Name: Driedimensionale beeldvorming van Nociceptieve Intraepidermal zenuwvezels in Menselijke huid Biopsieën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Leer driedimensionale beeldvorming van nociceptieve intraepidermale zenuwvezels in menselijke huidbiopten voor neuropathieonderzoek. Deze methode onthult morfologische veranderingen bij pijnlijke neuropathieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Subsidies K08 NS061039-01A2, het programma voor Neurology Research &amp; Discovery en The A. Alfred Taubman Medical Research Institute van de Universiteit van Michigan. Dit werk gebruikt de morfologie en beeldanalyse Kern van de Michigan Diabetes Research en Training Center, gefinancierd door de National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 van het National Institute of Diabetes en Maag-, Darm-en Kidney Diseases. De auteurs willen graag Robinson Singleton en Gordon Smith (Universiteit van Utah) bedanken voor hun gulle donatie van menselijke huid monsters aan de initiële ontwikkeling van de nociceptieve biomarker immunohistochemie techniek ondersteunen.

Deel A: Immunohistochemistry Bereiding van 96-well plaat en voorkoming van achtergrondkleuring Punch skin biopsies verzameld van proefpersonen en gedurende 12-24 uur in fixeeroplossing (2% paraformaldehyde bij 0,75 M L-lysine-oplossing (pH 7,4) en 0,05 mM natriumperjodaat) bij 4 ° C zoals eerder beschreven 8. Monsters worden vervolgens cryoprotected in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 20% glycerol bij 4 ° C gedurende 1 week, ingebed in fixeermiddelen optimale snijtemperatuur (OCT), vervolgens in coupes 50 urn dikke secties op een cryostaat. Het hieronder beschreven protocol is geschikt voor 8 huidsecties, het maximum aantal huidsecties mogelijk vrij zwevende immunohistochemie ondergaan in een 96-well plaat. DAG 1: 1. Preventie van niet-specifieke immunoreactiviteit in de hoornlaag <ol><li> Label 96-well plaat zoals getoond in figuur 1. </li&gt; <li> Voeg 150 ul van Image-IT FX Signal (Image-IT), effectief voor het blokkeren achtergrondkleuring 11,12, in elk putje in rij 1 van de 96-well plaat. </li><li> Voeg 150 pi 1X PBS aan elk putje in rij 2 en 3 van de 96-well plaat. </li><li> Verwerven twee 50 micrometer secties per patiënt: een sectie van de biopsie genomen op DL, een sectie van de biopsie genomen bij PT. Een entnaald (LeLoop) wordt gebruikt om delen van de ene spoel naar de volgende morfologische schade te voorkomen. Zachtjes elke 50 pm sectie overdragen, met behulp van een entnaald, in een individuele welzijn van Rij 1, met daarin Afbeelding-IT. Incubeer secties in Beeld-IT voor 30 min bij RT op een vlakke rocker. </li><li> Spoel secties tweemaal met 1X PBS (rijen 2 en 3) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Plaats wells plaat op een vlakke rocker tussen spoelingen. </li></ol> 2. Bereiding van 5% BSA Blocking Solution en 1% spoeloplossing <ol><li> Terwijl biopsie secties zijn incuberen in Beeld-IT, bereiden 5% blokkerende oplossingtie (5% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-Vortex oplossing totdat BSA volledig oplost). </li><li> Voeg 150 ul van 5% BSA blokkerende oplossing in elk putje van Row 4. </li><li> Met behulp van een entnaald, secties te zetten in afzonderlijke putjes van 5% BSA blokkerende oplossing. Incubeer secties in 5% BSA blokkerende oplossing voor 1-2 uur bij kamertemperatuur op een vlakke rocker. </li></ol> 3. Bereiding van 1% BSA-oplossing en spoelen Verdunning van Primaire antilichamen <ol><li> Terwijl secties incuberen in 5% BSA blokkerende oplossing, bereid 1% spoeloplossing (1% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-BSA Vortex oplossing tot volledig opgelost). </li><li> Terwijl secties incuberen in 5% BSA blokkerende oplossing primaire antilichamen verdund in 1% spoeloplossing. <ol><li> Voor acht secties (8 x 150 = 1200 pi pi) in totaal 1.200 gl nodig. De primaire antilichamen worden bereid in 1500 pl (ongeveer 20% extra volume). </li><li> Verdunningen van het primaire antilichamen: PGP, 1:500; Trk A,1:500 in 1% BSA spoeloplossing. </li></ol></li></ol> 4. Incubatie van Sectioned Biopsieën in primair antilichaam <ol><li> Voeg 150 pi van het verdunde primaire antilichamen in de aangegeven putjes van de 96-well plaat (rij 5). </li><li> Overdragen secties van 5% blokkerende oplossing (rij 4) in de daarvoor bestemde primaire antilichaam putten (rij 5). </li><li> Sluit de 96-well plaat met parafilm en aluminium folie om uitdrogen te voorkomen en blootstelling aan licht. </li><li> Incubeer de 96-well plaat O / N bij 4 ° C op een vlakke rocker. </li></ol> DAG 2: 5. Spoel Biopsieën in 1% BSA Spoelen Solution <ol><li> Voeg 150 ul van 1% BSA spoeloplossing in elk putje in rij 6, 7 en 8. </li><li> Spoel secties driemaal met 1% BSA spoeloplossing (rijen 6, 7, en 8) gedurende 1 uur elke keer bij