Name: Vorming van menselijke prostaat epitheel behulp Tissue recombinatie van knaagdieren Urogenital Sinus Mesenchym en menselijke stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Leer hoe u urogenitaal sinus mesenchym isoleert uit knaagdierembryo's om menselijk prostaatepitheel te vormen met pluripotente stamcellen. Deze weefselrecombinatiemethode biedt inzicht in prostaatkankerontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen de steun van de Universiteit van Chicago Sectie Van Urologie geleid door Dr Arieh Shalhav, en de directeur van Urologic Research Dr Carrie Rinker-Schaeffer erkennen. We willen ook graag de steun van de Universiteit van Chicago Comprehensive Cancer Center (UCCCC) onder leiding van dr. Michelle Le Beau erkennen. We hebben ook met dank aan deskundige technische bijstand van de Human Tissue Resource Center kern faciliteit onder leiding van dr. Mark Lingen, en de hulp van Leslie Martin en Mary Jo Fekete. We danken ook de Immunohistochemistry Core Facility gerund door Terri Li. Dit werk werd gefinancierd door de Universiteit van Chicago afdeling Heelkunde, de afdeling Urologie, een American Cancer Society Institutional Research Grant (ACS-IRG, # IRG-58-004), een Cancer Center Ondersteuning Grant (P30 CA14599); De Brinson stichting, de Alvin Baum Family Fund, The University of Chicago Board Cancer Research Foundation Vrouwen; S. Kregel wordt ondersteund door een HHMI: Med-in-Grad Fellowsheup (56006772) en een Kankerbiologie Training Grant (T32-CA09594). Tot slot willen we Robert Clark, Dr VenkateshKrishnan, en Nathan Stadick bedanken voor hun kritische beoordeling van het manuscript.

Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health uitgevoerd. Het protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Chicago Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC, protocol nummers 72066 en 72231). Alle operatie werd uitgevoerd onder verdoving, en alle pogingen werden gedaan lijden te bekorten. De menselijke embryonale stamcellen lijn WA01 (H1; NIH-registratie # 0043) werd overgenomen van WiCell (Madison, WI) en gekweekt met behulp van de feeder-onafhankelijk protocol met behulp mTeSR1 media (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC). ES-cellen werden binnen tien passages van ontdooien gebruikt. 1. Isolatie van de urogenitale sinus van Muis of Rat embryo <ol><li> Euthanize een time-zwangere muis (van 17.5) of ratten (dag 18.5) door inademing van CO2 gedurende 5 minuten. Dood wordt bevestigd door het stilleggen van vitale functies in de rat. Dan breekt haar nek humane manier. De rbij wordt geëuthanaseerd op dit punt. Spuit 70% ethanol aan de buikhuid en flanken steriliseren. Snijd de buikhuid en spieren lagen en snijd de baarmoeder, scheid de rat embryo&#39;s uit de vruchtzak, en knipte de navelstreng. Overdracht van de embryo&#39;s in een 50 ml Falcon buis met ijskoude Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) en blijf op ijs. Foetussen worden gedood door onthoofding met chirurgische schaar. </li><li> Plaats het embryo in 100 mm petrischaal. Halveren de embryo met een schaar op het niveau van de umbilicus (Figuur 1A). Verwijder de maag en dunne darm. Onthul de eierstokken in de vrouwelijke embryo en testis in de mannelijke embryo (Figuur 1B en 1C). (De eierstokken zijn bij de caudale polen van de nieren. De testes ongeveer ter hoogte van de blaas). In dit ontwikkelingsstadium, geïsoleerd UGSM zowel mannelijke als vrouwelijke embryo kunnen induceren een prostaat epitheliale lijn in aanwezigheid van gastheertestosteron. 4 Na deze ontwikkelingsstoornis tijdstip echter prostaat knoppen beginnen vormen in de UGSM, en isolatie van zuivere UGSM is zeer uitdagend. 4 </li><li> Onder de dissectie microscoop, snijd de buikwand in de middelste lijn met Vannas schaar om de blaas en de achterste wand van de buik bloot. Gratis de bovenste geslachtsorganen van bijlagen (in mannelijke embryo&#39;s, snijd de urineleider, Wolffian duct en Müllerian koker; bij vrouwelijke embryo&#39;s, snijd de urineleider en Müllerian duct). Bevrijd de blaas uit de navelstreng. Knip schaambeen en botweg gescheiden van de voorste wand van de urogenitale sinus met Dumont fijne punt pincet. Tenslotte, scheid de achterwand van de urogenitale sinus uit het rectum. Snijd de urogenitale sinus de blaas aan het ondereinde (de urethra) en bewaar de urogenitale sinus en bloc (de blaas) in ijskoud HBSS. </li></ol> 2. Scheiding van de urogenitale sinus Mesenchym <ol><li&gt; Verwijder de blaas uit de urogenitale sinus onder de dissectie microscoop (figuur 1D). </li><li> Breng de urogenitale sinus een falcon buis met 1% trypsine in Calcium (Ca 2 +) en magnesium (Mg 2 +) gratis HBSS. Plaats de buis in een koelkast bij 4 ° C gedurende 75 minuten. </li><li> Verwijder de trypsine en trypsine te neutraliseren met 10% foetaal Bovin Serum (FBS) in DMEM/F12-medium. </li><li> Plagen de kleverige mesenchymale huls voorzichtig uit de epitheliale buis met een naald of Dumont fijne punt pincet (het handhaven van de epitheliale tube intact vermindert de kans op epitheliale cellen verontreiniging van het mesenchym, dit kan resulteren in een knaagdier klieren vormen samen met uw stamcellen afgeleide humane klier-epitheel) (figuur 1D). 12 </li><li> Breng UGSM in een nieuwe Falcon-buis met DMEM/F12 medium + 10% FBS + 1% penicilline / streptomycine (pen / strep, 0,5 mg / ml) + 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA) plus 1 nM R1881. Place de buis in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende de nacht. </li><li> Centrifugeer het weefsel bij 200 xg en gooi het supernatant. Wassen met fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) (niet storen het weefsel pellet). </li><li> Voeg 0,2% collagenase (in DMEM/F12) opnieuw te schorten het weefsel. Incubeer bij 37 ° C onder zacht schudden gedurende 1 uur. </li><li> Krachtig vortex de spijsvertering weefsel drie keer totdat het homogeen eencellige mengsel en voeg DMEM/F12-medium + 10% FBS + 1% P / S + 1% NEAA + 1 nM R1881 aan de collagenase neutraliseren. </li><li> Centrifugeer bij 200 xg en daarna wassen door opnieuw schorsing van de UGSM cellen in HBSS, en herhaal dit drie keer om de UGSM volledig wassen. Tenslotte schorsen mesenchymale cellen in DMEM/F12 en tel de cellen met een hemocytometer of mobiele telinrichting. </li><li> Distantiëren hES cellen gekweekt met behulp van feeder-free protocol