Microfluïdische chip fabricage en methode om Influenza Detect

Het algemene doel van het volgende experiment is het detecteren van het influenza A-virus met behulp van een microfluïdische chip. Leid eerst het monster met lysisbuffer door het SPE-kanaal om het virus te lyseren en RNA te extraheren; vul het R-T-P-C-R-reagens met het geëxtraheerde RNA en activeer het reverse transcriptie-kanaal om viraal RNA om te zetten in cDNA. Leid vervolgens het mengsel naar het PCR-kanaal om het DNA te amplificeren; de resultaten die worden verkregen tonen de grootte en concentratie van het amplicon op basis van het fluorescentiesignaal van capillaire elektroforese.

Het belangrijkste voordeel van deze technologie is dat het ruwe patiëntmonsters accepteert en nucleïnezuurextractie, zuivering, reverse transcriptie en amplificatie integreert in één enkele chip. Om twee plaques te maken, verdeelt u ongeveer 9 g XN X-pellets gelijkmatig in het midden van een metalen plaat en plaatst u deze vijf minuten lang in een pers die is voorverwarmd tot 198 °C. Breng vervolgens langzaam een druk van 2.500 PSI aan gedurende nog eens vijf minuten. Positioneer nu één plaque op de epoxyvorm, voorverwarm deze 10 minuten lang op 157 °C en breng langzaam een druk van 1000 PSI aan gedurende nog eens 10 minuten.

Verwijder vervolgens, met hittebestendige handschoenen, de plaat en de mal uit de warmtepers, en haal de plaat uit de mal voordat deze afkoelt. Boor drie gaten in de reliëfchip, telkens één bij de inlaat, de afvalpoort en de uitlaat van het microfluïdische kanaal. Was de chips vervolgens met IPA, gevolgd door RNAs away en dianna's water.

Droog de chips met lucht. Om de chips te hechten, worden ze eerst 10 minuten voorverwarmd op 131 °C, waarna ze nog 10 minuten onder een druk van 350 PSI worden geperst. Bevestig met JB Weld Epoxy de nanopoorten afzonderlijk aan de inlaat- afvoerpoorten en de uitlaatpoorten en laat deze 15 tot 24 uur uitharden. Spoel het SPE-kanaal, overeenkomstig de instructies van de fabrikant, met 50 µL RNAs away, gevolgd door 100 µL nucleasevrij water.

Laad nu het SPE-kanaal met vier µL vers bereide entoplossing om het methacrylaat te crosslinken, incubeer gedurende 10 minuten in een UV-oven en verwijder de resterende entoplossing met een vacuüm. Breek het gedroogde microsfeerpellet op door op de buis te tikken terwijl het deksel gesloten is. Voeg vervolgens 100 µL vers bereide SPE-kolomoplossing toe en vortex om te mengen.

Breng vier µL van de SPE-oplossing aan in hetzelfde kanaal en crosslink deze door UV-bestraling gedurende 2,5 minuten aan elke zijde, wat resulteert in een ondoorzichtige witte gepolymeriseerde SPE-kolom. Was het kanaal met 500 µL 100% methanol om overtollige reactanten en intra-polymeer pyrogene oplosmiddelen weg te spoelen. Bevestig twee dunne-filmverwarmers aan de onderkant van de chip met thermisch geleidende tape.

Let op dat de zijkanten van de verwarmers moeten worden uitgelijnd met de rand van de brede kanalen voor de duur van Dene en een knielend apart, plaats vijf thermokoppels in de chip via de doodlopende open zijkanalen van elke chiptape. Om de positie van de thermokoppels te fixeren, voegt u vier microliters van 25 XRNA secure toe aan 96 microliters 70% ethanol in één buis, en aan 100% ethanol in een tweede buis. Bereid daarnaast 300 microliters kanaalbuffer en 316 microliters lysisbuffer voor.

Verwarm de oplossingen 15 minuten lang bij 60 °C. Dit dient om het RNA secure te activeren en vervolgens het microfluïdische kanaal te equilibreren. Laat de kanaalbuffer door het SPE-kanaal stromen met een stroomsnelheid van 0,8 ml per uur.

Nu een snel fava-testmonster in VTM bij 37 °C. Verwijder het monster zodra het is ontdooid. Centrifugeer het monster bij 13.000 RPM gedurende 10 minuten.

Overbreng 100 µL van het supernatant naar 300 µL van de lysisbuffer en voeg zes µL toe van een 1 µg/µL carrier-RNA; meng dit door te vortexen. Centrifugeer vervolgens vijf seconden en breng het volledige lysaat over in een Luer-Lock spuit van 1 CC. Leid het lysaat door het SPE-kanaal met een stroomsnelheid van 0,8 mL/uur.

Was daarna het SPE-kanaal met 100 µL 70% ethanol, gevolgd door 100 µL 100% ethanol met een stroomsnelheid van 1 mL/uur. Plaats een lege spuit bij de 0,5 mL markering en pers lucht door het kanaal om het te drogen bij 1 mL/uur. Laat nu 67,5 µL nucleasevrij water door het kanaal stromen om de gebonden nucleïnezuren te elueren bij 0,5 mL/uur en verzamel 13,5 µL via de nanopoort bij de afvalpoort.

Laad 36,5 µL van de RT-PCR mastermix. Meng dit in de nanopoort bij de afvalpoort en meng het met het template RNA voor een RT-PCR reactie van 50 µL. Laad vervolgens het RT-PCR mengsel via een zacht vacuüm in het RT-kanaal.

Sluit de nanopoort af met een gesloten koppeling. Breng 35 volt aan op verwarmingsstroom één. Houd de reagentia 30 minuten in het RT-kanaal nadat verwarmingsstroom één is geëquilibreerd op 50 °C.

Houd de reagentia 15 minuten in het RT-kanaal nadat verwarmer één is geëquilibreerd op 95 °C. Breng vervolgens 27 volt aan op verwarmer één en 50 volt op verwarmer twee om verwarmer één te equilibreren op 60 °C en verwarmer twee op 95 °C. Voer de reagentia het PCR-kanaal in met een snelheid van 0,5 µL per minuut.

Ongeveer 20 minuten later, wanneer de reagentia het einde van het slangvormige kanaal naderen, verzamelt u de PCR-producten bij de uitlaat met een pipet en tip van passende grootte voor de Agilent high sensitivity DNA-test. Haal de Agilent high sensitivity DNA-kit 30 minuten voor de test uit de koelkast. Zet de bioanalyzer aan en open de 2, 100 expert software.

Laad één µL van de PCR-producten voor de test en volg het Agilent-protocol. Analyseer en registreer de gegevens in deze workflow. Het nasofaryngeale monster van de patiënt wordt gemengd met lysisbuffer en op de chip aangebracht.

De chip wordt uitgevoerd en de PCR-producten van het influenzavirus worden uitgelezen met behulp van een commerciële capillaire elektroforese-chip. Vanwege de verschillende hoeveelheden influenzavirus in het monster van elke patiënt zal de uiteindelijke concentratie van het PCR-product variëren. Een goed resultaat moet een lage ruis hebben met duidelijke ladderpieken bij 35 en 10, 380 base pair en een enkele productpiek bij de ontworpen productgrootte van 107 base pair voor het positieve monster.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de microfluïdische chip moet vervaardigen en gebruiken om het influenzavirus te detecteren.