kamertemperatuur. Bedek goed plaat met aluminiumfolie en plaats op vlakke rocker tussen spoelingen. </li></ol> 6. Verdunning van secundaire antilichamen &lt;ol&gt; <li> Terwijl secties worden geïncubeerd in de laatste spoelgang van 1% BSA spoeloplossing (rij 8), secundaire antilichamen verdund in 1% BSA spoeloplossing: <ol><li> Voor acht secties (8 x 150 = 1200 pi pi) in totaal 1.200 gl nodig. De secundaire antilichamen worden bereid in 1500 pl (ongeveer 20% extra volume). </li><li> Verdunningen van de secundaire antilichamen: voor PGP (Alexa Fluor 488 ezel anti-konijn, 1:250), voor Trk A (Alexa Fluor 647 ezel anti-geit, 1:250) in 1% BSA spoeloplossing. </li></ol></li></ol> 7. Incubatie van Sectioned Biopsieën in secundair antilichaam <ol><li> Voeg 150 pi van het verdunde secundaire antilichamen in de aangegeven putjes van de 96-well plaat (rij 9). </li><li> Overdragen secties van 1% BSA blokkerende oplossing (rij 8) in secundaire antilichaam goed (rij 9). </li><li> Sluit de 96-well plaat met parafilm en aluminium folie om uitdrogen te voorkomen en blootstelling aan licht. </li><li> Incubeer secties in de aangewezen secundaire antilichamen O/ N bij 4 ° C op een vlakke rocker. </li></ol> 8. Spoel Biopsieën in 1% BSA Spoelen Solution <ol><li> Voeg 150 ul van 1% BSA spoeloplossing in elk putje in rij 10, 11 en 12. </li><li> Spoel secties driemaal met 1% BSA spoeloplossing (rijen 10, 11 en 12) gedurende 1 uur elke keer bij kamertemperatuur. Bedek goed plaat met aluminiumfolie en plaats op een vlakke rocker tussen spoelingen. </li></ol> 9. Voorbereiding van de Microscope Slides en montage Sectioned Biopsieën <ol><li> Terwijl biopsie secties worden incuberen in de laatste spoeling van 1% BSA spoelvloeistof (rij 12), bereiden objectglaasjes. </li><li> Plaats 50 gl 1% BSA spoeloplossing op een dia tegelijk. </li><li> Verwijder coupes van 1% BSA spoeloplossing (rij 12), en plaats deze in de 50 ul druppel van 1% BSA spoeloplossing op de aangewezen microscoopglaasje. Na het optimaliseren van de positie van de sectie, verwijder overtollig 1% BSA spoelen oplossing met een bulbed glazen pipet, het nemen van voorzorgsmaatregelenom te voorkomen dat het monster aan te raken. </li></ol> OPMERKING: Zorg ervoor dat sectie is nog niet voorbij gevouwen; het monster moet vlak zijn tegen het oppervlak van de microscoop dia. <ol start="4"><li> Plaats 1 druppel Verleng Gold antifade montage reagens met DAPI bij de biopsie op de microscoop dia. Neem een ​​22x22 mm microscoop glas dekglaasje en plaats deze voorzichtig over biopsie en een druppel Verleng Gold antifade reagens met DAPI neerzetten. Herhaal dit voor elke sectie. </li><li> Laat objectglaasjes droog O / N bij RT in het donker. </li></ol> OPMERKING: Verwijder eventuele luchtbellen met behulp van een pipet tip. Veeg overtollige Verleng Gold antifade reagens. Deel B: confocale Imaging 10. Confocale Imaging <ol><li> Afbeelding fluorescentie signalen met behulp van een Olympus FluoView 500 laser scanning confocale microscoop met een 40X olie-immersie (1.3 NA) objectieve en zoom twee keer met FluoView versie 5.0 software. </li&gt; <li> Gebruik Alexa Fluor 488 en Alexa Fluor 647 de 543-nm HeNe green laser en 633 nm HeNe-laser Red respectievelijk wekken. De Alexa Fluor 488 signaal wordt door een groene opzoektabel (LUT) en het Alexa Fluor 647 door een rode LUT. </li><li> Stel de confocale openingen voor elke detector bij 400 urn tot signaalversterking. Sequentiële scans moeten worden genomen met een resolutie van 1024 x 1024 te signaalscheiding maximaliseren. </li><li> Leg drie-dimensionale z-series met 1,2 urn z-stappen van (gebaseerd op de optimale scaneenheid berekend door de software FluoView) met Kalman gemiddeld (twee frames). </li></ol> Deel C: Drie-dimensionale visualisatie en animatie 11. Driedimensionale (3D) Visualisatie en Animatie <ol><li> Open FluoView bestanden in Imaris x64-software (versie 7.3, Bitplane AG) te visualiseren het 3D-beeld sets. </li><li> Het scherm aanpassen als nodig is om het contrast van de zenuw specifiek signaal te versterken. </li><li> Maak een surface naar de dermale-epidermale grens visualiseren. Gebruik de Contour instrument in gelijkspel modus om de grens te trekken. </li><li> Wijs een semi-transparante oppervlak aan de grens om de onderliggende fluorescentiesignalen bekijken. </li><li> Stilstaande beelden van de 3D-fluorescerende signalen naar Snapshot beelden van de 3D-film te maken. </li><li> Gebruik de functie Animation om een ​​3D-film te maken. De beelden kunnen worden gedraaid 360 graden een paar keer om elk signaal apart en samengevoegde zien (figuren 2, 3 en 4). Stel animatie om films bestaande uit 200 frames geanimeerd op 15 frames per seconde te maken. Opslaan elke film als een rauwe AVI-bestand. </li><li> Druk de uiteindelijke AVI-film met VirtualDub-software (versie 1.9.4). </li></ol>