met mTeSR1 media (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) met behulp van een Accutase spijsvertering (Millipore, Billerica, MA). Was de hES cellenin de log fase van de groei in warme DMEM/F12 media, voeg warm 1x Accutase oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 15-20 min tot enkelvoudige cellen gedissocieerd zijn uniform van kolonies. Voeg een gelijke hoeveelheid 1x gedefinieerde trypsine-remmer (Invitrogen, Grand Island, NY) om de Accutase neutraliseren en voorzichtig pipet op en neer om te mixen en breken celklonten. Pipetteer cellen in een centrifugebuis en centrifugeer gedurende 3 min bij 200 xg en resuspendeer celpellet in DMEM/F12 media. Centrifugebuis gedurende 3 min bij 200 weer xg en verwijder het supernatant, vervolgens opnieuw te schorten in koud HBSS of DMEM/F12 op gewenste volume. </li><li> Voeg hES cellen met 1:2,5 verhouding van HES / mesenchymale cellen. 3 Dit zal een cellulaire samenstelling van 1E 5 UGSM cellen met 4E 4 hESCs per 10 ml injectie (een enkele rat UGS meestal levert ongeveer 2E 6 mesenchymale cellen) zijn. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten en dan gooi het supernatant. Re-schorten met 75% Matrigel (BD Biosciences,San Jose, CA, gemengd met 25% koud HBSS een eenvoudige bediening) en plaats de buis in ijs voor sub-renale capsule injectie. </li></ol> 3. Transplantatie van weefsel Recombinant Onder de Nier Capsule <ol><li> Bereid een steriel chirurgisch gebied. </li><li> Verdoven een mannelijke athymische naakt muis met ketamine / xylazine ip; gebruik een frisse mix met een 01:01:08 verhouding van ketamine: xylazine: zoutoplossing. Dosering wordt 100 mg / kg ketamine en 2,5 mg / kg xylazine zijn. Dieren die niet reageren op een teen-snuifje moet volledig onder gedurende 20-30 minuten. </li><li> Chirurgisch voorbereiding van de muis door het scheren van de operatiewond (indien niet met behulp van een naakt muis), reiniging met drie afwisselende doekjes van 70% alcohol, gevolgd door betadine oplossing en het toepassen van een chirurgische doek. </li><li> Zet eye vocht zalf (Altalube oogzalf) voor de ogen van de muis drogen tijdens de anesthesie te voorkomen. </li><li> Tijdens de operatie, zijn ademhaling en de lichaamstemperatuur van de muizen gecontroleerd. De ademhaling shoULD zijn stabiel en gehandhaafd binnen 40-90 ademhalingen / min. Kerntemperatuur van het lichaam wordt bewaakt met waarneming van de kleur van de slijmvliezen en de roze voetzolen. </li><li> Maak een 1.0 cm lang longitudinale incisie in de huid op de rug. Blijf de buikwand in een 0,5 cm longitudinale incisie te snijden. </li><li> Knijp voorzichtig in de nieren uit de buik en houden de nieren oppervlak vochtig met druppels steriele zoutoplossing. </li><li> Voorzichtig doorboren de nier capsule met behulp van een lege 27-gauge naald. Een zeer ondiepe punctie voldoende is. Dit zal zijn waar je je botte naald om uw mobiele mengsel moet inspuiten. </li><li> Vul een 28-gauge stompe naald met 10 ul van uw mobiele mengsel. Langzaam steek de prikplaats en dringen de nierparenchym om een ​​gebied onder de renale capsule bereiken. Injecteer 10 ul van de cellulaire mengsel bolus op de nier onder de renale capsule vormen. Terugtrekking van de naald. </li><li> De terugkeer van de nier naar de abdominal holte. Beveilig de spierlaag van het buikvlies met 4-0 nylon hechtingen. </li><li> Sluit de huid met ofwel hechtingen of nietjes. </li><li> Schoon bloed uit de huid met behulp van een steriele zoutoplossing. </li></ol> 4. Post-operatieve analgesie en Monitoring <ol><li> Injecteer het dier met buprenorfine (0,1 mg / kg elke 12 uur) en ketoprofen (3-5 mg / kg in zoutoplossing elke 12 uur) tot post-operatieve pijn, en 1 ml van 37 ° C zoutoplossing ip het dier warm beheerder en uitdroging te voorkomen. </li><li> Zet het dier in een schone kooi en plaats deze op een milde verwarming pad. </li><li> Sturen de dieren terug naar dierlijke kamer zodra ze weer bij bewustzijn en bewegen binnen de kooi. </li><li> Observeer de dieren dagelijks voor onverwachte tekenen van ziekte en besmetting voor de volgende drie dagen. De muizen worden bewaakt met observatie van de activiteiten in kooien, waaronder toegang te verschaffen tot voedsel en water 1 dag postoperatief. Als de muizen weer minder activiteiten, Ketoprofen is intraperitoneaal advertentieopnieuw diende een keer per dag. </li><li> Verwijder de nietjes of hechtingen 2 weken na de operatie huid. </li><li> Xenograft weefsels kunnen worden geoogst Reeds 8 weken na de operatie. Xenotransplantaten kunnen worden afgebeeld in vivo gebruik van kleine dieren ultrasound (Figuur 2A), en vaste weefsels secties en gekleurd voor verschillende eiwitten middels immunohistochemie (figuur 3) zijn. </li></ol>

