Name: Een In vitro Model te Heterogeniteit van Human Macrophage Differentiatie en Polarisatie Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Leer een betrouwbaar in vitro model om monocyt-afgeleide macrofagen te genereren uit menselijk perifeer bloed via dichtheidsgradiënt centrifugatie en negatieve bead isolatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Nadine Wambsganss voor een uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) en deels door een subsidie ​​van het Innovatiefonds FRONTIER (Universiteit van Heidelberg) naar CAG

1. Protocol <ol><li> Buffers Bereid als volgt: <ol><li> Bereid buffer voor PBMC isolatie: &quot;Was buffer&quot; = 0,02% EDTA in PBS (gebruik 0,5 M EDTA). </li><li> Bereid buffer voor monocyt isolatie: &quot;MACS spoelbuffer&quot; = 0,5% BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 pl) + PBS (50 ml). Degas de buffer. </li><li> Bereid buffer voor FACS kleuring en opslag van cellen: &quot;FACS buffer&quot; = 10% FCS in PBS en &quot;fixatie buffer&quot; = 1% PFA in PBS. </li></ol></li><li> Trek 30 ml bloed uit een ader onderarm. Gebruik EDTA als antistollingsmiddel. </li><li> Isoleer PBMC (histopaque) als volgt: <ol><li> Bereid twee steriele 50 ml buizen (geen poly-styreen). </li><li> Verdunnen het bloed van stap 2 met PBS 01:01. </li><li> Voeg 25 ml histopaque + 25 ml bloed / PBS per tube. Zorg ervoor dat histopaque en bloed gaan niet samen. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder rem. </li><li> Aspireren plasma en gooi het weg. </li><li> Aspireren ondoorzichtige interface en pipet in schone 50 ml bade. </li><li> Voeg 20 ml van 0,02% EDTA in PBS. </li><li> Centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Gooi supernatant. </li><li> Voeg 10 ml van 0,02% EDTA in PBS. </li></ol></li><li> Telling cellen als volgt: <ol><li> Meng goed door vortexen gedurende 10 sec. </li><li> Neem 200 pi celsuspensie + 300 pi 0,02% EDTA in PBS + 500 pi van trypan blauw (200-500 cellen/10 pleinen, anders verandert verdunningsfactor). </li></ol></li><li> Voer negatieve isolatie van monocyten als volgt: <ol><li> Centrifugeer cellen verkregen in stap 3.10 gedurende 10 min, 120 x g. Gooi supernatant. </li><li> Wassen celpellet 2x met 10 ml PBS + 0,02% EDTA en centrifugeer gedurende 10 min, 120 x g. </li><li> Voeg 9 ml steriel water voor 3 seconden, voeg 1 ml 10X PBS. </li><li> Nogmaals wassen met PBS + 0,02% EDTA en centrifugeer 10 min, 120 x g. </li><li> Telling tijdens centrifugeren. </li><li> Verdunnen EasySep buffer bij 5 x 10 7 / ml. </li><li> Voeg 50 ul / ml monocyten verrijking pikstaart. </li><li> Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Vortex kralen voor 30 sec. </li><li> Voeg 50 ul / ml korrels. </li><li> Incubeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Vul met EasySep buffer volume van 2,5 ml voltooien. De oplossing lijkt nu bruinachtig. </li><li> Zet in magneet. </li><li> Wacht 2,5 min bij kamertemperatuur. Gedurende deze tijd niet-monocytcellen gebonden aan de magnetische kraal zal verhuizen naar de buiswand en plakken daar. </li><li> Giet buffer met niet-bindende monocyten in de frisse steriele buis. Deze oplossing ziet er witachtig. </li><li> Was eenmaal met PBS + 0,02% EDTA en centrifugeer gedurende 10 min, 120 x g. </li></ol></li><li> Cellaag in een plastic schaal of meerwandige plaat bij een dichtheid van 0,5 x 10 6 / cm 2. Voeg 1 ml kweekmedium / 1 x 10 6 cellen. </li><li> Cultuur cellen onder omstandigheden van belang zijn voor 6-14 dagen. </li><li> Wijzig media na 3 dagen door het vervangen van 50% van de media met verse media (zie tabel 1 voor details). </li><li>Na zes dagen oogst cellen voor mRNA isolatie, flowcytometrie, Western blotting, etc. </li></ol>

