Name: Assemblage van Nucleosomale Arrays van Recombinant kernhistonen en Nucleosome Positioning DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Leer hoe je nucleosomale arrays assembleert met recombinante kernhistonen en positionerende DNA-sequenties. Deze biochemische methode combineert dialyse, chromatografie en sedimentatie-velociteit om chromatinestructuur in vitro te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​GM45916 en GM66834 om JCH en een beurs van de International Rett Syndroom Stichting AK Dit werk werd ondersteund door NIH verlenen GM088409 en Howard Hughes Medical Institute bijdragen aan KL

1. Assemblage van Recombinant kernhistonen in octameren Achtergrond: De eerste stap in nucleosomale scala reconstitutie is om inheemse kern histon octameren uit gevriesdroogde recombinant kernhistonen bereiden. Histon-eiwitten worden gecombineerd in gelijke molaire hoeveelheden en in histon octameren samengesteld door dialyseren de monsters uit een denaturerende buffer in hervouwingsbuffer. <ol><li> Zuiver en lyofiliseren recombinant kernhistonen (H2A, H2B, H3, H4) beschreven 13. </li><li> Los ongeveer 5 mg elk gelyofiliseerd kern histon in 3 ml ontvouwen buffer (6 M guanidinium HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM DTT). Laat elk aliquot te ontbinden gedurende ten minste een uur. Zorg dat er geen eiwit blijft aan de zijkanten van de houder. </li><li> Meet de absorptie van elk histon bij 276 nm ontvouwen buffer als referentie. </li><li> Bereken de molariteit van elk histon met behulp van hun extinctiecoëfficiënten (zie tabel 1 </strong&gt; voor Xenopus histon extinctiecoëfficiënten). Vergelijk de absorptie bepaald concentratie van histon het gevriesdroogde drooggewicht en schatten als de meerderheid van het eiwit opgelost. </li><li> Bepaal welke histon je de minste mol, omdat dit het beperken van het aantal mol voor alle histonen zal zijn. </li><li> Combineer de histonen in gelijke molaire hoeveelheden en verdun met ontvouwen buffer tot een eindconcentratie van 1 mg / ml. </li><li> Plaats het monster in 6-8 kDa MWCO dialysebuis. Sluit de buis en plaats in 2 L koude hervouwingsbuffer (2 M NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 5 mM β-mercapto-ethanol). </li><li> Dialyseer het monster gedurende 18 uur bij 4 ° C onder roeren. Zorg ervoor dat de dialysebuis vrij en krachtig draaien, of anders de histonen kan neerslaan. </li><li> Veranderen twee keer in de 18 uur periode (dwz verander de hervouwingsbuffer ongeveer elke 6 uur gaar worden) de dialysebuffer. Zelfs als neerslag wordt gevormd niet weggooienhet monster, kunnen sommige octameer worden teruggewonnen, hoewel de opbrengst wordt verlaagd. </li></ol> Opmerking: Zie stap 2,1-2,2 om kolomequilibratiebuffer bereiden op de volgende dag. 2. Zuivering van Histone octameren by Size Exclusion Chromatography Achtergrond: Na het sluiten van punt 1, zal monsters histon octameren evenals andere histon complexen zoals aggregaten, H3/H4 tetramers en H2A/H2B dimeren bevatten. Histon octameren weg zal uit deze andere complexen met grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) gezuiverd. <ol><li> Sluit een HiLoad 16/60 Superdex200 16/60 (S200) kolom om een ​​FPLC systeem. Zorg ervoor dat geen luchtbellen in het systeem. </li><li> Maak de kolom S200 met 0,2 um gefilterd water. Gebruik een stroomsnelheid van 0,3 ml / min en stel een tegendruk grens van 0,5 MPa. Zorg ervoor dat je genoeg water en laat de kolom om &#39;s nachts te reinigen. </li><li> Equilibreer de S200 kolom en sample loop van de FPLC-hervouwingsbuffer. Gebruik 1 L van 0,2 urn gefiltreerd hervouwingsbuffer. Flow hervouwingsbuffer door de kolom met een snelheid van 1 ml / min en een maximale druk van 0,5 MPa gedurende ongeveer 2 uur. </li><li> Equilibreer een Vivaspin centrifugale concentrator (50 kDa MWCO) met 1 ml hervouwingsbuffer. Verwijder het monster uit dialysebuizen en centrifugeer het monster bij 4 ° C om eventuele precipitaten te verwijderen. Pipetteer het monster supernatans in de concentrator. Concentreer het monster tot een volume van ongeveer 500 ul. </li><li> Verwijder de geconcentreerde octameer monster naar een nieuwe container en spoel de concentrator met 1 ml hervouwingsbuffer. Concentreer de spoeling omlaag naar 500 pi, en voeg deze toe aan de octameer monster. Dit helpt om eventuele octameer nog in de concentrator redden. </li><li> Spin het monster in een 1,5 ml microcentrifuge buis gedurende 5 min bij 10.000 rpm bij 4 ° C. Gebruik de bovenstaande vloeistof en over te dragen aan een nieuwe buis. Dit helpt om eventueel aanwezig neerslag te verwijderen voordat u het monster op de FPLC. </li><li> Plaats het monster in de kolom S200. Plaats maximaal 1,5 ml totaal volume of 15 mg octameer in een zuivering. </li><li> Elueer het monster met behulp van vers gemaakte hervouwingsbuffer. Gebruik een stroomsnelheid van 1 ml / min en een tegendruk grens van 0,5 MPa. Gebruik twee kolomvolumes (400 ml) hervouwingsbuffer en laat 2 ml fracties. Controleer de absorptie bij 280 nm tijdens elutie. De verschillende soorten zullen elueren in volgorde van afnemende grootte. Histon aggregaten meestal elueren bij ongeveer 45 ml, octameer ongeveer 65 ml en dimeer bij ongeveer 84 ml (figuur 1). </li><li> Analyseer de elutiefracties van belangrijke pieken door het uitvoeren van steekproeven op een 18-20% SDS-PAGE. Fracties die gezuiverde octameren moeten gelijke molaire hoeveelheden van de vier kern histon-eiwitten (Figuur 1). </li><li> Zwembad de fracties die gezuiverd octameren bevatten, en concentreer tot ≤ 15 mg / ml met een Vivaspin centrifugaal filter. Als links verdund, kan octameren distantiëren into H2A/H2B dimeren en H3/H4 tetramers. </li><li> Bepaal de octameer concentratie door meting van de absorptie bij 280 nm en