High-throughput, geautomatiseerde extractie van DNA en RNA uit klinische monsters met behulp TruTip Technology op Common Liquid Handling Robots

Het algemene doel van het volgende experiment is het isoleren van menselijk genomisch DNA uit volbloed, met gebruik van true tip-extractietechnologie met het Hamilton Star Liquid handling workstation. Om dit te bereiken, worden cellen gelyseerd in een oplossing bestaande uit bloedmonster-lysisbuffer, proteinase K en ethanol; deze worden meerdere keren geaspireerd en gedispenseerd via de true tips, waardoor het DNA aan de true tip-matrix bindt. Vervolgens worden twee afzonderlijke wasbuffers door de true tips geleid om residuele eiwitten, lysisbuffer en andere verontreinigingen van de gebonden nucleïnezuren te verwijderen.

In de derde stap wordt de bindingsmatrix van de True Tip gedroogd door meerdere keren lucht op te zuigen en uit te stoten om alle resterende wasbuffer te verdampen; in de laatste stap wordt elutiebuffer heen en weer over de bindingsmatrix geleid om het DNA uit de matrix vrij te maken. Met behulp van True Tip-technologie wordt op deze manier contaminant-vrij genomisch DNA met een hoog molecuulgewicht geëxtraheerd, wat bevestigd kan worden via UV-vis absorptie, gelelektroforese en kwantitatieve PCR of sequencing. Het voordeel van True Tip ten opzichte van andere monstervoorbereidingsmethoden op basis van spinzuilen of magnetische bolletjes is dat True Tip eenvoudig te automatiseren is.

Het vereist geen kostbare systemen met centrifuges en magnetische staafjes, en de eenvoudige workflow bespaart waardevolle ruimte op het deck. Hoewel we ons vandaag zullen concentreren op volbloed, kan Tru Tip ook worden toegepast op andere genomische DNA-monsterapplicaties, evenals op viraal RNA uit klinische watjes of de isolatie van celvrij DNA uit plasma, om enkele voorbeelden te noemen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dane Brady, een automatiseringstechnicus uit ons laboratorium die een cruciale rol heeft gespeeld in de ontwikkeling van de Truet-tip extractieprocedure op het Hamilton Liquid Handling Workstation.

In dit protocol extraheert een Hamilton Star vloeistofbehandelingsrobot gelijktijdig DNA uit 96 wells met volbloed. De Hamilton Star is voorzien van een optionele heater shaker-unit op het deck, wat essentieel is voor de enzymatische digestie van bepaalde klinische matrices, zoals volbloed. Omdat het systeem kan worden uitgerust met een 96-kanaals pipetkop, is er voor elke stap met true tips en voor de reagentia een specifieke 96-well plaat beschikbaar.

Zet eerst de randapparatuur van de Hamilton Star-robot en de computer aan. Open de software Hamilton Run Control op de computer. Open het door ACON verstrekte run-bestand voor 96 monsters.

Stel nu de lay-out van het ster-deck op volgens het diagram. Plaats gefilterde tips van 1 ml op alle posities die zijn aangeduid met één; plaats op positie twee ongefilterde tips van 1 ml. Plaats op positie drie een Conni Hamilton 1 ml LPT 2 mm true tip. Raadpleeg het schema verder om de overige posities vijf tot en met 12 te vullen met de vereiste laboratoriummaterialen, maar laad de monsters nog niet.

Dispense nu de reagentia: 75 milliliters lysis- en bindingsbuffer F moet in trogpositie vijf worden geladen. Als alternatief kunnen platen die vooraf zijn gevuld met buffers worden gebruikt om de opstelling te stroomlijnen en de indeling van het deck te vereenvoudigen.

Ga verder met het laden van de robot op dezelfde wijze. Verwijder tot slot de doppen van de bloedbuisjes en plaats deze in de monsterdragers of op deckpositie vier. Plaats monster 1 achteraan in de uiterst linkse drager en werk sequentieel door elke drager heen, waarbij monster 96 eindigt in de positie rechtsvoor.

Zodra alle monsters zijn geladen, laat u ze equilibreren tot kamertemperatuur. Omdat het protocol volledig is geautomatiseerd, is er weinig kans op operatieve fouten. De monsters moeten in de juiste volgorde in het rek worden geplaatst, maar er kan gebruik worden gemaakt van streepjescodes om een correcte monsterregistratie te waarborgen.

