Een High-throughput-methode voor meting van de glomerulaire filtratiesnelheid in Conscious Muizen
10 mei 2013
Meting van de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) is de gouden standaard voor de nierfunctie beoordeling. Hier beschrijven we een high-throughput methode die de bepaling van GFR in bewuste muizen met een enkele bolusinjectie, bepaling van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-inuline in plasma en berekening van GFR door een bifasisch exponentieel model laat.
Het algemene doel van deze procedure is om andere onderzoekers te laten zien hoe ze de nierfunctie bij wakkere muizen kunnen bepalen. Dit wordt bereikt door eerst dialyse, fluoresceïne-isothiocyanaat of FSE-inulin gedurende 24 uur te dialyseren en de concentratie ervan voor injectie te bepalen. De tweede stap is om de muis te wegen, nauwkeurige volumes van fitzy-inulin voor retrobulbaire injectie voor te bereiden en de muis te anesthetiseren.
Vervolgens wordt de Retrobulbaire Fitzy inulin-injectie uitgevoerd en worden er acht bloedmonsters genomen gedurende een periode van 75 minuten. De laatste stap is om Fitz Nulin te meten met behulp van een microvolume fluorospectrometer en de nierfunctie te berekenen met behulp van een tweefasen exponentiële afnamemodel. Het combineren van de gevoeligheid van de Fiti Nulin enkele bolus injectiemethode met de microvolumecapaciteit van de fluorospectrometer maakt het mogelijk om verschillen in nierfunctie te detecteren die worden veroorzaakt door genetische modificaties bij muizen, voedingsveranderingen of toediening van medicijnen.
De belangrijkste voordelen van deze techniek boven bestaande methoden zoals continue infusie en anesthesie zijn, implantatie van osmotische minipompen met behulp van radioactief inulin, dat er geen chirurgie nodig is. Het is geen terminaal experiment. Er hoeft geen urine te worden verzameld en het is mogelijk om tot 24 M per dag te meten.
Ik zal deze procedure samen met Maria Azimo, een onderzoeksmedewerker uit mijn laboratorium, demonstreren om de Fitzy Nulin injectieoplossing voor te bereiden. Weeg voldoende ZI-inulin voor twee milliliter van een 5% oplossing, los het gelabelde inulin op in 0,85% natriumchloride-oplossing door te verwarmen tot 90 graden Celsius totdat het volledig is opgelost. Plaats een stuk van 20 centimeter dialyse membraan in dubbel gedistilleerd water gedurende 30 minuten om resterend natriumzuur uit het membraan te verwijderen, spoel het membraan daarna een paar keer door, vul het dialyse membraan met opgelost fitzy inulin, sluit goed af met sluitingen en weeg vervolgens het hele membraan.
Laat het opgeloste fitzy inulin gedurende 24 uur dialyseren in één liter 0,85% natriumchloride-oplossing en roer langzaam beschermd tegen licht bij kamertemperatuur. Na dialyse weegt u het hele dialyse membraan opnieuw en berekent u de nieuwe concentratie. Water zal osmotisch het membraan in bewegen en ongebonden FSI zal uit het membraan bewegen. Dus de concentratie van FSI inulin zal aanzienlijk afnemen.
Bereken de nieuwe fit e inulinconcentratie met behulp van deze formule waarbij C de nieuwe concentratie is. N is de initiële fit E inulin hoeveelheid en V is het nieuwe volume, dat is het verschil in gewicht van dialysebuis voor en na dialyse, plus het volume van de initiële fitzy inulin-oplossing. Steriliseer vervolgens de gedialyseerde oplossing door middel van filtratie door een 0,22 micron spuitfilter.
Onthoud om fitzy inulin altijd te beschermen tegen licht om fotobleking te voorkomen vóór het experiment. Neem het lichaamsgewicht van de muizen na het anesthetiseren van de muizen kortstondig met vier tot 5% ISO fluor. Controleer de anesthesiediepte door twee microliter per gram lichaamsgewicht van gedialyseerd fitzy nulin te aspireren met een 100 microliter Hamilton-spuit met een halve inch lange 26 gauge naald om luchtbellen te verwijderen, vervolgens schakel over naar een halve inch lange, 30 gauge naald voor injectie.