berekenen met de extinctiecoëfficiënt van tabel 1. </li><li> Histon octameren kunnen op korte termijn worden bewaard in hervouwingsbuffer bij 4 ° C. Indien opgeslagen termijn zal de octameren stabieler zijn bij -20 ° C en 50% glycerol oplossing. Octameren opgeslagen in glycerol moet worden gedialyseerd in verse hervouwingsbuffer voordat extinctiemetingen en gebruik in nucleosomale reeks reconstructies. </li></ol> 3. Reconstitutie van Nucleosomale arrays van DNA en gezuiverd octameren Rationale: Reconstructie van nucleosomale arrays vereist dat histon octameren en template-DNA worden gecombineerd op specifieke molaire verhoudingen. Mengsels van DNA en histon octameren in 2 M NaCl worden stap gedialyseerd in buffer afnemende ionsterkte. Een geleidelijke overgang naar lagere zout zorgt voor een goede vorming van nucleosomen. Het verkrijgen van nucleosomal arrays met het gewenste niveau van histon octameer verzadiging van het template-DNA vereist kleinschalige proef reconstructies, gevolgd door een grootschalige preparatieve reconstitutie. De door de kleine omvang reconstructies geschikte omstandigheden worden gebruikt om preparatieve reconstitutie leiden. <ol><li> Zuiver tandem herhaalde positionering nucleosoom DNA als beschreven 4,12. Kort isoleren het plasmide DNA met behulp van een Qiagen GigaPrep kit of een soortgelijk product. Set-up van een restrictie-enzym digest om de matrijs-DNA los en verteren het plasmide-DNA in kleinere (≤ 700 bp). Het matrijs-DNA kan vervolgens uit de kleine plasmide-DNA resten middels grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) gezuiverd. Een zwaartekracht gevoed kolom met een hoogte van ongeveer 115 cm gepakt met Sephacryl S-1000 kralen is voldoende voor zuivering van 601 x 12meer 207bp DNA. </li></ol> Opmerkingen: Voor plasmide-DNA-zuivering tegen verminderde kosten, maar verhoogde effort, kan alkalische lysis gebruiken met fenol / chloroform DNA-zuivering om plasmide-DNA te isoleren uit E. coli 23,24. Strategieën voor het scheiden template DNA uit plasmide DNA kan variëren met wijzigingen in de matrijs-DNA formaat. Voor SEC is het belangrijk om de restrictie-enzym digest op een wijze waarbij het verschil in grootte tussen de matrijs en plasmide-DNA maximaliseert. <ol start="2"><li> Bepaal welke molaire verhoudingen (r) te gebruiken voor opnieuw samenstellen. R is gelijk aan de verhouding mol octameer mollen DNA herhalen. Voor initiële kleinschalige studies r waarden van 0.9, 1, 1.1 en zijn geschikt als de bedoeling is om verzadigde nucleosomale arrays verkrijgen. </li><li> Bereid de kleinschalige monsters door berekening van octameer ongeveer 18 ug DNA, voor elke molverhouding te testen. Meng de DNA en histon octameren. De uiteindelijke concentratie van NaCl in het monster dient ≥ 2 M, en de eindconcentratie van DNA moeten circa 0,3 ug / ul zijn. De uiteindelijke steekproef buffer voorwaarden moet ook 10 mM Tris pH 7,8, en 1 mM EDTA. </li><li> De monsters zijn nu klaar voor dialyse. Plaats de monsters in 12k-14k MWCO dialysebuis. Dialyseer de monsters tegen 2L buffer afnemende ionsterkte als volgt. </li></ol> Onderdelen in alle buffers: 10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA. Buffer 1 (voeg 1 M NaCl, 1 mM DTT) gedurende 5-6 uur. Buffer 2 (voeg 0,75 M NaCl, 1 mM DTT) &#39;s nachts. Buffer 3 (voeg 2,5 mM NaCl, 1 mM DTT) voor 5-6 uur. Buffer 4 (voeg 2,5 mM NaCl, 0,1 mM PMSF) &#39;s nachts. <ol start="5"><li> Verwijder de monsters uit de dialysebuis en ga verder met secties 4-6. Als de kleine monsters leveren van de gewenste resultaten, herhaalt u de stappen in de secties 3-6 op de grote schaal. </li></ol> Opmerking: Om hulpbronnen te behouden, moeten kleinschalige monsters de minimale omvang die nodig is om voldoende voor downstream screeningstesten hebben. Om e hebbennough monster voor de sedimentatie snelheid en AFM experimenten hier vermelde 50 pl monsters 0,3 mg / ml DNA geschikt. De omvang van grootschalige preparatieve monsters afhankelijk van hun beoogde gebruik. Een grootschalig monster moet worden bereid op dezelfde wijze als de kleinschalige monsters. 4. Sedimentatiesnelheid Analyse van gereconstitueerde Nucleosomale Arrays Rationale: sedimentatiesnelheid experimenten de Beckman Xl-A / I analytische ultracentrifuge rendement informatie over de grootte en vorm van moleculen in oplossing. Sedimentatiesnelheid experimenten uitgevoerd onder zoutarm voorwaarden wordt gebruikt om te bepalen in hoeverre de gereconstitueerde arrays zijn verzadigd met nucleosomen. <ol><li> Verdun het monster met een absorptie ongeveer 0,5 bij 260 nm met TEN buffer (10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA, 2,5 mM NaCl). Plaats 400 pl monster in een cel met een twee sector middenstuk, met het monster enerzijds en de refece (TEN buffer) anderzijds 25. Houd de verwijzing meniscus hoger dan het monster meniscus (dwz voeg 420 ul referentie-oplossing). </li><li> Plaats de cellen in de rotor, en lijn de cellen met behulp van de streepjes op de bodem van de cellen en rotor 25. Voorzichtig stof de lenzen van de cellen met behulp van perslucht. </li><li> Zet de XL-A/XL-I centrifuge, plaatst u de rotor, en bevestig en zet de optiek zoals beschreven in de handleiding. Open de software Proteome Lab en selecteer een bestand: nieuwe. </li><li> Het opzetten van een enkele scan draaien op 3000 rpm en een temperatuur van 25 ° C. Onder opties, selecteren stoppen na de laatste scan, en run radiale kalibratie (radiale kalibratie is niet nodig als de rotor was de laatste rotor gebruikt in de AUC). </li><li> Voor elke cel, de naam van de monsters, selecteer een golflengte (260 nm), selecteert absorptie, en kies een bestand op te slaan locatie op uw computer. Begin de scan run. </li><li> Gebruik de scan om de juiste ra bepalendial scanlengte (Figuur 