<ol><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+plasticity+of+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes.</a> European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Ingersoll, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene+expression+profiles+between+human+and+mouse+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets.</a> Blood. 115, 10-19 (2010).</li>
<li>Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+aldose+reductase+during+foam+cell+formation+as+possible+link+among+diabetes%2C+hyperlipidemia%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).</li>
<li>Gleissner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCL4+downregulates+the+atheroprotective+hemoglobin+receptor+CD163+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages.</a> Circ. Res. , (2009).</li>
<li>Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXC+chemokine+ligand+4+induces+a+unique+transcriptome+in+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages.</a> J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization%3A+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li>
<li>Verreck, F. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+il-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+il-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+%28myco%29bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li>
<li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> PLoS One. 7, e42656(2012).</li>
<li>Boyle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+intraplaque+hemorrhage+evokes+a+novel+atheroprotective+macrophage+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype.</a> American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).</li>
<li>Cho, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dendritic+cell-like+phenotype+in+macrophages+during+foam+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation.</a> Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).</li>
<li>Vogt, G., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+human+macrophages+with+enhanced+antimycobacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).</li>
<li>Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+low+density+lipoprotein+exposure+alters+the+transcriptional+response+of+macrophages+to+inflammatory+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).</li>
<li>Qin, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).</li>
<li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+pma-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5, e8668(2010).</li>
<li>Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWahl%2C+LM+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Martín-Fuentes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+variation+of+scavenger+receptor+expression+in+human+macrophages+with+oxidized+low-density+lipoprotein+is+associated+with+a+differential+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response.</a> The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hoeven niet te eventuele belangenconflicten bekendmaken.

Monocyt-afgeleide macrofagen vertegenwoordigen de belangrijkste celtype van het aangeboren immuunsysteem. Zij spelen een belangrijke rol in vele ontstekingsziekten waaronder atherosclerose of kanker 2. Aldus bestuderen macrofaag biologie is essentieel voor het vergroten van onze kennis over de pathofysiologie van vele ziekten en ontwikkeling van nieuwe therapieën mogelijk. Vele studies toepassing van muismodellen overexpressie of ontbreken bepaalde genen van belang. Bij monocyt-af...

Monocyt-afgeleide macrofagen een belangrijke cellulaire component van het aangeboren immuunsysteem en bijdragen aan vele acute of chronische ontstekingsprocessen 1. Macrofagen spelen een belangrijke rol in vele inflammatoire ziekten zoals atherosclerose of kanker 2. Macrofagen een hoge plasticiteit en kunnen verschillende fenotypes afhankelijk van de plaatselijke micromilieu 3 nemen. Aldus bestuderen macrofaag differentiatie en heterogeniteit is essentieel voor het verhogen van de kennis van de pathofysiologie van vele ziekten en identificatie van nieuwe therapeutische doelwitten en ontwikkeling van nieuwe therapieën mogelijk. In veel gevallen worden muismodellen gebruikt om de pathofysiologie van bepaalde ziektebeelden. Echter, het bestuderen macrofaag biologie gebruikt muismodellen vergezeld door verscheidene tekortkomingen: (1) Het aantal leukocyten deelverzameling getallen (bijvoorbeeld monocyten en granulocyten) in raHeral bloed van muizen of mensen verschilt sterk suggereert verschillende rollen van monocyten in muizen en menselijke pathofysiologie. (2) Er bestaan ​​aanzienlijke verschillen in genexpressie tussen muis en mens perifere bloed monocyten suggereert substantiële verschillen in hun functie tijdens gezondheid en ziekte 4. (3) een aantal markers die worden gebruikt om murine monocyten en macrofagen (F4/80, LYC, etc.) Identificeren bestaat niet in humane myeloïde cellen, die de overdracht van de bevindingen in muismodellen de menselijke situatie nogal moeilijk. Dus, om ons inzicht in macrofaag differentiatie en ongelijkmatig menselijke ziekte te verhogen, moeten we gebruik van modellen werken met menselijke macrofagen maken. Daarom beschrijven we hier een model van menselijke primaire macrofagen generatie die gemakkelijk te gebruiken en maakt studie van humane monocyt-afgeleide macrofagen in vitro onder verschillende omstandigheden die leiden tot verschillende macrofaag posatie types. In verscheidene studies hebben we de in vitro model van monocyt-afgeleide primaire humane macrofagen macrofaag biologie en het potentiële relevantie voor de menselijke atherosclerose 5-7 analyseren. Hoewel niet volledig experimenten met dieren of menselijke weefsels verkregen post-mortem vervangen, de hier beschreven model maakt de identificatie en validatie van de ziekte mechanismen en therapeutische doelwitten die zeer relevant zijn voor verschillende ziekten bij de mens kunnen zijn.