<ol><li>Lauria, G., Holland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+innervation%3A+changes+with+aging%2C+topographic+location%2C+and+in+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy.</a> J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).</li>
<li>Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).</li>
<li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+nerve+fiber+density%3A+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li>
<li>Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cutaneous+innervation+by+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies.</a> Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).</li>
<li>Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor%2Fp38+signaling+increases+intraepidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+neuropathy+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes.</a> Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).</li>
<li>Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+biopsy+for+the+diagnosis+of+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy.</a> Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).</li>
<li>Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+validity+of+epidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+sensory+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies.</a> Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).</li>
<li>Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+fluorescence+quantitation+provides+a+new+approach+to+assess+cutaneous+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation.</a> J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).</li>
<li>Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+gene+product+9.5-immunoreactive+nerve+fibres+and+cells+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin.</a> Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).</li>
<li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+capsaicin+receptor+immunoreactivity+in+human+peripheral+nervous+system+and+in+painful+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Peripher.+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).</li>
<li>Penna, G., Fibbi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+benign+prostatic+hyperplasia+stromal+cells+as+inducers+and+targets+of+chronic+immuno-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation.</a> J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).</li>
<li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+%28mtDNA%29+Biogenesis%3A+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li>
<li>Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+biopsy+as+a+tool+to+assess+distal+small+fiber+innervation+in+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy.</a> Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).</li>
<li>Lauria, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+fibre+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Small fibre neuropathies.</a> Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).</li>
<li>Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+among+pain%2C+sensory+loss%2C+and+small+nerve+fibers+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes.</a> Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).</li>
<li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+swellings+predict+the+degeneration+of+epidermal+nerve+fibers+in+painful+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies.</a> Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).</li>
<li>Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+nerve+fiber+density%2C+axonal+swellings+and+QST+as+predictors+of+HIV+distal+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).</li>
<li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+27%3A+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten te verklaren.

Meting van IENFD is op grote schaal gebruikt om de mate van perifere neuropathieën 13,14 bepalen. Momenteel is de meest gebruikte protocol meet alleen de dichtheden van zenuwvezels die de basale membraan van de epidermis doordringen, het niet in aanmerking nemen axonale vertakkingen en / of morfologische veranderingen van de zenuwen. Bovendien heeft de huidige IENFD analyse niet aangetoond IENFD correleren met de aanwezigheid van pijn in PN 15. We eerder gemeld dat verh...

