoeken. In aanwezigheid van GM-CSF/M-CSF worden hematopoietische stam / progenitorcellen uit het beenmerg gericht in monocytische differentiatie, gevolgd door M1 of M2 stimulatie. De activatie status kan worden gevolgd door veranderingen in celoppervlakteantigenen, genexpressie en signaaltransductie wegen.
Om beenmerg afgeleide macrofagen te genereren voor polarisatieanalyse. Femur en tibia botten worden geïsoleerd uit muizen en de beenmergcellen worden verzameld. De cellen worden vervolgens gekweekt in medium dat groeifactoren bevat om macrofaagvorming te induceren.
Na zeven dagen van cultuur worden de beenmerg afgeleide macrofagen behandeld met verschillende stimuli en gepolariseerde macrofaag. Activeringsreacties worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie real-time PCR en western blos analyse resultaten worden verkregen die een hoge zuiverheid van beenmerg afgeleide macrofagen met gepolariseerde activeringsreacties op M1 of M twee tonen. Stimuli liggen.
De implicatie van deze techniek is bedoeld voor therapie of diagnose van diversiteit geassocieerde ziekten, inclusief insulineresistentie en de CRO's omdat T-infiltrerende macrofagen een belangrijke speler zijn in deze context, visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat versnelling van beenmergcellen enigszins moeilijk is en de opbrengst cruciaal is voor het verkrijgen van voldoende studiecelpreparatie voor het induceren van macrofaagvorming. Werk in een steriele kap. Begin dit protocol met femur en tibia botten geïsoleerd van zes tot acht weken oude muizen in een weefselkweekschaal. Spoel de botten af in PBS en gebruik vervolgens een schaar om beide uiteinden van de botten open te snijden, zorg ervoor dat u niet te veel verwijdert terwijl u de bot met een pincet vasthoudt.
Plaats een 21 of 23 gauge naald met een 10 milliliter spuit bevattende koude PBS met 2% verwarmd geactiveerd FBS in een uiteinde van het bot. Druk op de zuiger om het beenmerg uit te spoelen in een nieuwe weefselkweekschaal. Breng vervolgens het beenmerg vier tot zes keer door dezelfde naald om de cellen te dissociëren.
Giet vervolgens de cellen in een 70 micron celzeef om celklonten, bot, haar en andere cellen of weefsels te verwijderen. Verzamel de doorstroming in een 50 milliliter conische buis. Zodra de oplossing door de filter is gegaan, voegt u drie volumes van 0,8% ammoniumchloride toe aan de doorstroming en incubeert u deze gedurende 10 minuten op ijs.
Om rode bloedcellen te verwijderen na de incubatie, centrifugeer de cellen 500 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na het centrifugeren, suspendeert u de cellenpellet opnieuw in 20 tot 50 milliliter koud PBS met 2% FBS. Tel de cellen met behulp van een hemo cytometer.
Centrifugeer de cellen 500 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na het afgieten van de supinate. Ga verder met het induceren van BMDM-vorming zoals beschreven in de volgende sectie van het protocol. Om BMDM-vorming te induceren Resus, suspendeer de geïsoleerde beenmergcellen in BMDM-groeimedium bij een concentratie van twee keer.
Centrifugeer zes cellen per milliliter in een twee keer 10 tot de zes cellen in elke put van een zes of 12 wel weefselkweekplaat en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius. Het zaaien bij deze concentratie zal de loslating voor flowcytometrie na drie dagen vergemakkelijken. Ververs op dag zeven naar vers BMDM-groeimedium.
Vorming van volwassen BMDM wordt geëvalueerd met behulp van flowcytometrieanalyse en fluoresceïne geconjugeerde antilichamen om cellen te detecteren die CD 11 B en F vier 80 tonen. Na verificatie van de vorming van volwassen BMDM, verandert u naar vers is cove's gemodificeerd do echo's medium met 10% FBS en LPS of LPS en interferon gamma voor M1 activering of IL vier of IL 13 voor M twee activering. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius na 24 uur.