Om een geautomatiseerd script te starten, selecteert u de afspeelknop in de linkerbovenhoek van het venster met het run-bestand en voert u het aantal te verwerken monsters in. De eerste stap die door het script wordt uitgevoerd, is het overbrengen van 80 µL proteinase K naar de incubatieplaat op positie 14 van de heater shaker-module. Vervolgens doseert het script 200 µL monster in elke monsterput van de incubatieplaat met behulp van de achtkanaalsarm.

Vervolgens worden er met de 96-kanaalsarm 600 µL lysisbuffer F in elke put van de incubatieplaat gedispergeerd. Het script mengt de oplossing daarna gedurende 10 cycli en incubeert deze 20 minuten bij 70 °C en 500 RPM in de deep well plaat; de temperatuur is slechts 60 °C, wat binnen het bereik van de proteinase K-activiteit ligt. Terwijl de monsters incuberen, blijft het liquid handling-systeem operationeel door de extractie- en elutiereagentia vanuit de bulkreagensbakken te dispenseren naar de bijbehorende 96-well platen, waarbij 100 µL Elucian buffer A aan elke put van de deep well plaat wordt toegevoegd.

Op positie 13 worden 800 µL ethanol in elke well van de deep-wellplaat gedeponeerd. Op positie 10 wordt 1,6 mL wasbuffer K aan elke well van de deep-wellplaat op positie 12 toegevoegd en 1,6 mL wasbuffer J wordt aan elke well van de deep-wellplaat op positie 11 toegevoegd. Na de incubatie van 20 minuten wordt het monster mengsel overgebracht van de incubatieplaat naar de deep-wellplaat met ethanol op positie 10, waar het wordt gemengd door 12 pipetteercycli.

Gedurende het proces worden de reagenttipjes naar behoefte in de afvalbak geworpen. Het programma gaat over van het lysisproces naar de DNA-extractie door eerst 96 true tips te laden vanuit deckpositie drie. De volgende stap is het aspireren en dispenseren van de monsters in positie 10 over 10 cycli, waardoor de nucleïnezuren aan de true tip monolith binden.

Vervolgens bewegen de true tips naar positie 11, waar wasbuffer J vijf keer over de monoliet wordt gecirculeerd om residuele lysis, buffer en monstermatrix te verwijderen. Daarna bewegen de true tips naar positie 12, waar wasbuffer K vijf keer door hen heen circuleert om eiwitten en andere verontreinigingen van de gebonden nucleïnezuren te verwijderen. Vervolgens worden de true tips aan de lucht gedroogd door 80 keer met hoge snelheid boven de wasplaat te cyclen.

Nu bewegen de true tips naar positie 13, waar elutiebuffer in twee cycli vijf keer doorheen wordt geleid om het DNA in de deep well plate vrij te maken. De true tips worden nu in de afvalbak geworpen. Het programma is nu voltooid.

Verwijder de elutieplaat uit het instrument en breng de geëxtraheerde monsters over naar de juiste buisjes voor opslag of verdere toepassingen. Het programma kan ook worden aangepast om de uiteindelijke monsters automatisch naar het gewenste buisje of de plaat naar keuze over te brengen in slechts één uur. Het geautomatiseerde systeem extraheerde genomisch DNA uit 96 bloedmonsters met behulp van de robot.

De absorptieprofielen van 45 positieve bloedmonsters werden gelijktijdig verwerkt met 45 reagentia-blanco's. De gemiddelde 260-naar-280-absorptieratio was 1,96 en de gemiddelde 260-naar-230-ratio was 1,93, wat wijst op zuivere monsters op een 1% aros-gel. Willekeurige monsters vertoonden een hoog molecuulgewicht met minimale afschuiving.

De gemiddelde opbrengst was ongeveer vijf microgram DNA per 200 microliters volbloed. Bij het optimaliseren van het geautomatiseerde true tip-protocol wordt speciale zorg besteed om kruiscontaminatie tussen de wells te voorkomen. Real-time PCR laat een duidelijke scheiding zien tussen positieven en negatieven, zoals hier wordt getoond.

Voor RNA-extracties kan de volledige extractie van 96 monsters in minder dan een uur worden voltooid, met een minimale benodigde handmatige tijd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe menselijk genomisch DNA uit volbloed kan worden geïsoleerd met behulp van de TRU Technology Automated op het Hamilton Star Liquid Handling Workstation.