Momenteel is het gebruikelijk voor artsen om intraepidermal zenuwvezel dichtheden (IENFD) kwantificeren van de huid stansbiopsieën, die kan worden gebruikt om kleine vezels neuropathieën 3, 6-8 diagnosticeren. Biopten worden genomen uit de distale been (DL), 10 cm boven de laterale malleolus, en de proximale dij (PT), 20 cm onder de voorste iliaca wervelkolom 9. Alle IENF worden geëtiketteerd met proteïnegen product 9,5 (PGP), een pan neuronale marker 10-12. Momenteel is het gebruikelijk om kleine vezels neuropathieën middels diagnosticeren IENFD bepaald door kleuring met PGP helderveld microscopie 6. Daarnaast hebben verschillende onderzoeksgroepen gebruikt immunofluorescerende protocollen voor PGP immunohistochemie 7-9. Kleine vezels neuropathie wordt vaak geassocieerd met neuropathische pijn. Om de rol van IENF essentieel voor pijn verwerking verder begrijpen we een techniek ontwikkeld om samenwerking label totale IENF met vezels die pijn produceren. Nociceptieve IENF, specifiek Aδ en C-vezels, kan worden bestudeerd door de co-etikettering van IENF met PGP en de nociceptieve marker, tropomyosine-receptor-kinase A (Trk A) 5. TrkA is de hoge affiniteit receptor voor zenuwgroei-factor die essentieel is voor de ontwikkeling van nociceptie. De Trk A-positieve nociceptieve zenuwvezels zijn peptidergisch vezels die express substance P (SP) en calcitonine gen gerelateerd peptide (CGRP). Voorheen Lauria en collega&#39;s paste de dubbel-labeling techniek om PN, co-labeling PGP-positieve IENF met een nociceptieve marker 10 bestuderen. In onze eerdere studie hebben we aangetoond dat Trk A-positief IENF, maar niet Trk A-negatieve IENF werden opgereguleerd in een diermodel van pijnlijke diabetische neuropathie 5. Deze co-labeling techniek biedt de mogelijkheid om te vergelijken kwantificering van nociceptieve IENFD aan IENFD en het vermogen om morfologische veranderingen geassocieerd met PN bestuderen totaal. De mogelijkheid om nociceptieve IENF en bedrij visualiserenre kwantificering van totaal IENFD tot nociceptieve IENFD kan objectief bewijs voor de aanwezigheid van pijn en mogelijk inzicht in de ernst van pijn bij PN. Deze techniek is ook toepasbaar op huid van diermodellen. In vergelijking met eerdere studies, het huidige protocol beschrijft methoden voor 3D beeldanalyse, het creëren van de mogelijkheid om fouten die kunnen optreden in 2D beeldanalyse voorkomen.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-4</td><td>Om 1X PBS te maken</td></tr><tr><td>Image-IT FX Signaal</td><td>Invitrogen</td><td>I36933</td><td>Image-IT</td></tr><tr><td>Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal konijn)</td><td>AbD Serotec</td><td>7863-0504</td><td>PGP</td></tr><tr><td>Tropomyosine-gerelateerde-Kinase A (Polyclonal geit)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF1056</td><td>Trk A</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ezel &alpha;-konijn</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>AF488 ezel &alpha;-geit</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 ezel &alpha;-geit</td><td>Invitrogen</td><td>A21447</td><td>AF647 ezel &alpha;-geit</td></tr><tr><td>Albumine, uit runder serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Triton X- 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>TX-100</td></tr><tr><td>Niet-gekalibreerd lusje</td><td>LeLoop</td><td>MP 199025</td><td>Inoculantielusje</td></tr><tr><td>96-wells assay plaat</td><td>Corning Incorporated</td><td>3603</td><td>Wellplaat</td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagens met DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Microscoopdekglas 22x22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td>Dekglazen</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscoopglazen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Microscoopglazen</td></tr><tr><td>Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscoop</td><td>Olympus</td><td>FV500</td><td>Confocal Microscoop</td></tr><tr><td>Optimum snijtemperatuur</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Leica cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td>Cryostat</td></tr></tbody></table>

driedimensionale beeldvorming van nociceptieve intraepidermal zenuwvezels in menselijke huid biopsieën

