Vorming van menselijke prostaat epitheel behulp Tissue recombinatie van knaagdieren Urogenital Sinus Mesenchym en menselijke stamcellen

Het algemene doel van deze procedure is om het urogenitale, sinus mesenchym of UGSM van knaagdieren te isoleren van knaagdieren embryo's en weefselmengsels te implanteren in de niercapsule die menselijk prostaatepitheel kunnen vormen. Dit wordt bereikt door eerst het urogenitale sinus te isoleren van muis- of rat embryo's. Vervolgens wordt het urogenitale sinus mesenchym gescheiden van het epitheel.

Vervolgens worden enkele celsuspensies van urogenitale sinus mesenchym gecombineerd met pluripotente stamcellen. Ten slotte wordt het celmengsel geïmplanteerd onder de niercapsule van een gastheermuis. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die tonen dat menselijk prostaatepitheel op de muizennier is gevormd door validatie van humane specifieke PSA expressie.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in prostaatfunctie en ziekte-initiatie, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals xenograft van menselijke prostaattumoren en inductie van wekelijkse tumorogene cellijnen om tumoren te vormen. Na het euthanaseren van een zwangere muis of rat en het isoleren van de embryo's, scheid ze van de vruchtzak, snijd de navelstreng door en breng ze over in een buis van 50 milliliter met ijskoud hanks. Balans zout oplossing en bewaar op ijs.

Plaats een embryo in een 100 millimeter petrischaal en gebruik een schaar om het op het niveau van de bolus te halveer. Verwijder de maag en dunne darm en lokaliseer vervolgens de eierstokken bij het vrouwelijk embryo, die zich op de coddle polen van de nieren of de teelballen bij de man bevinden op het niveau van de blaas. Onder een dissectiescoop.

Gebruik Venetiaanse schaar om de buikwand te snijden om de blaas en de achterste wand van de buik bloot te leggen. Bevrijd het bovenste geslachtsorgaan van de aanhechtingen en bevrijd de navelstreng. Snijd het schaambeen en met dumont fijne punttangen.

Los het voorzichtig los van de voorwand van het urogenitale sinus. Scheid de achterste wand van het urogenitale sinus van het rectum en snijd het urogenitale sinus met de blaas aan de onderkant. Scheid vervolgens de blaas van het urogenitale sinus.

Bewaar het urogenitale sinus en de blok in ijskoud HBSS. Breng het urogenitale sinus over naar een buis van 50 milliliter met 1% trypsine in HBSS zonder calcium en magnesium en incubeer bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Verwijder na de incubatie het trypsine en voeg 10%FBS en DM A MF 12 medium toe om de vertering te neutraliseren.

Gebruik vervolgens een naald of fijne punttangen om voorzichtig de plakkerige mesenchymale hoes van de epitheliale buis te verwijderen. Het intact houden van de epitheliale buis verkleint de kans op besmetting van het mesenchym met epitheliale cellen. Dit kan resulteren in knaagdierklieren die zich vormen samen met de stamcel-afgeleide humane glandulaire epitheel.

Breng de UGSM over naar een nieuwe buis van 50 milliliter met DMM F 12 medium bevattend 10%FBS 1%pen strep, 1%niet-essentiële aminozuren en een nanomolair. R 1 8 81 Incubeer de buis bij 37 graden Celsius met 5%CO2 overnacht. Centrifugeer de volgende dag het weefsel bij 200 G. Gooi de supernatant weg en gebruik PBS om de pellet te wassen.

Na het verwijderen van de PBS resuspendeert u het weefsel in 0,2% Collagenase in D-M-A-M-F 12 en incubeer bij 37 graden Celsius met zacht schudden gedurende één uur. Vortex de vertering van weefsel drie keer krachtig tot het een homogene enkele celmengsel wordt en neutraliseer de collagenase door D-M-A-M-F 12 medium met 10%FBS 1%pen strep, 1%niet-essentiële aminozuren en een nanomolair R 1 8 81 toe te voegen. Was de cellen drie keer door ze bij 200 G te pelleten en opnieuw op te schorsen in HBSS. Eindelijk, hervat de mesenchymale cellen in DMM F 12 en gebruik een hemo cytometer om ze te tellen om de transplantatie uit te voeren.

Na het voorbereiden van een steriele chirurgische ruimte en een mannelijke atymische naakte muis te anesthesieren met een IP injectie van ketamine xylazine, volgens het tekstprotocol, voer een teenprik uit om de mate van sedatie te bevestigen, bereid de muis chirurgisch voor door de operatieplaats te scheren indien nodig en reinig hem met drie afwisselende doppen van 70%alcohol gevolgd door Betadine-oplossing. Na het aanbrengen van oogzalf, maak een longitudinale incisie van een centimeter op de rug en ga door met het snijden van de buikwand met een longitudinale incisie van 0,5 centimeter. Druk voorzichtig de nier uit de buik en gebruik druppels steriele zoutoplossing om het vochtig te houden.

Gebruik vervolgens een naald van 27 gauge spuit om de niercapsule voorzichtig te puncteren om een injectieplaats voor het cellenmengsel te maken. Vul vervolgens een 28 gauge spuitnaald met 10 microliters van het cellenmengsel en breng het langzaam in de punctieplaats in, waarbij het nierparenchym wordt gepenetreerd. Om een gebied onder de niercapsule te bereiken.

Injecteer 10 microliters van de cellulaire mengsel om een bolus te vormen op de nier onder de niercapsule en trek de naald terug. Breng de nier terug in de buikholte en zet de spierlaag van het peritoneum vast met vier aught nylon hechtingen. Sluit de huid met hechtingen of spleten en gebruik steriele zoutoplossing om eventueel bloed van de huid te verwijderen.

Hier is een echografie van een groeiend xenograft acht weken na implantatie. Het omcirkelde gebied vertegenwoordigt het xenograft op het nieroppervlak. Deze afbeeldingen demonstreren xenograftgroei op het nieroppervlak.

Na 12 weken zullen menselijke ES-cellen die in afwezigheid van urogenitaal sinus worden geïmplanteerd, grote teratomen vormen, terwijl urogenitaal sinus mesenchym dat alleen wordt geïmplanteerd, geen enkele herkenbare structuur zal vormen. Getoond in het midden. Panelen van deze figuur zijn representatieve immunohistologische vlekken van stamcel-afgeleide menselijk prostaat epitheel versus volwassen menselijk prostaat weefsel.

Zoals hier links wordt getoond, bevatten de