<table><tbody><tr><td>50 ml centrifuge tube (steriele)</td><td>Fisher</td><td>055398</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1X), vloeibaar (geen calcium of magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-8806</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Fisher</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Macrophage-SFM (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P-4458</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td></td></tr><tr><td>menselijke M-CSF 10 &mu;g</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Plates 6-well</td><td>Fisher</td><td>07-200-80</td><td></td></tr></tbody></table>

een<em&gt; in vitro</em&gt; model te heterogeniteit van human macrophage differentiatie en polarisatie studie

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyt-afgeleide macrofagen een belangrijke celtype van het aangeboren immuunsysteem. Muismodellen bestuderen macrofaag biologie lijden de fenotypische en functionele verschillen tussen muizen en humane monocyt-afgeleide macrofagen. Daarom beschrijven we hier een in vitro model voor primaire humane macrofagen produceren en te bestuderen. Kort na dichtheidsgradiënt centrifugering van perifeer bloed getrokken uit een onderarm ader, monocyten geïsoleerd uit perifeer bloed mononucleaire cellen met negatieve magnetische bead isolatie. De monocyten worden vervolgens gekweekt gedurende zes dagen in bepaalde omstandigheden verschillende macrofaag differentiatie of polarisatie induceren. Het model is gemakkelijk te gebruiken en omzeilt de problemen veroorzaakt door species-specifieke verschillen tussen muis en mens. Bovendien is dichter bij de in vivo omstandigheden dan het gebruik van geïmmortaliseerde cellijnen. Kortom, de hier beschreven model is geschikt om te studeren macrophage biologie, identificeren ziektemechanismen en nieuwe therapeutische doelwitten. Hoewel niet volledig experimenten met dieren of menselijke weefsels verkregen post-mortem vervangen, de hier beschreven model maakt de identificatie en validatie van de ziekte mechanismen en therapeutische doelwitten die zeer relevant zijn voor verschillende ziekten bij de mens kunnen zijn.

Met de hierboven beschreven protocol, we routinematig 25,1 x 10 6 ± 2,2 x 10 6 monocytes/100 ml bloed (gemiddelde ± standaard fout van 26 onafhankelijke experimenten, figuur 1A) te verkrijgen. Monocyt zuiverheid zoals bepaald door flow cytometrische kleuring voor CD14 is routinematig meer dan 95% (97.1 ± 0.4%, gemiddelde ± standaard fout van 3 onafhankelijke experimenten, figuur 1B). Levensvatbaarheid van vers geïsoleerde monocyten cel zoals bepaald door trypan bla...