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Een punch biopsie van de huid wordt vaak gebruikt om intraepidermal zenuwvezel dichtheden (IENFD) te kwantificeren voor de diagnose van perifere polyneuropathie 1,2. Momenteel is het gebruikelijk om 3 mm huid biopten te verzamelen van het distale been (DL) en proximale dij (PT) voor de beoordeling van lengte-afhankelijke polyneuropathieën 3. Echter, vanwege de aard van multidirectionele IENFs, is het een uitdaging om te onderzoeken overlappende zenuwstructuren door de analyse van tweedimensionale (2D) beeldvorming. Alternatief zou driedimensionale (3D) beeldvorming een betere oplossing voor dit dilemma. In het huidige rapport presenteren we methoden voor de toepassing van 3D-beeldvorming om pijnlijke neuropathie (PN) te bestuderen. Om IENFs identificeren, zijn huid monsters verwerkt voor immunofluorescent analyse van eiwit-genproduct 9,5 (PGP), een pan neuronale marker. Op dit moment is het gebruikelijk om kleine vezels neuropathie behulp IENFD ontmoedigen diagnosticerenbepaald door immunohistochemie met PGP helderveld microscopie 4. In de huidige studie, dubbele immunofluorescentie-analyse pasten wij aan totale IENFD identificeren, PGP en nociceptieve IENF, door het gebruik van antilichamen die tropomyosine-receptor-kinase herkennen A (Trk A), de hoge affiniteit receptor voor zenuwgroeifactor 5. De voordelen van co-kleuring IENF met PGP en Trk A antilichamen ten goede aan de studie van PN door duidelijke kleuring PGP-positieve, nociceptieve vezels. Deze fluorescerende signalen kunnen worden gekwantificeerd om nociceptieve IENFD en morfologische veranderingen van IENF geassocieerd met PN bepalen. De fluorescerende beelden worden overgenomen door confocale microscopie en verwerkt voor 3D-analyse. 3D-imaging biedt rotatie capaciteiten om verder te analyseren morfologische veranderingen geassocieerd met PN. Samen genomen, fluorescerende co-kleuring, confocale imaging en 3D-analyse duidelijk ten goede aan de studie van PN.

We pasten het huidige protocol naar de morfologie van IENF in PT en DL huidbiopsies bestuderen van patiënten met PN. De huid, uit drie onderwerpen, werd verzameld aan de Universiteit van Utah aan de pathomorphology geassocieerd met PN demonstreren. De onderwerpen zijn onder meer: ​​Case 1: een 51-jarige man met een geschiedenis van PN van type 2 diabetes (duur: 14 maanden; pijn score: 51); Case 2: een 56-jarige man met een geschiedenis van PN van type 2 diabetes (duur: 108 maanden; pijn score: 47), en arrest van 3: een ...

Om de veranderingen van nociceptieve intraepidermal zenuwvezels (IENFs) in pijnlijke neuropathieën (PN) te bestuderen, ontwikkelden we protocollen die direct kon onderzoeken driedimensionale morfologische veranderingen waargenomen in nociceptieve IENFs. Drie-dimensionale analyse van IENFs heeft de potentie om de morfologische veranderingen van IENF in PN evalueren.

Driedimensionale beeldvorming van Nociceptieve Intraepidermal zenuwvezels in Menselijke huid Biopsieën