2A). Het verminderen van de lengte van de cel die wordt gescand vermindert de looptijd. Echter, moet het monster meniscus zijn en zich uiteindelijk zeer dichtbij of op de bodem van de cel. </li></ol> Opmerking: Single scans zodat het meetgebied door te beginnen metingen worden ingekort net voordat het monster meniscus (Figuur 2A). Het merendeel van de gegenereerde tijdens de AUC run scans moeten grens fracties langs de meniscus als stabiele plateaus (Figuur 2B). Vuile lenzen op de AUC cellen scans met grote pieken genereren, kunnen deze analyse van de gegevens beïnvloeden. De UltraScan software bevat een handleiding, die is een geweldige bron voor informatie met betrekking tot de analyse van de analytische ultracentrifuge data 26. <ol start="7"><li> Met behulp van de XL-A/XL-I bedieningspaneel, voer een snelheid van 0 en druk op start. Dit zal de centrifugeketel gevraagd een vacuüm en alle trekow de temperatuur van de kamer van het evenwicht. Wacht 1 uur om te zorgen voor temperatuurequilibratie voor het begin van een run. </li><li> Gebruik de software om de aanloop voor de gewenste snelheid en het aantal scans in te stellen. Hogere snelheden resolutie vergroot, maar moet men tenminste 20 scans (bij voorkeur meer) verzamelen voordat het monster bezonken op de bodem van de cel. Het is handig om de laatste paar scans (bereikt in het optiemenu) overlay om de voortgang van de vlucht en controleren op mogelijke problemen, zoals lekkende cellen. Monitor de eerste paar scans om een ​​goede werking te garanderen. </li></ol> 5. Het bewerken en analyseren van sedimentatiesnelheid gegevens Rationale: Ruwe sedimentatiesnelheid gegevens moeten worden geanalyseerd door een programma dat een diffusie-gecorrigeerde sedimentatiecoëfficiënt distributie oplevert. Deze informatie op zijn beurt geeft de fractie van een gereconstitueerde monster dat een bepaalde verzadiging niveau bevat, bijv. </em&gt; bij gebruik van een 12-meer DNA-matrijs het mogelijk om de fractie gereconstitueerde arrays die 10, 11 en 12 nucleosomen / DNA te bepalen. <ol><li> Gebruik AUC analyse software zoals UltraScan de data 26 te bewerken. Bewerken van scangegevens moet worden gedaan voor elke cel en creëert een dataset voor verdere analyse. Juiste bewerken scans omvat definiëren het monster meniscus, waardoor de gegevens aan een gebied van belang, en het definiëren basislijn en plateau&#39;s (Figuur 2). Ongewenste scans kunnen ook worden verwijderd uit de op dit moment gegevens. Aangezien het mogelijk is om ongewenste scans tijdens de analyse te verwijderen, wordt aanbevolen dat alle scans op dit punt gehouden. </li><li> We raden de verbeterde busje Holde-Weischet methode worden gebruikt om de gegevens te analyseren 27. Deze analyse methode corrigeert voor de effecten van diffusie in de loop van de vlucht en levert de integrale distributie van sedimentatie coëfficiënten. In het bijzonder, De verbeterde van Holde-Weischet methode (zoals geïmplementeerd in UltraScan) zal zorgen voor de opname van scans die stabiele plateaus missen, of die grens fracties die niet de meniscus heeft gewist in de analyse 28 bevatten. </li><li> Bepaal de verdeling van sedimentatie coëfficiënten voor de samengestelde arrays. Representatieve resultaten voor 601-12 (207bp, 12-mer) nucleosomale arrays worden getoond in Figuur 3. </li><li> Als een van de kleine schaal monsters bevat arrays met het gewenste bereik van sedimentatie coëfficiënten, en herhaal het proces op een verhoogd schaal te beginnen met hoofdstuk 3. Als geen van de kleine schaal monsters heeft een goede verdeling van sedimentatie coëfficiënten herhaal de kleine schaal proeven met een nieuwe r reeks vanaf deel 3. </li></ol> 6. Visualiseren Nucleosomale Arrays behulp Atomic Force Microscopy (AFM) Rationale: AFM maakt visualisatie van het niveau van verzadiging van nucleosomal arrays. Deze techniek vormt een aanvulling op sedimentatie snelheid door de AUC en met restrictie-enzymen als een kwaliteitscontrole test. <ol><li> Met werkwijzen die hierboven beschreven, verkrijgen een goed verzadigde nucleosoom array (figuur 5A). </li><li> Bereid APTES behandeld mica dia door het plaatsen ~ 30 pi 1:1000 verdunning van commerciële (Sigma-Aldrich (3-aminopropyl) triethoxysilaan A3648-100ML) bij 0,22 micrometer gefiltreerd nanozuiver water gedurende 30 minuten. </li><li> Na 30 minuten spoel de APTES af met gefilterd water en voorzichtig droog ze met een stikstofstroom. </li><li> Plaats geschikte verdunde nucleosoom matrix monster (~ 1,5 ng / ul) op de dia en incubeer onder bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. </li><li> Spoel proeven af ​​met gefilterd monster buffer, droog als hierboven, en plaats glijbaan op het podium van de AFM (in dit geval een Asiel Onderzoek MFP-3D Atomic Force Microscope). </li><li> Begin met het afbeelden van 2 x 2 micrometer scans met 512 beeldlijnen. Tel het aantal nucleosomen het niveau van sa vergewissenturation (Figuur 5B). </li><li> Idealiter moet je delen van de opname op de dia met goed gescheiden nucleosome arrays. </li><li> Voor hogere resolutie beelden, kan een 500 x 500 nm scan worden verkregen (figuur 5C). </li><li> Afbeeldingen kunnen worden afgevlakt en het gebruik van de MFP-3D-software die door Asylum geanalyseerd. </li><li> Elk beeld kan worden onderverdeeld in vier kwadranten en ingezoomd digitaal om een duidelijker beeld van goed gescheiden arrays en meerdere vrije hand lijnen kunnen worden getrokken door de arrays en hoogte profielen worden verkregen voor de nucleosomen (Figuur 5C, rechter paneel hoogte trace verkrijgen en 5D). </li><li> Meerdere van dergelijke beelden worden geanalyseerd voor elk type array omvat verscheidene honderden nucleosomen. Hoogte profielen zijn opgenomen, gecategoriseerd en uitgezet in MS Excel. </li></ol>