<ol><li>Taylor, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+human+prostate+tissue+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Formation of human prostate tissue from embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 179-181 (2006).</li>
<li>Cunha, G. R., Chung, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> J. Steroid Biochem. 14, 1317-1324 (1981).</li>
<li>Cunha, G. R., Chung, L. W., Shannon, J. M., Taguchi, O., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone-induced+morphogenesis+and+growth%3A+role+of+mesenchymal-epithelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Prog.+Horm.+Res%22%5BJournal%5D)">Hormone-induced morphogenesis and growth: role of mesenchymal-epithelial interactions.</a> Recent Prog. Horm. Res. 39, 559-598 (1983).</li>
<li>Staack, A., Donjacour, A. A., Brody, J., Cunha, G. R., Carroll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+urogenital+development%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Mouse urogenital development: a practical approach.</a> Differentiation. 71, 402-413 (2003).</li>
<li>Cunha, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+abnormal+development+of+the+male+urogenital+tract.+Role+of+androgens%2C+mesenchymal-epithelial+interactions%2C+and+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Normal and abnormal development of the male urogenital tract. Role of androgens, mesenchymal-epithelial interactions, and growth factors.</a> J. Androl. 13, 465-475 (1992).</li>
<li>Cunha, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+as+mediators+of+androgen+action+during+the+development+of+the+male+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Growth factors as mediators of androgen action during the development of the male urogenital tract.</a> World J. Urol. 13, 264-276 (1995).</li>
<li>Aboseif, S., El-Sakka, A., Young, P., Cunha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+reprogramming+of+adult+human+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal reprogramming of adult human epithelial differentiation.</a> Differentiation. 65, 113-118 (1999).</li>
<li>Marker, P. C., Donjacour, A. A., Dahiya, R., Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+control+of+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development.</a> Dev. Biol. 253, 165-174 (2003).</li>
<li>Cunha, G. R., Sekkingstad, M., Meloy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterospecific+induction+of+prostatic+development+in+tissue+recombinants+prepared+with+mouse%2C+rat%2C+rabbit+and+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Heterospecific induction of prostatic development in tissue recombinants prepared with mouse, rat, rabbit and human tissues.</a> Differentiation. 24, 174-180 (1983).</li>
<li>Van der Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+CD133+in+Normal+Human+Prostate+Stem+Cells+and+Malignant+Cancer+Initiating+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The Role of CD133 in Normal Human Prostate Stem Cells and Malignant Cancer Initiating Cells.</a> Cancer Res. 68, 9703-9711 (2008).</li>
<li>Van der Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-label+centromere+and+telomere+FISH+identifies+human%2C+rat%2C+and+mouse+cell+contribution+to+Multispecies+recombinant+urogenital+sinus+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts.</a> Prostate. , (2009).</li>
<li>Vander Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-label+centromere+and+telomere+FISH+identifies+human%2C+rat%2C+and+mouse+cell+contribution+to+Multispecies+recombinant+urogenital+sinus+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts.</a> Prostate. 69, 1557-1564 (2009).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-independent+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 637-646 (2006).</li>
<li>Prokhorova, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells+is+site+dependent+and+enhanced+by+the+presence+of+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel.</a> Stem Cells Dev. 18, 47-54 (2009).</li>
<li>Hameed, O., Sublett, J., Humphrey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+stains+for+p63+and+alpha-methylacyl-CoA+racemase%2C+versus+a+cocktail+comprising+both%2C+in+the+diagnosis+of+prostatic+carcinoma%3A+a+comparison+of+the+immunohistochemical+staining+of+430+foci+in+radical+prostatectomy+and+needle+biopsy+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical stains for p63 and alpha-methylacyl-CoA racemase, versus a cocktail comprising both, in the diagnosis of prostatic carcinoma: a comparison of the immunohistochemical staining of 430 foci in radical prostatectomy and needle biopsy tissues.</a> Am. J. Surg. Pathol. 29, 579-587 (2005).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+prostatic+epithelial+model+of+hormonal+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis.</a> Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).</li>
<li>Yao, V., Parwani, A., Maier, C., Heston, W. D., Bacich, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+expression+of+prostate-specific+membrane+antigen%2C+a+tissue+differentiation+antigen+and+folate+hydrolase%2C+facilitates+prostate+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Moderate expression of prostate-specific membrane antigen, a tissue differentiation antigen and folate hydrolase, facilitates prostate carcinogenesis.</a> Cancer Res. 68, 9070-9077 (2008).</li>
<li>Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+stromal-epithelial+interactions+in+hormonal+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Histol.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 417-434 (2004).</li>
<li>Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+regeneration+of+murine+prostate+from+dissociated+cell+populations+of+postnatal+epithelia+and+urogenital+sinus+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, Suppl 1. 11896-11903 (2003).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Mol. Ther. 7, 827-838 (2003).</li>
<li>Anderson, J. S., Bandi, S., Kaufman, D. S., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+normal+macrophages+from+human+embryonic+stem+%28hES%29+cells+for+applications+in+HIV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Derivation of normal macrophages from human embryonic stem (hES) cells for applications in HIV gene therapy.</a> Retrovirology. 3, 24(2006).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 340-345 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten met het gepresenteerde werk.