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Het algemene doel van deze procedure is om immunohistochemie uit te voeren op coupes van menselijke huidbiopten om morfologische veranderingen van intra-epidermale zenuwvezels geassocieerd met pijnlijke neuropathie te bestuderen via driedimensionale beeldvorming. Dit wordt bereikt door eerst een driedaags immunohistochemisch protocol voor drijvende coupes uit te voeren op individuele coupes van menselijke huidbiopten. De tweede stap is het beelden van huidcoupes met een dikte van 50 micron met behulp van een confocale microscoop.Vervolgens worden de afbeeldingsbestanden van de flow view verwerkt met MRS-software om een driedimensionaal moviebestand van de oorspronkelijke immunofluorescentiebeelden te maken. De laatste stap is het gebruik van vdw-software of vergelijkbare software om het moviebestand te comprimeren. Uiteindelijk maken driedimensionale beeldvormingsresultaten het mogelijk om morfologische veranderingen in verband met pijnlijke neuropathie te bestuderen.Momenteel wordt de intraoperatieve dichtheid van epidermale zenuwvezels gebruikt als kwantitatieve methode om neuropathie te diagnosticeren. Co-labeling van deze intradermale zenuwvezels met de nociceptieve biomarker heeft de potentie om inzicht te verschaffen in de pijn die met deze complicatie gepaard gaat. Het huidige tweedimensionale beeldgevingsprotocol kent meerdere beperkingen, waaronder de overlap van zenuwvezels.Daarentegen biedt driedimensionale beeldvorming mogelijkheden voor verdere analyse van morfologische veranderingen geassocieerd met neuropathie, zoals axonale zwelling en bleking, evenals het meten van het axonale volume. Het is belangrijk op te merken dat er maatregelen moeten worden genomen om kwalitatieve beelden te verkrijgen voor het genereren van betekenisvolle driedimensionale animaties, waardoor deze methode inzicht kan bieden in pijnlijke neuropathie. Deze methode kan ook worden toegepast op andere monsters, zoals dikke organculturen of driedimensionale celculturen, om complexe veranderingen in de driedimensionale morfologie te onderzoeken en te meten.Nadat de menselijke huidbiopten zijn gefixeerd en gesneden zoals beschreven in het geschreven gedeelte van dit protocol, labelt u een 96-wellplaat die voor kleuring zal worden gebruikt, zoals getoond in deze afbeelding. Voeg vervolgens 150 µL image ITFX-signaal toe aan elke well in rij één van de gelabelde 96-wellplaat en pipetteer 150 µL 1xPBS in alle wells in rij twee en drie. Gebruik een inoculatielus om een sectie van 50 mm, genomen uit het distale beenbiopt van een patiënt, over te brengen naar een van de wells die image bevatten.Breng vervolgens een sectie van 50 millimeter, genomen uit het proximale deel van dezelfde patiënt, over naar de volgende put met image. Herhaal deze procedure met de distale beensecties en proximale dijsecties van drie verdere patiënten. Incubeer de secties in, image op een platte schudplaat gedurende 30 minuten terwijl de biopsie-secties incuberen in image it; bereid een 5% blokkeringsoplossing voor en vortex de oplossing totdat de BS A volledig is opgelost nadat de 30 minuten zijn verstreken.Breng de coupes over naar de PBS in rij twee en schud 10 minuten, gevolgd door een spoeling in de PBS in rij drie gedurende 10 minuten. Terwijl er opnieuw wordt geschud, pipetteer 150 µL van een 5%BSA-blokkeringsoplossing in elke put van rij vier en breng de coupes over naar deze putten. Incubeer de coupes in de 5%BSA-blokkeringsoplossing gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur op een vlakke schudplaat. Bereid tijdens deze incubatie een 1% spoeloplossing door te vortexen tot de BSA volledig is opgelost, en verdun vervolgens de primaire antilichamen tot de vereiste concentratie in deze oplossing.Voeg vervolgens 150 µL verdunde primaire antilichamen toe aan de wells in rij vijf van de 96-well plaat. Nadat de incubatieperiode is verstreken, worden de coupes vanuit de blokkeringsoplossing overgebracht naar de overeenkomstige wells met het primaire antilichaam. Seal de plaat vervolgens met parafilm en aluminiumfolie om uitdroging en blootstelling aan licht te voorkomen en incubeer deze gedurende de nacht bij 4 °C op een vlakke schudplaat. Voeg de volgende dag 150 µL spoeloplossing met 1% BSA toe aan elke well in rij zes, zeven en acht, en laat de coupes gedurende één uur door deze wasstappen gaan bij kamertemperatuur onder voortdurend schudden, waarbij wordt gewaarborgd dat de plaat tijdens elke wasstap tegen licht is beschermd. Terwijl de coupes incuberen in de laatste spoeling met 1% BSA-spoeloplossing, worden de secundaire antilichamen verdund in 1% BSA-spoeloplossing volgens de instructies in het geschreven gedeelte van de protocollen.Zodra de incubatietijd is verstreken, voegt u 150 µL verdunde secundaire antilichamen toe aan de aangewezen wells in rij negen van de 96-well plaat. Plaats de coupes in deze wells, dek