<ol><li>Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 7, (1997).</li>
<li>Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+chromatin+fiber+in+solution%3A+determinants%2C+mechanisms%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).</li>
<li>McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+architectural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li>
<li>Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+reconstituted+oligonucleosomes%2C+evidence+for+salt-dependent+folding+in+the+absence+of+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1.</a> Biochemistry. 28 (23), 9129-9136 (1989).</li>
<li>Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activator-dependent+p300+acetylation+of+chromatin+in+vitro%3A+enhancement+of+transcription+by+disruption+of+repressive+nucleosome-nucleosome+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).</li>
<li>Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+compacted+chromatin+by+early+developmental+transcription+factors+HNF3+%28FoxA%29+and+GATA-4%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4.</a> Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).</li>
<li>Nguyen, C., Gonzales, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((chromatin+structure+associated+with+methylation-induced+gene+silencing+in+cancer+cells%3A+correlation+of+accessibility%2C+methylation%2C+MeCP2+binding+and+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation.</a> Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).</li>
<li>Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forkhead+factor+FoxE1+binds+to+the+thyroperoxidase+promoter+during+thyroid+cell+differentiation+and+modifies+compacted+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).</li>
<li>Simpson, R. T., Stafford, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+features+of+a+phased+nucleosome+core+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural features of a phased nucleosome core particle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+motifs+and+free+energies+of+selected+natural+and+non-natural+nucleosome+positioning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences.</a> Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).</li>
<li>Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Core+Histone+N-terminal+Tail+Domains+Function+Independently+and+Additively+during+Salt-dependent+Oligomerization+of+Nucleosomal+Arrays+%2A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).</li>
<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).</li>
<li>McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+histone+H4+N-terminal+domain+function+during+nucleosomal+array+oligomerization%3A+roles+of+amino+acid+sequence%2C+domain+length%2C+and+charge+density%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).</li>
<li>Ma Shogren-Knaak,, Fry, C. J., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+peptide+ligation+strategy+for+deciphering+nucleosomal+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).</li>
<li>Lu, X., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+H3K79+dimethylation+and+H4K20+trimethylation+on+nucleosome+and+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).</li>
<li>Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Ultracentrifugation+for+the+Analysis+of+Chromatin+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure.</a> Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).</li>
<li>Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+and+agarose+gel+electrophoresis+as+tools+for+studying+chromatin+folding+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution.</a> Methods. 12 (1), 62-72 (1997).</li>
<li>Montel, F., Menoni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+individual+nucleosomes+controls+the+chromatin+condensation+pathway%3A+direct+atomic+force+microscopy+visualization+of+variant+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin.</a> Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).</li>
<li>Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linker+region+of+macroH2A+promotes+self-association+of+nucleosomal+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+nucleosomes+revealed+by+time-lapse+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).</li>
<li>Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+atomic+force+microscopy+to+study+chromatin+structure+and+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling.</a> Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).</li>
<li>Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly%2C+loading%2C+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> J. Vis. Exp. (33), e1530(2009).</li>
<li>Demeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UltraScan%3A+a+comprehensive+data+analysis+software+package+for+analytical+ultracentrifugation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Analytical+Ultracentrifugation%3A+Techniques%22%5BJournal%5D)">UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments.</a> Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).</li>
<li>Holde, K. V., Weischet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boundary+analysis+of+sedimentation+velocity+experiments+with+monodisperse+and+paucidisperse+solutes%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes.</a> Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).</li>
<li>Demeler, B., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sedimentation+velocity+analysis+of+highly+heterogeneous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems.</a> Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).</li>
<li>Hansen, J., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+structural+properties+of+subsaturated+chromatin+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays.</a> Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).</li>
<li>Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+repeat+length+and+linker+histone+stoichiometry+determine+chromatin+fiber+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).</li>
<li>Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleosome+surface+regulates+chromatin+compaction+and+couples+it+with+transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).</li>
<li>Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+arrays+reveal+the+two-start+organization+of+the+chromatin+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber.</a> Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).</li>
<li>Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Short+nucleosome+repeats+impose+rotational+modulations+on+chromatin+fibre+folding%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding.</a> The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).</li>
<li>Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Silent+Information+Regulator+3+Protein+%2C+SIR3p+%2C+Binds+to+Chromatin+Fibers+and+Assembles+a+Hypercondensed+Chromatin+Architecture+in+the+Presence+of+Salt%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).</li>
<li>Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structure+of+a+tetranucleosome+and+its+implications+for+the+chromatin+fibre%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre.</a> Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).</li>
<li>Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+histone+variant+H2A.Z+regulates+the+equilibrium+between+different+chromatin+conformational+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states.</a> Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).</li>
<li>Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histones+stabilize+the+intrinsic+salt-dependent+folding+of+nucleosomal+arrays%3A+mechanistic+ramifications+for+higher-order+chromatin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding.</a> Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).</li>
<li>Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+In+Vitro+Reconstitution+of+a+Defined+%26%2334%3B30+nm%26%2334%3B+Chromatin+Fibre+Containing+Stoichiometric+Amounts+of+the+Linker+Histone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined &#34;30 nm&#34; Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone.</a> Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).</li>
<li>Dorigo, B., Schalch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+fiber+folding%3A+requirement+for+the+histone+H4+N-terminal+tail%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail.</a> J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).</li>
<li>Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+chromatin+folding+patterns+in+chicken+erythrocytes+by+atomic+force+microscopy+%28AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM.</a> Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Model nucleosomale arrays zijn een zeer nuttig instrument voor de in vitro studie van chromatine structuur en functie. Zo zijn ze veel gebruikt om het mechanisme van chromatine condensatie vezels bestuderen oplossing 30-34, en maakte het mogelijk een röntgenstraal structuur van een tetranucleosome 35 verkrijgen. Meer recent hebben ze nuttig zijn in het ontcijferen van de structurele effecten van specifieke kern histon-varianten, mutanten en posttranslationele modificaties 14-16,36</su...