Tissue recombinatie met UGSM een ongelooflijk handige techniek om de ontwikkeling van de prostaat en de moleculaire gebeurtenissen die leiden tot prostaatkanker initiatie onderzoeken. De inductieve potentieel van UGSM is gebruikt voor talrijke toepassingen in prostate onderzoek, onder meer verbetering tumor nemen prostaat cellijnen en tumoren bestuderen stroma epitheliale interacties en verknopingen species prostate recombinanten 7,17-20 goede voorbereiding van UGSM. is echter essentieel voor experimentele su...

Er is een enorme behoefte aan betere menselijke modelsystemen van prostaatkanker. Met name zou de relevante menselijke modelsysteem van normale, niet-maligne prostaatweefsels die genetisch kunnen worden gemanipuleerd om direct onderscheiden de rol van specifieke genen in de inleiding van prostaatkanker ongelooflijk informatief. De komst van de genoomtijdperk heeft talrijke genen die een rol spelen bij de vorming van kanker kunnen hebben geïdentificeerd. Een gebrek aan experimenteel menselijk modelsystemen echter ernstig schaadt ons vermogen om functioneel te testen en karakteriseren kandidaat prostaatkanker gevoelige genen. Een ideaal model systeem zou de snelle en snellere functionele analyses van kanker gevoelige genen in combinatie met de juiste transgene knaagdieren modelsystemen te vergemakkelijken. Bovendien zou een dergelijk menselijk modelsysteem moleculaire karakterisering van de signalerende mechanismen van prostate kanker naar de identificatie en validatie van nieuwe therapieën zodatvoorkomen prostaatkanker formatie. Humane embryonale stamcellen (hESCs) kunnen vormen menselijke prostaat weefsels xenografts. In 2006 Taylor et al.. Gemeld dat hESCs kan worden geïnduceerd prostaat epitheel vorming in vivo bij gerecombineerd met knaagdieren urogenitale sinus mesenchym (UGSM) binnen een tijdsperiode van 8-12 weken. 1 Deze werden gebaseerd op eerder werk van Cunha lab blijkt dat knaagdier embryonale UGSM kan prostaathyperplasie differentiatie van stamcellen en embryonale epitheliale celpopulaties in vivo te bevorderen. 2,3 De prostaat ontwikkelt zich uit een embryonale anlagen zogenaamde urogenitale sinus (UGS) en vóór embryonale dag 17 (E17 muis , dag E18 rat) de UGS kan worden verwijderd en fysiek verdeeld in epitheel (UGSE) en mesenchym (UGSM) 4 Dit weefsel recombinatie benadering is aanzienlijk verbeterd ons begrip van prostate ontwikkeling en carcinogenese bijzonder.ly groeifactor en hormonale signaalwegen en de moleculaire verbanden tussen prostaat epitheel en stroma. 5-8 Deze werkwijze omvat het ex vivo combinatie van UGSM met stamcellen of epitheliale cellen van dezelfde of verschillende soorten en deze cellulaire / weefsels recombinanten worden geïmplanteerd en gekweekt en xenotransplantaten binnen muisgastheer. 4,9 Na een periode van in vivo, het implantaat bevat prostaat epitheliale klierstructuren ingebed in stromale weefsel. Verder kleuring kan worden uitgevoerd om te bepalen of deze al dan werkelijk prostaat en van menselijke oorsprong. 10,11