de plaat af met parafilm en aluminiumfolie en incubeer deze een nacht bij 4 °C op een vlakke rocker. Voeg de volgende dag 150 µL 1% BSA spoeloplossing toe aan elke well in rij 10, 11 en 12, en spoel de coupes in deze oplossing gedurende elk een uur, zoals voorheen.Terwijl de bioptcoupes incuberen in de laatste spoeling van de 1%BSA-spoeloplossing, worden de microscoopglaasjes voorbereid door 50 µL 1%BSA-spoeloplossing op elk glaasje te pipetteren. Verwijder de coupe uit de laatste spoeling en plaats deze in de druppel van 50 µL 1%BSA-spoeloplossing op het betreffende microscoopglaasje. Nadat de positie van de coupe is geoptimaliseerd, wordt het overtollige 1%BSA-spoeloplossing verwijderd met een glazen bulbpipet, waarbij voorzichtig wordt gewerkt om contact met het monster te vermijden.Plaats één druppel Prolong Gold anti-fade monteermiddel met DPI nabij het biopt op de microscoopglasplaat. Neem vervolgens een dekglas van 22 bij 22 millimeter en plaats dit voorzichtig over het biopt en de druppel monteermiddel. Verwijder eventuele luchtbellen met een pipetpunt en veeg overtollig Prolong Gold weg.Antifa-reagens. Herhaal dit voor elke sectie en laat de microscoopglaasjes de volgende dag overnacht drogen bij kamertemperatuur in het donker. Beeld de fluorescentiesignalen af met een confocale microscoop; hier wordt een Olympus flow view 500 laser scanning confocale microscoop met een 40 x olie-immersieobjectief en een zoomfactor van twee gebruikt met flow view versie 5.0 software.Gebruik Alexa floor 4 88 en Alexa floor 6 47 om respectievelijk de 543 nanometer heliumneon-groene laser en de 633 nanometer heliumneon-rode laser aan te sturen. Stel de confocale diafragma's voor elke detector in op 400 microns om de signalen te versterken. Sequentiële scans dienen te worden uitgevoerd met een resolutie van 10 24 bij 10 24.Om de scheiding van signalen te maximaliseren, worden driedimensionale Z-series vastgelegd met Z-stapintervallen van 1,2 micron op basis van de optimale scaneenheid, berekend door de flow view-software met kalman-middeling over twee frames bij het eerst openen van flow view-bestanden in MRSX 64-software of vergelijkbare software. Pas bij het visualiseren van de 3D-beeldsets het display naar behoefte aan om het contrast van het zenuurspecifieke signaal te verbeteren. Maak een oppervlak aan om de grens tussen dermis en epidermis te visualiseren.Gebruik de contourtool in de tekentmodus om de begrenzing te tekenen. Ken een semi-transparant oppervlak toe aan de begrenzing om de onderliggende fluorescentiesignalen te kunnen zien en stilstaande beelden van de 3D-fluorescentiesignalen vast te leggen. Om snapshot-afbeeldingen van de 3D-film te maken, gebruikt u de animatiefunctie om een 3D-filmset-animatie te maken voor films bestaande uit 200 frames, geanimeerd met 15 frames per seconde.Sla elke opname op als een raw AVI-bestand en comprimeer de uiteindelijke AVI-video met VirtualDub-software of vergelijkbare software. Deze video toont 3D-beelden van nociceptieve intra-epidermale zenuwvezels. Dit eerste beeld toont PGP-positieve intra-epidermale zenuwvezels, groen gelabeld, die het totaal aan intra-epidermale zenuwvezels vertegenwoordigen, en tevens TrkA-positieve intra-epidermale zenuwvezels, rood gelabeld, die de nociceptieve intra-epidermale zenuwvezels vertegenwoordigen.En ten slotte een beeld dat PGP-positieve nociceptieve intra-epidermale zenuwvezels in een huidmonster van casus één demonstreert; de schaalbalk staat voor 20 microns. De volgende video toont 3D-beelden van axonale zwellingen in intra-epidermale zenuwvezels bij pijnlijke neuropathieën. Axonale zwellingen, aangegeven door pijlpunten, zijn zichtbaar langs de intra-epidermale zenuwvezels die met PGP zijn gelabeld met een groen signaal binnen de subdermale plexus.In een huidmonster van casus twee stelt de schaalbalk 10 microns voor. Deze 3D-afbeelding toont axonale vertakkingen in intra-epidermale zenuwvezels bij pijnlijke neuropathie. Axonale vertakkingen, aangegeven door pijlpunten, zijn zichtbaar langs de intra-epidermale zenuwvezels die met PGP zijn gelabeld met een groen signaal in een huidmonster van casus drie.De schaalbalk stelt 20 microns voor. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in vier dagen worden voltooid, met elke dag drie en een half uur voor immunohistochemie en 35 minuten per monster voor confocale beeldvorming en 3D-animatie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat weefsels correct moeten worden overgebracht en gemonteerd, waarbij voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om te voorkomen dat de monsterstalen scheuren of verscheuren na deze procedure. Andere methoden, zoals driedimensionale tric-analyse voor de beoordeling van cutane innovatie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden.Speelt de vertakking van abdominale zenuwvezels een belangrijke rol bij de ontwikkeling van pijnlijke neuropathie?