Eukaryote genomen niet bestaan ​​als naakt DNA, maar eerder worden samengeperst en georganiseerd door gebonden eiwitten. Deze complexen van DNA en eiwitten bekend als chromatine. De basis repeterende eenheid van chromatine is de nucleosoom. Een nucleosoom bestaat uit histon octameer en 146 basenparen van het DNA rond de histon octameer ongeveer 1,6 keer 1. De histon octameer bestaat uit twee exemplaren elke kern histonen H2A, H2B, H3 en H4. Kern histon octameren die herhaaldelijk zijn verdeeld langs een DNA-molecuul worden genoemd nucleosomale arrays. De uitgebreide structuur van nucleosomale arrays is aangeduid als 10 nm vezel of &quot;kralen aan een snoer&quot; structuur aanwezig in vitro onder lage zoutconcentraties 2. De 10 nm vezel is in staat om condensatie in hogere orde structuren door intra-reeks verdichting en / of inter-array-oligomerizatie 2. Deze hogere orde structuren kunnen worden geïnduceerd in aanwezigheid van zouten,of kan worden beïnvloed door de binding van chromatine architectonische eiwitten aan de nucleosomale matrix 3,4. Niveaus van chromatine verdichting worden omgekeerd gecorreleerd met de snelheid van transcriptie in vivo 5,6. Recent onderzoek wijst op het belang van de structurele organisatie van genomen in processen zoals differentiatie, de ontwikkeling van kanker, en anderen 7,8. Het gebruik van nucleosomale arrays chromatinestructuur en functie te bestuderen is wijdverspreid. Hier beschrijven we een werkwijze voor de assemblage van nucleosomale arrays van recombinante kernhistonen en nucleosoom positionering DNA. Met behulp van recombinant DNA met tandem herhalingen van nucleosoom positionering sequenties maakt de reconstitutie van arrays die regelmatige afstand nucleosomen bevatten. Twee van de meer populaire positionering sequenties 5S rRNA gensequentie en de &quot;601&quot;-sequentie 9,10. De 601 serie werd afgeleid van SELEX experimenten en more sterker positioneert nucleosomen dan de 5S-sequentie 11. Bijgevolg linker DNA lengte van de arrays 601 is homogener. Tandem herhaalde DNA nucleosoom positionering wordt verkregen door gelfiltratie 4,12. Recombinant histonen gezuiverd uit E. coli onder denaturerende omstandigheden 13. Het gebruik van recombinante histonen kan men de histon samenstelling van de nucleosomale arrays zorgvuldig controleren. Bijvoorbeeld, kernhistonen dragende specifieke mutaties 14 of post-translationele modificaties 15,16 kan worden vervangen voor wild type kernhistonen. Sedimentatiesnelheid experimenten toezien op de snelheid van sedimentatie van macromoleculen in oplossing onder een toegepaste middelpuntvliedende kracht 17. Deze geeft informatie over de grootte en de vorm van macromoleculen in een monster. Sedimentatiesnelheid experimenten zijn dus een geschikt instrument voor het bestuderen oplossing staat veranderingen in chromatine vezelstructuur als gevolg van chromatinecondensatie 18. Belangrijker is, is het eerst nodig om sedimentatiesnelheid experimenten gebruiken als een kwaliteitscontrole stap in nucleosomale reeks reconstitutie. Als DNA en nucleosomen niet worden gecombineerd bij de juiste molaire verhouding, kan de arrays onder-of oververzadigd met kernhistonen. Aldus wordt de informatie uit sedimentatiesnelheid experimenten om te verzekeren dat de juiste DNA verzadigd met nucleosomen. Het is belangrijk om alternatieve methoden voor het schatten van de verzadiging van DNA met nucleosomen, vooral als die met een eerder niet gekenmerkte DNA template. Daarom hebben we ook een werkwijze beschreven voor het analyseren van nucleosomale arrays met behulp van atomic force microscopie (AFM). AFM is een techniek die het mogelijk maakt visualisatie van de effecten van een aantal parameters, zoals de mate van verzadiging, effect van de aanwezigheid van histon varianten of de effecten van MgCl2 19,20. AFM heeft ook toepassing geweested aan nucleosomen bestuderen met behulp van time lapse imaging 21. In vitro gemonteerd nucleosomale 12-meer arrays zijn bijzonder vatbaar voor AFM onderzoeken omdat zij behoren in de juiste maat bereik voor AFM beeldvorming 22. In de huidige studie hebben we gebruik gemaakt van de AFM nucleosomale arrays als kwaliteitscontrole, evenals een middel van het bevestigen van de gegevens van AUC (&quot;zien is geloven&quot;). Naast eenvoudige visualisatie, AFM kan gemeten hoogteprofielen monsters als extra metrisch.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648-100ML</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa MWCO Dialysebuis</td><td>Fisher</td><td>21-152-5</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad Superdex 200 16/60 Kolom</td><td>GE</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugaal Concentrator</td><td>Sartorius</td><td>VS2031</td><td></td></tr><tr><td>12-14 kDa MWCO Dialysebuis</td><td>Fisher</td><td>08-667A</td><td></td></tr><tr><td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td><td>GE</td><td>17-0476-01</td><td></td></tr><tr><td>XL-A/I Analytische Ultracentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assemblage van nucleosomale arrays van recombinant kernhistonen en nucleosome positioning dna