<table><tbody><tr><td>Hank&rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>GIBCO</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>R1881</td><td>Sigma</td><td>965-93-5</td><td>Mix tot 1 ug/ml in Ethanol (1.000x stock)</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep Solution</td><td>GIBCO</td><td>15070</td><td>100x stock</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>KETASET (ketamine hydrochloride) </td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>100 mg/ml; verdun 1:10 in steriele zoutoplossing </td></tr><tr><td>AnaSed (xylazine) </td><td>VET-A-MIX, Inc.</td><td>NADA 139-236</td><td>20 mg/ml; verdun 1:10 in steriele zoutoplossing</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>BD Biosciences</td><td>215240</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase </td><td>Sigma</td><td>C2014</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen </td><td>Fort Dodge</td><td>NDC 0856-4396-01</td><td>100 mg/ml; verdun 1:1.000 in steriele zoutoplossing</td></tr><tr><td>Altalube oogzalf </td><td>Altaire Pharmaceuticals, Inc.</td><td>NLC 56641-19850</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ16 F Stereomicroscoop</td><td>Leica</td><td></td><td>Elke goede dissectiemicroscoop kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Vannas veerscharen</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td></td></tr><tr><td>Spuit</td><td>Hamilton</td><td>84855</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Naald, Klein RN, 28 gauge, 0,5inch, Point Style #3 (Blunt)</td><td>Hamilton</td><td>7803-02</td><td>Aangepaste naald </td></tr><tr><td>Ethanol Prep Pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td></td></tr><tr><td>Steriele gaasjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Naald (4-0 FS-2)</td><td>MedVet International</td><td>J392H</td><td>Naald-in, oplosbare naald </td></tr><tr><td>Autoclip 9 mm Wondclips</td><td>Becton Dickenson</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>PVP Jodium Prep Pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-98</td><td></td></tr><tr><td>Dissector schaar met stomp uiteinde</td><td>Fine Science Tools</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont fijne tip pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Naaldhouder met schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-14</td><td></td></tr></tbody></table>

vorming van menselijke prostaat epitheel behulp tissue recombinatie van knaagdieren urogenital sinus mesenchym en menselijke stamcellen

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Vooruitgang bij prostaatkanker onderzoek is ernstig beperkt door de beschikbaarheid van mensen afgeleide en hormoon-naïeve modelsystemen, die ons vermogen om genetische en moleculaire gebeurtenissen die ten grondslag liggen prostaataandoeningen initiatie begrijpen beperken. Naar het ontwikkelen van betere modelsystemen voor de studie van de menselijke prostaat carcinogenese, hebben wij en anderen gebruik gemaakt van het unieke pro-prostaat inductieve potentieel van embryonale knaagdieren prostaat stroma, genoemd urogenitale sinus mesenchym (UGSM). Bij gerecombineerd met bepaalde pluripotente celpopulaties zoals embryonale stamcellen, UGSM induceert de vorming van normale menselijke prostaat epitheel in een testosteron-afhankelijke wijze. Een dergelijk menselijk model kan worden gebruikt om te onderzoeken en experimenteel testen van het vermogen van de kandidaat prostaatkanker genen in versneld tempo ten opzichte van typische transgene knaagdieren studies. Sinds Menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) genetisch kunnen worden gemodificeerd in cultuur using induceerbare genexpressie of siRNA neerhalen vectoren voor weefsel recombinatie, zoals een model maakt het testen van de functionele gevolgen van genen of combinaties van genen, die worden verondersteld om kanker te voorkomen of te bevorderen. De techniek van het isoleren van zuivere populaties van cellen UGSM echter een uitdaging en leren vaak vereist iemand met eerdere ervaring persoonlijk leren. Bovendien kan inoculatie van celmengsels onder de renale capsule van een immuungecompromitteerde gastheer technisch uitdagend. Hier schetsen we en illustreren goede isolatie van UGSM van knaagdieren embryo&#39;s en niercapsule implantatie van weefsel mengsels voor de menselijke prostaat epitheel te vormen. Een dergelijke benadering, in de huidige fase, vereist in vivo xenografting van embryonale stamcellen; toekomstige toepassingen zou kunnen omvatten in vitro klier oprichting of het gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcellen populaties (iPSCs).