Injecteer het gedialyseerde fitzy inulin in de retroorbitale plexus. Laat de muizen spontaan herstellen in hun thuiskooi. Snijd een millimeter van de staart van de muis af met een schaar en verzamel bloed op meerdere tijdstippen na injectie in natriumheparine mini capillairen.
Versluit mini capillairen na bloedafname met cha-seal en bewaar de monsters beschermd tegen licht. Plaats de verzegeld mini capillairen in hematocriet capillairen en centrifugeer gedurende vijf minuten. Breek mini capillairen door een diamantborstel te gebruiken en breng het hele plasma door pipettering over in een 0,2 milliliter buis.
Maak een een op tien verdunning door twee microliter plasma en 18 microliter 0,5 mol per liter heaps in een nieuwe 0,2 milliliter buis te gebruiken. Meet vervolgens twee microliter van de verdunde monster met de NanoDrop 3, 300 in duplicaten voor hoge doorvoer van zes muizen. Volg het stroomdiagramprotocol dat in het tekstprotocol is opgenomen om de hele nier GFR te meten met de enkele bolus injectiemethode. Acht bloedmonsters moeten worden verzameld bij 3 5 7 10 15 35 56 en 75 minuten na FSE nulin injectie.
In dit stroomdiagram geven de cijfers de verzamelingstijdstippen aan, terwijl de cijfers tussen haakjes de monsternummers aangeven. De tijdstippen links van de verticale rode lijn geven injectietijdstippen aan. Elke muis is gemarkeerd met een andere kleur. Volg de pijlen om opeenvolgende bloedafnames te krijgen.
Grijze vakken geven aan wanneer de volgende muis moet worden voorbereid voor isof fluorine anesthesie voorafgaand aan injectie met behulp van dit protocol. De minimale tijd tussen twee bloedafnames van verschillende muizen is één minuut. Verdun de fitzy nulin injectieoplossing met verdund muizenplasma om de standaardverdunningen te verkrijgen die in het tekstprotocol zijn opgenomen. De concentratie van de standaarden hangt af van de dialyse en zal altijd anders zijn voor elke bereiding van FSI nulin.
Daarom is het noodzakelijk om elke keer de concentratie voor de standaardcurve in te voeren. Analyseer gegevens om de glomerulaire filtratiesnelheid of GFR te berekenen met geschikte software door gebruik te maken van een tweefasen exponentiële afnamefunctie zoals in detail beschreven in het tekstprotocol om GFR bij bewuste muizen te meten. Plasmakinetica van ZI inulin na eenmalige intraveneuze injectie wordt gebruikt voor berekening van GFR. Een twee-compartimentenmodel wordt gebruikt in het twee-compartimentenmodel.
De aanvankelijke snelle afnamefase vertegenwoordigt herverdeling van fitzy inulin uit het intravasculaire compartiment naar de extracellulaire vloeistof. De latere fase met langzamere
Overzicht
Dit artikel presenteert een high-throughput methode voor het meten van de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) bij bewuste muizen. De techniek maakt gebruik van een enkele bolusinjectie van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-inuline en hanteert een tweefase exponentieel vervalmodel voor de berekening van de GFR.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Nefrologie
- Fysiologie
- Diermodellen
Achtergrond
- GFR is een cruciale indicator voor de nierfunctie.
- Traditionele methoden vereisen vaak invasieve procedures.
- Deze studie is erop gericht de technieken voor GFR-meting te verbeteren.
- FITC-inuline is een betrouwbare tracer voor de beoordeling van de nierfunctie.
Doel van de studie
- Om een niet-invasieve methode voor de meting van de GFR bij wakkeren muizen te demonstreren.
- Om de impact van genetische modificaties en behandelingen op de nierfunctie te beoordelen.
- Om een protocol te bieden dat de doorvoer verhoogt en stress bij dieren vermindert.
Gebruikte methoden
- Bereiding van FITC-inuline via dialyse.
- Retrobulbaire injectie van de tracer bij muizen.
- Afname van bloedmonsters op gespecificeerde tijdstippen.
- Analyse van plasmamonsters met een microvolume-fluorospectrometer.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een nauwkeurige bepaling van de GFR mogelijk zonder chirurgische ingreep.
- Het maakt de detectie van veranderingen in de nierfunctie mogelijk als gevolg van diverse factoren.