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Kern histon octameren die herhaaldelijk zijn verdeeld langs een DNA-molecuul worden genoemd nucleosomale arrays. Nucleosomale arrays worden verkregen op twee manieren: zuivering uit in vivo bronnen of reconstitutie in vitro van recombinante kernhistonen en tandem herhaalde positionering nucleosoom DNA. Deze methode heeft het voordeel dat voor de montage van een qua samenstelling uniform en nauwkeurig gepositioneerd nucleosomale array. Sedimentatiesnelheid experimenten in de analytische ultracentrifuge opbrengst informaties grootte en vorm van macromoleculen door analyse van de snelheid waarmee ze migreren door oplossing onder centrifugale kracht. Deze techniek, samen met atomic force microscopie kan worden gebruikt voor kwaliteitscontrole, zodat de meerderheid van DNA-matrijzen verzadigd met nucleosomen na reconstitutie. Hier beschrijven we de protocollen noodzakelijk milligram hoeveelheden lengte reconstitueren en compositioneel defined nucleosomale arrays geschikt voor biochemische en biofysische studies van chromatine structuur en functie.

Om het protocol te illustreren we gereconstitueerde nucleosomale arrays uit recombinante Xenopus kernhistonen en DNA bestaande uit 12 tandem 207 bp herhalingen van de 601 positionering reeks (601 207 x 12). We hebben eerst geassembleerd inheemse octameren uit gevriesdroogde kernhistonen en vervolgens gezuiverd de octameren door FPLC met een S200-kolom (Figuur 1A). Grotere complexen eerder elueren uit de kolom S200. Histonen algemeen elueren in deze volgorde: niet-specifieke histon ag...

Een methode wordt gepresenteerd voor de reconstructie van model nucleosomale arrays van recombinante kernhistonen en tandem herhaalde nucleosoom positionering DNA. We beschrijven ook hoe sedimentatiesnelheid experimenten analytische ultracentrifuge en atomic force microscopie (AFM) worden gebruikt voor het monitoren van de mate van nucleosomale matrix verzadiging na reconstitutie.