Verzamel de gestimuleerde b MDM's door ze los te maken van de schotel. Om dit te doen, verwijdert u het medium van de cellen en spoelt u met PBS zonder calcium of magnesium. Voeg vervolgens warm 0,05% trypsine toe dat 0,48 millimolar bevat, EDTA en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende maximaal 10 minuten om verlies van oppervlakteproteïnen door over-vertering te voorkomen.
Was vervolgens de cellen twee keer met PBS bevattende 10% FBS en breng ze over naar 1,2 milliliter monsterbuisjes. Gebruik antilichamen om expressie van celoppervlakteantigenen te detecteren, inclusief CD 11 BF vier 80, CD 11 C, CD 2 0 6, CD 69, CD 80 of CD 86 op verschillende tijdstippen. Gebruik standaard flowcytometriekleuringsprocedures met kwantitatieve PCR.
Bepaal de expressieniveaus van IL een bèta TNF alfa en IL zes om M1 activering of IL 10 IL 13, arginase een en PPAR gamma te beoordelen om M twee activering te beoordelen. Voer ten slotte western blotting uit om activering van celsignaleringsroutes betrokken bij activering van M1 of M twee macrofagen te beoordelen om de zuiverheid van volwassen BMDM te beoordelen. Na inductie werd flowcytometrische analyse uitgevoerd met behulp van antilichamen tegen CD 11 BF vier 80, CD 11 C en CD 2 0 6 B.MDM's werden eerst gefilterd op FSC en SSC om DRI en conjugaten te verwijderen.
Volwassen b MDM's werden gedefinieerd als CD 11 B positieve F vier 80 positieve subpopulaties, die in de bovenste rechterkant van deze plot te zien zijn en 95 tot 99% van de gefilterde populatie om macrofaagpolarisatie te beoordelen. Verdere analyse werd uitgevoerd. Eerst werd filtering uitgevoerd om weefselinfiltrerende macrofagen te identificeren, wat CD 11 B positieve F vier 80 positieve cellen zijn.
Onder die M1-macrofagen, die CD 11 C positief en CD 2 0 6 negatief zijn, verschijnen in kwadrant twee, terwijl M twee macrofagen, die CD 11 C negatief en CD 2 0 6 positief zijn, in kwadrant vier verschijnen. Om macrofaagactivering te beoordelen, werden cellen geïncubeerd met LPS om M1 activering te induceren of IL vier voor M twee activering. Na activering nam de grootte van macrofagen toe, zoals blijkt uit de verschuiving van FSCA van M1 of M twee macrofagen 24 uur na stimulatie in vergelijking met M nul onbehandeld.
Macrofaagactivering gerelateerde oppervlaktemarkers werden ook geanalyseerd na stimulatie. De vroege reagerende marker CD
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een adaptief in vitro-model voor het onderzoeken van macrofaagpolarisatie. Hematopoëtische stam-/progenitorcellen uit muizenmerg worden gedifferentieerd tot macrofagen en gestimuleerd om te polariseren naar M1- of M2-fenotypes.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Macrofaagpolarisatie is cruciaal voor het begrijpen van immuunresponsen.
- Verschillende stimuli kunnen M1- of M2-polarisatie induceren.
- Flowcytometrie en PCR zijn gangbare methoden voor het analyseren van macrofaagactivatie.
- Deze studie maakt gebruik van uit het beenmerg afgeleide macrofagen voor experimentele analyse.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een model voor het bestuderen van macrofaagpolarisatie.
- Het analyseren van de effecten van verschillende stimuli op de activatie van macrofagen.
- Het volgen van veranderingen in celoppervlakantigenen en genexpressie.
Gebruikte methoden
- Isolatie van femur- en tibiahandbeenderen van muizen.
- Verzameling en cultuur van beenmergcellen met groeifactoren.
- Polarisatie van macrofagen met behulp van diverse stimuli.