Voortbouwend op het spannende verslag door Taylor, et al.., Heeft ons lab een engrafting protocol met behulp van de algemeen gebruikte H1 (NIH-aangewezen WA01, genetisch mannelijk) aan menselijke embryonale stamcellen lijn. 1 Deze lijn is uitgebreid getest voor de kwaliteitscontrole en ontwikkeld is karyotypisch normaal 13 bij een juiste gekweekt, kan hES cellen worden gehandhaafd, uitgebreid, en ingevroren in een ongedifferentieerde en pluripotente toestand met behulp van een feeder-vrije...

Te ontrafelen de vroegste moleculaire mechanismen prostaatkanker initiatie, nieuw en innovatief model van de mens systemen en benaderingen zijn hard nodig. Het potentieel van de pre-prostaat urogenitale sinus mesenchym (UGSM) naar pluripotente stamcel populatie bewegen om menselijke prostaat epitheel vormen is een krachtig experimenteel hulpmiddel in prostate onderzoek.

Vorming van menselijke prostaat epitheel behulp Tissue recombinatie van knaagdieren Urogenital Sinus Mesenchym en menselijke stamcellen

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Het algemene doel van deze procedure is om urogentitaal sinusmesenchym of UGSM te isoleren uit knaagdierembryo's en weefselmengsels te implanteren in het nierkapsel die menselijk prostaatepitheel kunnen vormen. Dit wordt bereikt door eerst de urogentitale sinus te isoleren uit muis- of ratembryo's. Vervolgens wordt het urogentitaal sinusmesenchym gescheiden van het epitheel.Vervolgens worden single-cell suspensies van urogenitaal sinusmesenchym gecombineerd met pluripotente stamcellen. Ten slotte wordt het celmengsel geïmplanteerd onder het niersuapsel van een gastmuis. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die aantonen dat menselijk prostaatepitheel is gevormd op de muisnier, via validatie van mensspecifieke PSA-expressie.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de prostaatfunctie en het begin van ziekteprocessen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals xenotransplantaten van menselijke prostaattumoren en de inductie van wekelijks tumorogene cellijnen om tumoren te vormen. Na het euthanaseren van een muis of rat met een bekende drachtduur en het isoleren van de embryo's, worden deze gescheiden van de vliezschrong, wordt de navelstreng doorgesneden en worde

formation-human-prostate-epithelium-using-tissue-recombination-rodent

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In this video, we demonstrate the culturing of isolated mouse prostate epithelial cells using a matrix gel-ring based culture technique. This approach can provide complementary information about the differentiation capacity of prostate epithelial cells to form 3D glandular structures in response to genetic or pharmacological manipulation.

Prostate Organoid Assay: A Matrix Gel Ring-based Ex Vivo Culture Technique to Study the Differentiation Capacity of Prostate Epithelial Cells

In this video, we describe the procedure for the dissection of the urogenital system or UGS from a male mouse model. This UGS is further dissected ex vivo to isolate the prostate gland and study its role in prostate cancer development.

Extracting Prostate from Mouse Urogenital System: A Technique to Separate Prostate Gland from Other Urinary and Genital System Organs in Male Mouse

We beschrijven de productie van samengeperste hormoon pellets, alsmede subcutane chirurgische implantatie in muizen. Deze strategie kan worden gecombineerd met de groei van cellen en weefsels xenotransplantaten onder de renale capsule van athymische naakt muizen hormonale carcinogenese en regulering van benigne prostaat groei te evalueren.

Nier Capsule Xenografting en subcutaan Pellet Implantatie voor de Evaluatie van de Prostaat Carcinogenese en benigne prostaathyperplasie

Dit protocol beschrijft de decellularisatie van Sprague Dawley rattennieren door antegrade perfusie van detergenten door het vaatstelsel, waardoor acellulaire nier extracellulaire matrices ontstaan die dienen als sjablonen voor herbevolking met menselijke nier epitheliale cellen. Recellularisatie en het gebruik van de resazurin perfusie assay om groei te monitoren wordt uitgevoerd binnen speciaal ontworpen perfusie bioreactoren.