Assemblage van Nucleosomale Arrays van Recombinant kernhistonen en Nucleosome Positioning DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Dit experiment heeft als doel nucleosomale arrays te assembleren die een reeks tandem herhaalde DNA-sequenties voor nucleosoompositionering bevatten met een gelijk aantal nucleosomen. Eerst worden histoncomplexen opnieuw gevouwen door de kernhistonen uit de denaturerende buffer te dialyseren. Vervolgens wordt de histon-octameer gescheiden met behulp van een大きte-uitsluitingskolom. Combineer daarna de histon-octameer met template-DNA in verschillende molaire ratio's en zet deze op het DNA als nucleosomen door stapsgewijze dialyse van een hoog naar een laag zoutgehalte.Test vervolgens de monsters via sedimentatiesnelheid om de juiste molaire ratio voor het gewenste verzadigingsniveau te bepalen. De resultaten kunnen het verzadigingsniveau van de nucleosomale arrays aantonen op basis van hun migratie door de oplossing onder centrifugale kracht, of op basis van een afbeelding gegenereerd met atoomkrachtmicroscopie. Het belangrijkste voordeel van nucleosomale arrays ten opzichte van mono-nucleosomen is dat de nucleosomen verbonden zijn door linker-DNA, wat een aanvullende structurele beperking oplegt.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de chromatinestructuur, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals in vitro transcriptiestudies op chromatine-templates. Ryan en Anna zullen nu de assemblage van nucleosomale arrays demonstreren vanuit recombinante kernhistonen in nucleosoom-positionerings-DNA. Begin met de gezuiverde gevriesdroogde recombinante kernhiston-eiwitten H2A, H2B, H3 en H4. Los ongeveer 5 mg van elk op in 3 mL ontvouwingsbuffer en incubeer dit gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur onder agitatie.Meet nu de absorbantie van elke histonoplossing bij 276 nanometer, waarbij de ontvouwingsbuffer als referentie wordt gebruikt. Bereken vervolgens de molariteit van elk histon aan de hand van hun extinctiecoëfficiënten. Vergelijk de via absorbantie bepaalde concentratie van het histon met het gedroogde gewicht van het lyofilisat en schat in of het grootste deel van het eiwit is opgelost.Identificeer het histonsample met de minste mol, aangezien dit de beperkende hoeveelheid mol voor alle histonen zal zijn. Combineer vervolgens de histonen in gelijke molaire hoeveelheden. Verdun het histonenmengsel met ontvouwingsbuffer tot een eindconcentratie van één milligram per milliliter.Breng het monster nu over in dialysebuisjes. Sluit de buisjes af en plaats deze in twee liter koude refoldingbuffer. Dialyseer het monster gedurende 18 uur bij vier graden Celsius onder stirring.Zorg ervoor dat de dialysebuis vrij en krachtig kan roteren om neerslag van stenen te voorkomen. Vervang de dialysebuffer elke zes uur; zelfs als er neerslag ontstaat, mag het monster niet worden weggegooid, aangezien sommige octi mogelijk kunnen worden teruggewonnen, hoewel de opbrengst zal afnemen. Sluit de S 200-kolom aan op een FPLC-systeem en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het systeem terechtkomen.Reinig de S 200-kolom gedurende de nacht met 0,2 micrometer gefilterd water met een stroomsnelheid van 0,3 milliliters per minuut en een tegendruklimiet van 0,5 megapascals; equilibreer vervolgens het systeem gedurende ongeveer twee uur met één liter 0,2 micrometer gefilterde refoldingbuffer. Equilibreer daarnaast een centrifugale concentrator met één milliliter refoldingbuffer. Verwijder nu het monster uit de dialysebuis.Centrifugeer het monster bij vier graden Celsius om eventuele neerslagen te verwijderen. Pipetteer de supernatant van het monster in de concentrator. Concentreer het monster tot een volume van ongeveer 500 microliters.Breng het geconcentreerde Optimus-monster over naar een nieuwe container. Spoel de concentrator uit met één milliliter Refolding-buffer. Concentreer het spoelmiddel tot 500 microliters en voeg dit toe aan het ER-monster.Centrifuge het monster in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter gedurende vijf minuten bij 10.000 RPM bij vier graden Celsius. Draag het supernatant over naar een nieuwe buis. Laad het monster vervolgens op de S 200 kolom.Elueer het monster met 400 milliliters vers bereide refolding-buffer en verzamel fracties van twee milliliter. Monitor de absorbantie bij 280 nanometers tijdens de elutie. His-tagged aggregaten elueren gewoonlijk bij ongeveer 45 milliliters EMR op ongeveer 65 milliliters en timer.Bij ongeveer 84 milliliters. Analyseer de elutiefracties van de relevante pieken door monsters te draaien op een 18 tot 20% SDS-PAGE. Fracties die gezuiverde emus bevatten, moeten gelijke molaire hoeveelheden van de vier kernhistonproteïnen bevatten.Voeg nu de fracties die gezuiverde OCR's bevatten samen en concentreer deze met een centrifugaal filter om de uiteindelijke octr-concentratie te bepalen. Meet de absorptie bij 280. Bereken vervolgens de concentratie met behulp van de extinctiecoëfficiënt.Reconstitueer nucleosomale arrays uit DNA en de gezuiverde ERs zoals gedetailleerd in de protocoltekst. Verdun vervolgens het monster tot een absorbantie van 0,5 bij 260 nanometer. Breng 400 µL van het monster aan in een cuvet met een tweedelige houder, waarbij het monster aan de ene zijde wordt geplaatst en de referentie-buffer 10 aan de andere zijde.Hoewel het vloeistofniveau in beide sectoren nagenoeg gelijk moet zijn, dient de referentimeniscus hoger te blijven dan de meniscus van het monster. Plaats de cellen in de rotor en zorg dat de cellen correct zijn uitgelijnd.Gebruik de markeringen op de bodem van de cellen in de rotor om de lenzen van de cellen voorzichtig af te stoffen met perslucht. Schakel de X-L-A-X-L-I centrifuges in. Plaats de rotor en bevestig en zet de optiek vast zoals beschreven in de handleiding.Open de software van het proteoomlaboratorium en selecteer 'nieuw bestand'. Stel een enkele scanrun in op 3000 RPM bij een temperatuur van 25 °C. Geef voor elke cel de monsters een naam, selecteer een golflengte, selecteer absorbentie en kies een locatie op uw computer om het bestand op te slaan.Select onder opties de optie stop. Nadat de laatste scan is voltooid en de radiale kalibratie is uitgevoerd, start u de enkele scanrun. Gebruik de enkele scan om de juiste lengte van de radiale scan te bepalen.Gebruik het X-L-A-X-L-I-bedieningspaneel. Voer een snelheid van nul in en druk op start om de kamer te egaliseren. Stel met behulp van de software de gewenste snelheid en het aantal scans in.Hogere centrifugatiesnelheden verhogen de resolutie van de sedimentatiecoëfficiënt. Er dienen echter ten minste 20 scans te worden verzameld voordat het volledige monster naar de bodem van de cel is gesedimenteerd. Monitor de eerste paar scans om een correcte werking te garanderen.Leg de laatste scans over elkaar heen om de voortgang van de run te monitoren en te controleren op potentiële problemen, zoals lekkende cellen. De analyse van de resultaten van de sedimentatiesnelheid, evenals een protocol voor het visualiseren van arrays met behulp van atoomkrachtmicroscopie, worden in detail beschreven in de protocoltekst van dit experiment.Gelyofiliseerde kernhistonen van xenopus werden gereconstitueerd in het octameer dat was gezuiverd via FPLC op een S 200-kolom. De aspecifieke histonaggregaten elueerden eerst, gevolgd door histonoctameren, H3-H4-tetameren en H2A-H2B-dimeren. Analyse van de gezuiverde octameerfracties via SDS-PAGE wijst op equimolaire hoeveelheden van de vier histone-eiwitten. Let op dat xip H2A en H2B molecuulgewichten hebben die slechts ongeveer 200 dalton verschillen en daarom vaak als één enkele band op SDS-gels verschijnen.Fracties 64 tot 67 werden samengevoegd en bewaard voor de reconstitutie van nucleosomale arrays. Een screenshot van proteome lab-software van een enkele scan, verzameld bij 3000 RPM, werd gebruikt om het meetbereik voor een UC-celscan vast te stellen. Vervolgens is een reeks sedimentatiesnelheidsscans bewerkt om een dataset te genereren; de rode en groene lijnen vertegenwoordigen twee verschillende methoden om de distributie van sedimentatiecoëfficiënten te visualiseren.In UltraScan. De rode lijn is de integrale distributie van sedimentatiecoëfficiënten, terwijl de groene de afgeleide is bij de studie naar chromatinorganisatie. In vitro atoomkrachtmicroscopie vult analytische ultracentrifugatie aan om de mate van templatesaturatie na reconstitutie vast te stellen.Hier bevatten de meeste van de 27 SRAs die voor beeldvorming werden gebruikt 10 tot 11 nucleosomen. Deze scan van 500 bij 500 nanometer laat duidelijk nucleosomale arrays met het linker-DNA zien. Tevens worden de amplitudetrace, de fasetrace en dezelfde hoogtetrace getoond, waarbij een handmatige lijn door de nucleosomen is getrokken om het hoogteprofiel van de nucleosomen te bepalen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in drie tot vier dagen worden voltooid indien correct uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het zeer belangrijk om zeer nauwkeurig te zijn bij het meten van de concentraties van uw reagentia. Na deze procedure kunt u ook de verzadigingsniveaus van nucleosomale arrays testen met technieken zoals atomairkrachtmicroscopie. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van chromatine om de chromatinestructuur en chromatinecompactie te bestuderen.