- Analyse van activatieresponsen via flowcytometrie en real-time PCR.
Belangrijkste resultaten
- Er werd een hoge zuiverheid van uit beenmerg afgeleide macrofagen bereikt.
- Gepolariseerde macrofagen vertoonden verschillende activatieresponsen.
- Flowcytometrie en PCR bevestigden de succesvolle polarisatie.
- De resultaten geven inzicht in de functionele toestanden van macrofagen.
Conclusies
- Het ontwikkelde model is effectief voor het bestuderen van macrofaagpolarisatie.
- Verschillende stimuli leiden tot onderscheidende M1- en M2-activatieprofielen.
- Dit onderzoek vergroot het begrip van de biologie van macrofagen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Macrofage-polarisatiemodellen met gebruik van uit het beenmerg afgeleide macrofagen (BMDMs) bieden een robuust platform voor het onderzoeken van de immuuncelfunctie en padmodulatie in de vroege ontdekkingsfase. Kwantitatieve beoordeling van de polarisatiestaten maakt mechanische risicoanalyse mogelijk en ondersteunt het voorspellend vertrouwen in targetvalidatie voor immunologie- en inflammatieportfolio's. Dit systeem faciliteert translationele continuïteit van in vitro ontdekking naar preklinische ziektemodellen waarbij macrofage-fenotypes betrokken zijn.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt functionele validatie van immuuntargets mogelijk door M1/M2-polarisatierespons te kwantificeren.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie via pathway-specifieke stimulatie en read-outs.
- Faciliteert hypothese-testen over de betrokkenheid van genen of pathways bij macrofaagactivatie.
- Biedt een gecontroleerd systeem voor het ontleden van immuuncelsignalering en effectorfuncties.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare BMDM-preparaten voor downstream screening-workflows.
- Maakt kwantitatieve flowcytometrie en PCR-gebaseerde read-outs mogelijk voor assay-ontwikkeling.
- Ondersteunt een robuuste evaluatie van de effecten van verbindingen of genetische perturbaties op macrofaagtoestanden.
- Maakt schaalbare preparatie en consistente fenotypische resultaten over verschillende experimenten mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro polarisatiestaten uit elkaar met ziekterelevante macrofaagfenotypes die in vivo worden waargenomen.
- Maakt de ontdekking van biomarkers mogelijk door oppervlakteantigeen- en genexpressieprofielen te koppelen aan functionele uitkomsten.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van immunomodulerende strategieën naar preklinische modellen.
- Biedt mechanistisch inzicht in door macrofagen gedreven pathologie voor translationeel onderzoek.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze workflow voor BMDM-polarisatie slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek door hypothesegedreven onderzoek naar immuunmechanismen en doelwitvalidatie mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt het testen van nulhypothesen over gen- of pathwayfuncties bij macrophage-activatie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor compound- of genetische screening.
- Analytics: Levert flowcytometrie-, qPCR- en western blot-gegevens voor vergelijkende analyse van polarisatietoestanden.
- Translationeel Onderzoek: Faciliteert de afstemming van in vitro bevindingen met ziekte-relevante macrophage-fenotypes.
- Herbruik binnen de organisatie: Biedt een gestandaardiseerd, aanpasbaar platform voor functionele studies naar immuuncellen over verschillende programma's heen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij de validatie van immuuntargets en pathway-analyse.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van macrofaag-assays voor gebruik door verschillende teams.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door vroeg in de pipeline robuuste mechanistische gegevens te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van activa op het gebied van immunologie en inflammatie mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de isolatie, kweek en immunofenotypering van primaire cellen.
- Toegang tot flowcytometrie, qPCR en western blot instrumentatie is noodzakelijk.
- Strikte standaardisatie van celpreparatie- en stimuleringsprotocollen tussen teams is vereist.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor verschillende muizenstammen of ziektemodellen.
- De opbrengst en zuiverheid van BMDMs zijn cruciaal voor betrouwbare downstream analyses.