Monocyt-afgeleide macrofagen belangrijke cellen van het aangeboren immuunsysteem. Hier beschrijven we een eenvoudig te gebruiken<em&gt; In vitro</em&gt; Model om deze cellen te genereren. Met behulp gradiëntcentrifugatie, negatieve kraal isolatie en specifieke cel kweekomstandigheden, kan monocyt-afgeleide macrofagen worden gegenereerd voor fenotypische en functionele studies.

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Model te Heterogeniteit van Human Macrophage Differentiatie en Polarisatie Studie

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om monocyten te isoleren uit menselijk perifeer bloed en ze te differentiëren naar verschillende macrofaag-polarisatietypen. Dit wordt bereikt door eerst humane perifere mononucleaire bloedcellen te isoleren door middel van dichtheidsgradientcentrifugering. Als tweede stap wordt negatieve kraalisolatie uitgevoerd om zuivere CD 14 positieve monocyten te verkrijgen.Vervolgens worden monocyten gekweekt onder specifieke omstandigheden om specifiek gepolariseerde macrofagen te induceren. Uiteindelijk kan de differentiële expressie van macrofaag-polarisatiemarkers als reactie op hun kweekomstandigheden worden bepaald door kwantitatieve PCR. Deze methode kan helpen om de differentiatie van macrofagen naar verschillende polarisatietypen te onderscheiden.Een functie die uiterst belangrijk is bij ontstekingsziekten zoals atherosclerose. Na het afnemen van 30 milliliter vol bloed uit de armvena van een vrijwilliger, verdeel het bloed gelijkmatig in twee niet-polystyreen 50 milliliter conische buisjes. Verdun vervolgens het bloed in elke buis met 10 milliliter PBS.Voeg vervolgens 25 milliliter histo pack toe aan de 25 milliliter vol bloed en PBS in elke buis, zorg ervoor dat de histo pack en het bloed niet mengen. Centrifugeer vervolgens de buisjes gedurende 30 minuten bij 400 Gs en kamertemperatuur zonder pauze. Na het spinnen aspireert u eerst de plasmalaag en vervolgens brengt u de ondoorzichtige interfacelaag over in een nieuwe 50 milliliter buis.Was de cellen van de interface in 20 milliliter PBS plus CDTA gedurende vijf minuten bij 250 Gs en vier graden Celsius. Gooi vervolgens de supernatant weg, suspendeer de pellet in 10 milliliter PBS plus CDTA en meng de cellen goed door 10 seconden te vortexen. Verdun nu 200 microliter van de celsuspensie in 300 microliter PBS plus EDTA, en 500 microliter triam blauw.Om ongeveer 200 tot 500 cellen per 10 vierkanten te krijgen en een hemo cytometer te beginnen, begint u met de negatieve isolatie door de cellen drie keer gedurende 10 minuten bij 120 Gs naar beneden te centrifugeren. Na de tweede wassing suspenderen we de pellet in negen milliliter steriel water gedurende drie seconden. Voeg vervolgens een milliliter van 10 XPBS toe na het wassen en tel de cellen nog een keer, verdun ze in easy set buffer bij vijf keer 10 van de zeven cellen per milliliter. Incubeer nu de cellen gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius in 50 microliter per milliliter monocytenverrijkingscocktail.Gedurende de laatste minuut van de incubatie, vortex de cept-monocytenverrijkingskralen gedurende 30 seconden. Voeg vervolgens 50 microliter per milliliter van de kralen toe aan de cellen en incubeer de kraal-celsuspensie gedurende