assembly-nucleosomal-arrays-from-recombinant-core-histones-nucleosome

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we demonstrate high-speed time-lapse atomic force microscopy, AFM, imaging techniques to study the dynamics of nucleosome complexes. As the AFM tip scans across the surface of the nucleosome, it detects alterations in the nucleosome height and records the DNA unwrapping over time.

High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microscopy to Capture Nucleosome Dynamics

Dit protocol beschrijft de reconstructie van nucleosomen die differentieel-isotoop gemerkte zus histonen. Tegelijkertijd asymmetrisch post-translationeel gemodificeerde nucleosomen worden gegenereerd na het gebruik van een histon premodified kopie. Deze preparaten kunnen gemakkelijk worden gebruikt om wijzigingen crosstalk mechanismen bestuderen, gelijktijdig op beide zus histonen, met behulp van hoge-resolutie NMR-spectroscopie.

Reconstructie van Nucleosomen met Differentieel Isotopen-gelabelde Sister Histon

Hier presenteren we een protocol karakteriseren nucleosoom deeltjes op het niveau van de single-molecuul met behulp van statische en time-lapse atomaire kracht microscopie (AFM) beeldvormende technieken. De beschreven methode van oppervlakte functionalization zorgt voor de opname van de structuur en de dynamiek van nucleosomes in hoge resolutie op nanoschaal.

De structuur en de dynamiek van Nucleosomes met behulp van Atomic Force microscopie Imaging sonderen

Hier presenteren we een methode om geacetyleerde histoneiwitten uit te drukken met behulp van genetische code-uitbreiding en gereconstitueerde nucleosomen in vitro te assembleren.

Site specifieke Lysine acetylatie van histonen voor nucleosoom reconstitutie met behulp van genetische code uitbreiding in Escherichia coli

Dit protocol schetst in detail de voorbereiding van nucleosomale complexen met behulp van twee methoden voor monstervoorbereiding voor het bevriezen van TEM-roosters.

Voorbereiding van nucleosoomkerndeeltjes gecomplexeerd met DNA-reparatiefactoren voor cryo-elektronenmicroscopie structurele bepaling

Dit artikel presenteert een gedetailleerde experimentele procedure voor het reconstrueren van nucleosoombevattende DNA-kettingen voor correlatieve kracht en fluorescentiemicroscopie van één molecuul. Het beschrijft verder verschillende stroomafwaartse experimenten die kunnen worden uitgevoerd om het bindingsgedrag van chromatine-interagerende eiwitten te visualiseren en veranderingen in de fysische eigenschappen van nucleosomen te analyseren.

In situ nucleosoomassemblage voor correlatieve kracht van één molecuul en fluorescentiemicroscopie

Deze video toont de techniek die gebruikt wordt voor de voorbereiding van organisator en dier pole explantaten van Xenopus laevis embryo's, waaronder het gebruik van de wenkbrauw mes - een speciale tool gemaakt dissectie van je wenkbrauw. Het protocol voor het monteren van een adhesie-test wordt ook gegeven, die probes voor de aanwezigheid van belangrijke adhesiemoleculen op het oppervlak aanwezig organisator of dierlijke paal cellen die essentieel zijn voor een goede ontwikkeling.

Ontleding van Organisator en dierlijke Pole Explantaten van Xenopus laevis embryo&#39;s en montage van een Celadhesie Assay

Isolatie van Genomic DNA van muis Tails

We presenteren een nieuwe en krachtige integratie van nanofotonica (QD-FRET) en microfluidics tot de vorming van polyelektrolyt polyplexes, die naar verwachting een betere controle en de synthese van een uniforme en aanpasbare polyplexes voor toekomstige op nucleïnezuur gebaseerde therapieën te onderzoeken.

De combinatie van QD-FRET en Microfluidics aan DNA Nanocomplex zelf-assemblage Monitor in Real-Time

De analytische ultracentrifuge (AUC) monster cel houdt monster en referentie-buffer en tijdens de experimenten en wordt blootgesteld aan een hoog vacuüm en rotor met snelheden tot 60.000 tpm. Deze video zal aantonen aan de strenge aandacht voor detail nodig is voor de montage, laden en afstemming van deze zeer belangrijke component van een AUC experiment.

Montage, laden, en uitlijning van een Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Leer hoe je nucleosomale arrays assembleert met recombinante kernhistonen en positionerende DNA-sequenties. Deze biochemische methode combineert dialyse, chromatografie en sedimentatie-velociteit om chromatinestructuur in vitro te bestuderen.

Assemblage van Nucleosomale Arrays van Recombinant kernhistonen en Nucleosome Positioning DNA

Meer video's verkennen