three-dimensional-imaging-nociceptive-intraepidermal-nerve-fibers

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een techniek wordt gepresenteerd voor de in-vivo collectie van interstitiële vloeistof monsters van weefsel relevante sites (hier, experimenteel ontstoken huid) voor het meten van biochemische bemiddelen pijn en ontsteking.

Mens in-vivo Bioassay voor de weefsel-specifieke meting van nociceptieve en ontstekingsmediatoren

Algoritmes het beoordelen van warmte en mechanische pijn drempels in experimenteel ontstoken huid van de menselijke proefpersonen worden weergegeven. De twee pijn het testen van paradigma's onafhankelijk van elkaar nociceptieve verwerking van onderzoeken door de twee grote perifere zenuw fiber populaties verzenden van pijn, dat wil zeggen, niet-gemyeliniseerde C-vezels en kleine gemyeliniseerde A-delta vezels.

Het bepalen van warmte en mechanische pijngrens in ontstoken huid van proefpersonen

Immunocytochemische identificatie van perifere sensorische zenuwvezel subtypes (en de detectie van eiwit expressie daarin) zijn de sleutel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan perifere sensatie. Hier beschrijven we methoden voor de bereiding van perifere / viscerale weefselmonsters, zoals huid en ledematen botten, voor specifieke immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels.

Tissue Voorbereiding en Immunokleuring van de muis sensorische zenuwvezels innerveren de huid en ledematen Bones

This video demonstrates a single-fiber recording of C-fiber nerve conduction in rats. An anesthetized rat is incised to expose the sciatic nerve, which provides sensory and motor supply to the lower limbs. The individual C-fibers are then exposed. Electrical stimulation is provided using stimulus electrodes implanted in the foot, and a response is recorded from a single nerve fiber.

In Vivo Single-Fiber Recording of Sciatic Nerve C-Fibers in Rats

Source: Hamid, H. S., et al. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (2017) This video demonstrates the method for visualizing nerve-specific mitochondria using three-dimensional imaging. It outlines the process of acquiring sequential scans of pre-labeled intraepidermal nerve fibers and generating 3D surface images to isolate and display mitochondria in relation to nerve structures.

Visualization of Mitochondria within Intraepidermal Nerve Fibers

Het protocol voor dynamische longitudinale beeldvorming en selectieve laser laesie van zenuwuiteinden in reporter transgene muizen wordt gepresenteerd.

In vivo twee-foton microscopie van de Single zenuwuiteinden in de huid

Zoogdierhuid bevat een divers scala aan structuren - zoals haarfollikels en zenuwuiteinden - die onderscheidend patronen van ruimtelijke organisatie vertonen. Het analyseren van de huid als een platte berg maakt gebruik van de 2-dimensionale geometrie van dit weefsel tot volledige dikte van hoge-resolutie afbeeldingen van de huid structuren te produceren.

Flat Mount beeldvorming van de huid van muizen en de toepassing ervan op de Analyse van Haarzakje Patterning en Sensorische Axon morfologie

Dit protocol maakt gebruik van driedimensionale (3D) beeldvorming en analyse technieken om te visualiseren en te kwantificeren van zenuw-specifieke mitochondriën. De technieken zijn van toepassing op andere situaties waar een fluorescent signaal wordt gebruikt voor het isoleren van een subset van gegevens uit een ander fluorescent signaal.

Driedimensionale beeldvorming en analyse van Mitochondria binnen menselijke Intraepidermal zenuwvezels

Single-Fiber opname is een effectieve elektrofysiologische techniek die toepasbaar is op de centrale en perifere zenuwstelsels. Samen met de voorbereiding van intact DRG met de bijgevoegde sciatische zenuw, het mechanisme van geleiding falen wordt onderzocht. Beide protocollen verbeteren het begrip van de relatie van het perifere zenuwstelsel met pijn.

Gebruik van in vivo single-Fiber opname en intact dorsale wortel ganglion met bijgevoegde Sciatische zenuw om het mechanisme van geleidings falen te onderzoeken

De dikte van weefselsecties beperkte de morfologische studie van de huidinternervatie. Het huidige protocol beschrijft een unieke weefselzuiveringstechniek om cutane zenuwvezels te visualiseren in dikke weefselsecties van 300 μm onder confocale microscopie.

Het demonstreren van harige en glabreuze huid innervatie in een 3D-patroon met behulp van meerdere fluorescerende kleuring en weefselzuiveringsbenaderingen

Deze studie presenteert een in vivo twee-foton beeldvormingsbenadering om de structuren van laag-drempel mechanoreceptor (LTMR) axonterminalen in de voorpoothuid van muizen te visualiseren. Met behulp van herhaalde, hoogresolutiebeeldvorming van individuele axonen biedt deze methode een nieuw platform voor het bestuderen van de structuur en functie van het cutane sensorische circuit tijdens de ontwikkeling en bij volwassenen.

Intravitale tweefotonbeeldvorming van aanrakingssensorische axonmorfologie in muizenhuid

Leer driedimensionale beeldvorming van nociceptieve intraepidermale zenuwvezels in menselijke huidbiopten voor neuropathieonderzoek. Deze methode onthult morfologische veranderingen bij pijnlijke neuropathieën.

Driedimensionale beeldvorming van Nociceptieve Intraepidermal zenuwvezels in Menselijke huid Biopsieën

Meer video's verkennen