nog eens vijf minuten. Na de tweede incubatie, brengt u het celsuspensievolume op 2,5 milliliter.Met meer eep buffer zal de oplossing nu een bruinachtige kleur krijgen. Plaats vervolgens de buis gedurende twee en een half minuut in een eep magneet bij kamertemperatuur. Nadat de bead-gebonden cellen de kans hebben gehad om te plakken, giet u de buffer met de niet-bindende monocyten in een nieuwe steriele buis.De oplossing krijgt nu een witachtige kleur nadat de niet-gebonden cellen eenmaal met PBS plus EDTA zijn gewassen, breng de cellen over in een multi-well plaat, voeg vervolgens een milliliter kweekmedium toe per een maal 10 tot de zes cellen naar de kweekplaat. Kweek tenslotte de cellen gedurende zes dagen onder de gewenste experimentele omstandigheden om macrofaagdifferentiatie te induceren. Vervang de helft van het medium na drie dagen met vers medium na zes dagen.Verzamel de cellen voor de gewenste experimentele analyse. Met behulp van het hierboven beschreven protocol worden ongeveer 25 maal 10 van de zes monocyten routinematig verkregen uit 100 milliliter bloed. De zuiverheid van monocyten zoals bepaald door flowcytometrische kleuring voor CD 14 is routinematig groter dan 95% wanneer ze voor het eerst aan de kweek worden toegevoegd. De monocyten zijn aanvankelijk rond en drijven binnen enkele uren.Ze hechten zich echter, waardoor ze er na zes dagen uitzien als een gebakken ei of een spindelvormige verschijning. In cultuur met alleen MCSF of met toevoeging van geoxideerde LDL gedurende de laatste 24 uur of ongeveer 80% van de cellen die niet zijn blootgesteld aan geoxideerde LDL zijn levensvatbaar zoals bepaald door propidiumjodide. Behandeling met geoxideerde LDL resulteert daarentegen in ongeveer 70% celviabiliteit na zes dagen van kweek.Met MCSF-flow toont cytometrische analyse aan dat terwijl de cellen het leukocytenmarker CD 45 ro blijven uitdrukken, ze de monocytenmarker CD 14 downregelen. Afhankelijk van de specifieke omstandigheden die macrofaagpolarisatie kunnen induceren tijdens celkweek, zijn aanvullende markers nodig om succesvolle polarisatie te waarborgen. Specifieke omstandigheden kunnen macrofaagpolarisatie induceren.M1-gepolariseerde macrofagen drukken bijvoorbeeld typische markers uit zoals IL zes en TNF alfa, terwijl M twee-gepolariseerde macrofagen CD 36 en CD 2 0 6 uitdrukken. Macrofagen kunnen verder worden bestudeerd in functionele experimenten. Bijvoorbeeld, de opname van geoxideerde LDL kan worden bestudeerd met behulp van fluorescent gelabeld LDL. In dit experiment werden de cellen gedurende vier uur blootgesteld aan 10 microgram per milliliter van DII-gelabeld geoxideerd LDL, en de kernen werden opnieuw gekleurd met dpi.De histogram toont de flowcytometrische meting van de DII geoxideerde LDL-opname door MCSF-geïnduceerde macrofagen, waarbij het stevige grijze histogram de onbehandelde controlecellen voorstelt en het zwarte open histogram de geoxideerde LDL-behandelde macrofagen voorstelt. Na de ontwikkeling. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om differentiatie en heterogeniteit van humane macrofagen te bestuderen.Hierdoor kunnen ze ontstekingsziekten zoals atherosclerose bestuderen om nieuwe ziektemechanismen en nieuwe therapeutische doelwitten te identificeren.