- De resultaten tonen de haalbaarheid aan van high-throughput GFR-metingen.
- De gegevens ondersteunen het gebruik van een tweefasen-exponentieel vervalmodel voor de analyse.
Conclusies
- Deze techniek is een belangrijke vooruitgang in de beoordeling van de nierfunctie.
- Het biedt een niet-terminale benadering die gunstig is voor het dierenwelzijn.
- Het protocol kan worden aangepast voor diverse onderzoeksapplicaties.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
High-throughput, kwantitatieve meting van de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) bij bewuste muizen pakt een kritieke flessenhals in de preklinische nefrologie en de beoordeling van de renale veiligheid aan. Deze methode maakt een sensitieve, longitudinale evaluatie van de nierfunctie in ziektemodellen en onder farmacologische interventie mogelijk, wat de voorspellende betrouwbaarheid en translationele continuïteit in drug discovery-pipelines ondersteunt. De niet-terminale, minimaal invasieve workflow verbetert de besluitvorming over portefeuilles door herhaalde metingen en robuuste mechanistische risicoreductie mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroegtijdige Ontdekking & Doelvalidatie
- Maakt functionele validatie van renale targets mogelijk door veranderingen in de GFR te kwantificeren als reactie op genetische of farmacologische perturbaties.
- Ondersteunt mechanistische de-risking door echte renale effecten te onderscheiden van confoundende variabelen in bewuste, niet-gefixeerde dieren.
- Vergemakkelijkt het voorspellende vertrouwen in vroegstadium-studies naar renale veiligheid en effectiviteit.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerde, reproduceerbare assay voor high-throughput screening van verbindingen die de nierfunctie beïnvloeden.
- Levert kwantitatieve, op plasma gebaseerde resultaten die geschikt zijn voor vergelijkingen tussen verschillende studies en verbindingen.
- Maakt schaalbare, gepaarde experimentele ontwerpen mogelijk voor studies naar dieet- of medicijninterventies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt preklinische beoordelingen van de nierfunctie uit met klinische eindpunten door GFR als translationele biomarker te gebruiken.
- Ondersteunt longitudinale studies, waardoor het verloop van de ziekte of de therapeutische respons binnen hetzelfde dier kan worden gevolgd.
- Vermindert het aantal gebruikte dieren en verbetert de datacontinuïteit over de verschillende preklinische onderzoeksfasen heen.
Pipeline- & Workflowintegratie
Dit protocol voor de meting van de GFR integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek, waardoor vroege functionele screening, mechanistische studies en translationele biomarker-validatie in het nieronderzoek mogelijk worden.
- Discovery Biology: Kwantitatieve GFR-meting ondersteunt hypothesetoetsing en biologische risicoreductie bij studies naar renale targets.
- Screening: Een reproduceerbare high-throughput workflow maakt efficiënte evaluatie van verbindingen op renale effecten mogelijk.
- Analytics: Plasmafluorescentie-kwantificering en twee-compartimentmodellering leveren robuuste, vergelijkbare resultaten.
- Translational Research: Longitudinale, niet-terminale bemonstering sluit aan bij klinische studievormgevingen en biomarkerstrategieën.
- Enterprise Reuse: Het protocol is aanpasbaar voor diverse renale modellen en interventiestudies, wat bijdraagt aan een brede R&D-bruikbaarheid.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar de nierfunctie.
- Operationele waarde: Stroomlijnt de workflow met minimale handelingen aan dieren, zonder chirurgie en met een hoge doorvoer van monsters.
- Strategische waarde: Maakt robuuste go/no-go-beslissingen mogelijk en vermindert biologische risico's in een laat stadium binnen nierportfolio's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering en het verder ontwikkelen van geneesmiddelkandidaten voor nieraandoeningen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van kleine dieren en retrobulbale injectietechnieken.
- Toegang tot microvolume-fluorescentiespectrometrie en analytische modelleringssoftware is noodzakelijk.
- Strenge standaardisatie van bemonsteringstijden en data-analyse tussen teams is vereist.
- Aanpasbaar voor verschillende muismodellen, maar optimalisatie kan nodig zijn voor andere diersoorten of ziektecontexten.
- Fotobleken van FITC-inuline en een nauwkeurige timing van de bloedafname zijn cruciaal voor de integriteit van de gegevens.