Epitheelcellen Herbevolking en voorbereiding van knaagdieren extracellulaire matrix Stellingen voor nierweefsel Development

Dit manuscript beschrijft de protocollen voor prostaat micro-dissectie en chirurgische castratie in het laboratorium muis. We tonen ook representatieve resultaten van deze protocollen. Tenslotte bespreken we de voordelen en het gebruik van deze protocollen.

Murine Prostaat Micro-dissectie en chirurgische castratie

Genetisch gemodificeerde muizen zijn nuttige modellen voor het onderzoek naar prostaatkanker mechanismen. Hier presenteren we een protocol om te identificeren en ontleden prostaat lobben van het urogenitaal systeem van een muis, onderscheiden van hen op basis van histologie, isoleren en cultuur de primaire prostaat cellen in vitro als spheroïden voor downstream analyses.

Identificatie en karakterisering van het histologische dissectie van de prostaat lobben van de muis voor In Vitro 3D sferoïde cultuur modellen

Hier presenteren we een protocol om begeleiden van menselijke primaire prostaat organoid behandeling dan eindpunten om te beoordelen fenotype suggereren. Zaaien, cultuur onderhoud, herstel van matrix gel, worden morfologische kwantificering, insluiten en segmenteren, FFPE segmenteren, geheel-mount kleuring en toepassing van commerciële tests beschreven.

Behandeling en evaluatie van menselijke primaire prostaat Organoid cultuur

Muis prostaat organoïden vertegenwoordigen een veelbelovende context voor het evalueren van mechanismen die differentiatie reguleren. Dit artikel beschrijft een verbeterde aanpak om prostaat organoïden vast te stellen, en introduceert methoden om (1) eiwit lysaat van organoïden te verzamelen, en (2) de organoïden voor de confocale microscopie van de hele Mount te fixeren en te vlechten.

Evaluatie van de differentiatie capaciteit van muizen prostaat epitheelcellen met behulp van Organoid cultuur

Weefselgemanipuleerde implantaten voor reconstructieve chirurgie komen zelden verder dan preklinische proeven vanwege moeizame ex vivo kweek, die complexe en dure steigercomponenten omvat. Hier presenteren we een eenfasige procedure die is ontworpen voor urineomleiding met een toegankelijke buisvormige steiger op basis van collageen die autologe microtransplantaten bevat.

Chirurgisch model voor enkelfasige weefsel-gemanipuleerde urotheelbuizen bij minipigs

Dit protocol beschrijft de generatie van een muisprostaat-organoïde-gebaseerd model dat in 2D is gekweekt. Het omvat organoïde dissociatie, celzaadvorming, differentiatie, beoordeling van de epitheelintegriteit en in-vitro infectie met uropathogene Escherichia coli. Het model biedt apicale toegankelijkheid en is geschikt voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties, waarmee het beperkingen van traditionele 3D-organoïde systemen overwint.

Generatie van een model gebaseerd op een muisprostaatorganoïde voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties

Dit protocol biedt een geoptimaliseerde methode om de epitheelbekleding van de volwassen vrouwelijke muizenurethra te isoleren voor downstream analyses, waaronder flowcytometrie, immunokleuring en organoïdekweek. Methoden leverden verrijkte, levensvatbare urethrale epitheelcellen op, zoals blijkt uit flowcytometrieanalyse, whole-mount imaging en efficiënte organoïdevorming.

Een geoptimaliseerde methode om vrouwelijke muizenurethrale epitheel te isoleren voor eencellige en immunofluorescentieanalyse

Leer hoe u urogenitaal sinus mesenchym isoleert uit knaagdierembryo's om menselijk prostaatepitheel te vormen met pluripotente stamcellen. Deze weefselrecombinatiemethode biedt inzicht in prostaatkankerontwikkeling.

Vorming van menselijke prostaat epitheel behulp Tissue recombinatie van knaagdieren Urogenital Sinus Mesenchym en menselijke stamcellen (Video) | JoVE Journal

Vorming van menselijke prostaat epitheel behulp Tissue recombinatie van knaagdieren Urogenital Sinus Mesenchym en menselijke stamcellen

Meer video's verkennen