an-vitro-model-to-study-heterogeneity-human-macrophage

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the priming of primary monocytes into macrophages. Primary human monocytes can be isolated and differentiated to an M1-like pro-inflammatory phenotype using the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) or to an M2-like anti-inflammatory phenotype using the macrophage colony-stimulating factor (M-CSF).

In Vitro Culture and Differentiation of Primary Monocytes into Macrophages

In this video, we demonstrate a procedure to induce the differentiation and polarization of peripheral blood-derived monocytes into M1 or M2 macrophages. Incubation with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, lipopolysaccharide, and interferon‐gamma yields pro-inflammatory M1 macrophages, while incubation with macrophage colony-stimulating factor and interleukin-4 induces anti-inflammatory M2 macrophage production.

Differentiation and Polarization of Monocyte-Derived Cells into Macrophage-Like Cells

Het artikel beschrijft een gemakkelijk gemakkelijk...

Onderzoek van Macrophage Polarisatie behulp beenmerg afgeleide Macrofagen

Wij presenteren een eenvoudig en efficiënt protocol voor het genereren van humane macrofagen. Buffy coats worden door dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie en geïsoleerde monocyten worden vervolgens gedifferentieerd macrofagen in met Teflon beklede celkweek zakken. Dit maximaliseert macrofaag opbrengst en vergemakkelijkt cel oogsten voor volgende experimenten.

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

Hier is een protocol voor het opsporen van macrofaag extracellulaire trap (met) productie in levende celcultuur met behulp van microscopie en fluorescentie kleuring. Dit protocol kan verder worden uitgebreid om specifieke MET eiwit markers te onderzoeken door immunofluorescentie kleuring.

In vitro stimulatie en visualisatie van extracellulaire val afgifte in gedifferentieerde humane monocyte-afgeleide macrofagen

Dit protocol beschrijft de robuuste generatie van macrofagen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, en methoden voor hun latere karakterisering. Celoppervlaktemarkerexpressie, genexpressie en functionele tests worden gebruikt om het fenotype en de functie van deze iPSC-afgeleide macrofagen te beoordelen.

Productie en karakterisering van menselijke macrofagen uit pluripotente stamcellen

Dit protocol biedt een methode om Mycobacterium tuberculosis infectie in menselijke M1- of M2-gepolariseerde macrofagen te bestuderen op basis van differentiatie van perifere bloed-monocyten naar macrofaag-achtige cellen die zijn geïnfecteerd met de GFP-gelabelde virulente stam H37Rv, en geanalyseerd met flowcytometrie met behulp van een 10-kleurenpaneel inclusief expressie van geselecteerde M1/M2 markers.

Polarisatie van M1 en M2 humane monocyt-afgeleide cellen en analyse met flowcytometrie bij mycobacterium tuberculosis-infectie

M2-achtige tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) zijn geassocieerd met tumorprogressie en slechte prognose bij kanker. Dit protocol dient als een gedetailleerde gids om THP-1 monocytachtige cellen binnen 14 dagen reproduceerbaar te differentiëren en te polariseren in M2-achtige macrofagen. Dit model is de basis om de ontstekingsremmende effecten van TAM in de tumormicro-omgeving te onderzoeken.

Macrofaagdifferentiatie en polarisatie in een M2-achtig fenotype met behulp van een menselijke monocytachtige THP-1 leukemie cellijn

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van het immunomodulerende potentieel van implantaatoppervlakken in vitro, met als doel de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de huidige protocollen te verbeteren en verder onderzoek te bevorderen. Secretoire cytokineprofielen, mRNA-expressie en markers op het celoppervlak werden gecontroleerd met behulp van van bloedmonocyten afgeleide macrofagen om macrofaagpolarisatie te onderzoeken die op titanium werd gekweekt.

Polarisatie en karakterisering van M1 en M2 humane monocyt-afgeleide macrofagen op implantaatoppervlakken 

Monocyten en macrofagen zijn zeer plastische en herprogrammeerbare immuuncellen die cruciaal zijn voor gezondheid en ziekte. Ze detecteren en reageren op een breed scala aan stimuli door specifieke differentiatieprogramma's en fenotypes aan te nemen. We hebben een in-vitro model gestandaardiseerd om macrofagen polarisatie en herprogrammering te bestuderen, wat een waardevol hulpmiddel voor onderzoek biedt.

Reprogrammeringsmodel van humane monocyte-afgeleide macrofagen voor in-vitro analyses

Leer een betrouwbaar in vitro model om monocyt-afgeleide macrofagen te genereren uit menselijk perifeer bloed via dichtheidsgradiënt centrifugatie en negatieve bead isolatie.

Een

Meer video's verkennen