Een

Het algemene doel van het volgende experiment is om monocyten te isoleren uit menselijk perifeer bloed en ze te differentiëren naar verschillende macrofaag-polarisatietypen. Dit wordt bereikt door eerst humane perifere mononucleaire bloedcellen te isoleren door middel van dichtheidsgradientcentrifugering. Als tweede stap wordt negatieve kraalisolatie uitgevoerd om zuivere CD 14 positieve monocyten te verkrijgen.

Vervolgens worden monocyten gekweekt onder specifieke omstandigheden om specifiek gepolariseerde macrofagen te induceren. Uiteindelijk kan de differentiële expressie van macrofaag-polarisatiemarkers als reactie op hun kweekomstandigheden worden bepaald door kwantitatieve PCR. Deze methode kan helpen om de differentiatie van macrofagen naar verschillende polarisatietypen te onderscheiden.

Een functie die uiterst belangrijk is bij ontstekingsziekten zoals atherosclerose. Na het afnemen van 30 milliliter vol bloed uit de armvena van een vrijwilliger, verdeel het bloed gelijkmatig in twee niet-polystyreen 50 milliliter conische buisjes. Verdun vervolgens het bloed in elke buis met 10 milliliter PBS.

Voeg vervolgens 25 milliliter histo pack toe aan de 25 milliliter vol bloed en PBS in elke buis, zorg ervoor dat de histo pack en het bloed niet mengen. Centrifugeer vervolgens de buisjes gedurende 30 minuten bij 400 Gs en kamertemperatuur zonder pauze. Na het spinnen aspireert u eerst de plasmalaag en vervolgens brengt u de ondoorzichtige interfacelaag over in een nieuwe 50 milliliter buis.

Was de cellen van de interface in 20 milliliter PBS plus CDTA gedurende vijf minuten bij 250 Gs en vier graden Celsius. Gooi vervolgens de supernatant weg, suspendeer de pellet in 10 milliliter PBS plus CDTA en meng de cellen goed door 10 seconden te vortexen. Verdun nu 200 microliter van de celsuspensie in 300 microliter PBS plus EDTA, en 500 microliter triam blauw.

Om ongeveer 200 tot 500 cellen per 10 vierkanten te krijgen en een hemo cytometer te beginnen, begint u met de negatieve isolatie door de cellen drie keer gedurende 10 minuten bij 120 Gs naar beneden te centrifugeren. Na de tweede wassing suspenderen we de pellet in negen milliliter steriel water gedurende drie seconden. Voeg vervolgens een milliliter van 10 XPBS toe na het wassen en tel de cellen nog een keer, verdun ze in easy set buffer bij vijf keer 10 van de zeven cellen per milliliter. Incubeer nu de cellen gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius in 50 microliter per milliliter monocytenverrijkingscocktail.

Gedurende de laatste minuut van de incubatie, vortex de cept-monocytenverrijkingskralen gedurende 30 seconden. Voeg vervolgens 50 microliter per milliliter van de kralen toe aan de cellen en incubeer de kraal-celsuspensie gedurende nog eens vijf minuten. Na de tweede incubatie, brengt u het celsuspensievolume op 2,5 milliliter.

Met meer eep buffer zal de oplossing nu een bruinachtige kleur krijgen. Plaats vervolgens de buis gedurende twee en een half minuut in een eep magneet bij kamertemperatuur. Nadat de bead-gebonden cellen de kans hebben gehad om te plakken, giet u de buffer met de niet-bindende monocyten in een nieuwe steriele buis.

De oplossing krijgt nu een witachtige kleur nadat de niet-gebonden cellen eenmaal met PBS plus EDTA zijn gewassen, breng de cellen over in een multi-well plaat, voeg vervolgens een milliliter kweekmedium toe per een maal 10 tot de zes cellen naar de kweekplaat. Kweek tenslotte de cellen gedurende zes dagen onder de gewenste experimentele omstandigheden om macrofaagdifferentiatie te induceren. Vervang de helft van het medium na drie dagen met vers medium na zes dagen.

Verzamel de cellen voor de gewenste experimentele analyse. Met behulp van het hierboven beschreven protocol worden ongeveer 25 maal 10 van de zes monocyten routinematig verkregen uit 100 milliliter bloed. De zuiverheid van monocyten zoals bepaald door flowcytometrische kleuring voor CD 14 is routinematig groter dan 95% wanneer ze voor het eerst aan de kweek worden toegevoegd. De monocyten zijn aanvankelijk rond en drijven binnen enkele uren.

Ze hechten zich echter, waardoor ze er na zes dagen uitzien als een gebakken ei of een spindelvormige verschijning. In cultuur met alleen MCSF of met toevoeging van geoxideerde LDL gedurende de laatste 24 uur of ongeveer 80% van de cellen die niet zijn blootgesteld aan geoxideerde LDL zijn levensvatbaar zoals bepaald door propidiumjodide. Behandeling met geoxideerde LDL resulteert daarentegen in ongeveer 70% celviabiliteit na zes dagen van kweek.

Met MCSF-flow toont cytometrische analyse aan dat terwijl de cellen het leukocytenmarker CD 45 ro blijven uitdrukken, ze de monocytenmarker CD 14 downregelen. Afhankelijk van de specifieke omstandigheden die macrofaagpolarisatie kunnen induceren tijdens celkweek, zijn aanvullende markers nodig om succesvolle polarisatie te waarborgen. Specifieke omstandigheden kunnen macrofaagpolarisatie induceren.

M1-gepolariseerde macrofagen drukken bijvoorbeeld typische markers uit zoals IL zes en TNF alfa, terwijl M twee-gepolariseerde macrofagen CD 36 en CD 2 0 6 uitdrukken. Macrofagen kunnen verder worden bestudeerd in functionele experimenten. Bijvoorbeeld, de opname van geoxideerde LDL kan worden bestudeerd met behulp van fluorescent gelabeld LDL. In dit experiment werden de cellen gedurende vier uur blootgesteld aan 10 microgram per milliliter van DII-gelabeld geoxideerd LDL, en de kernen werden opnieuw gekleurd met dpi.

De histogram toont de flowcytometrische meting van de DII geoxideerde LDL-opname door MCSF-geïnduceerde macrofagen, waarbij het stevige grijze histogram de onbehandelde controlecellen voorstelt en het zwarte open histogram de geoxideerde LDL-behandelde macrofagen voorstelt. Na de ontwikkeling. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om differentiatie en heterogeniteit van humane macrofagen te bestuderen.

Hierdoor kunnen ze ontstekingsziekten zoals atherosclerose bestuderen om nieuwe ziektemechanismen en nieuwe therapeutische doelwitten te identificeren.