Name: In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Leer in vivo calcium-imaging van enkele neuronen in C. elegans met fluorescentie-microscopie. Deze methode meet neurale activiteit en calciumdynamica in reactie op prikkels en celbeschadiging.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Verschillende mensen hebben bijgedragen aan het werk beschreven in dit document. CVG bouwde de experimentele opstelling, en LS, SHC, en CVG de uitgevoerde experimenten. CVG en SHC schreef het manuscript. Alle auteurs nam vervolgens deel aan het herzieningsproces en keurt de definitieve versie van het manuscript. Wij danken Paul Sternberg voor de GCaMP stam. Sommige nematoden stammen die in dit werk werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center (CGC), dat wordt gefinancierd door de NIH National Center for Research Resources (NCRR). De MATLAB beeldanalyse programma werd aangepast van die in 18. De auteurs werden ondersteund door Boston University en het Massachusetts Life Sciences Center.

1. Optische Setup <ol><li> Gebruik een standaard samengestelde microscoop met epifluorescentie imaging-mogelijkheden. We maken gebruik van een Nikon Eclipse Ti-U omgekeerde microscoop met een Intensilight HG Illuminator. </li><li> Voor de beste beeld-en signaalkwaliteit gebruik maken van een hoge vergroting, hoge numerieke apertuur doelstelling. Wij gebruiken meestal een Nikon X60 1,4 NA olie-immersie objectief. In sommige gevallen is het mogelijk om kleinere vergroting gebruiken (X40, X20) afhankelijk van het expressieniveau van de fluorofoor en de signaalsterkte. </li><li> Gebruik een hoge gevoeligheid gekoelde CCD camera, zoals een Andor Clara Camera om beeld gevoeligheid maximaliseren en minimaliseren achtergrondgeluiden. </li><li> Voor enkele kleur fluoroforen gebruik maken van de standaard microscoop fluorescentie filter in te stellen ontworpen voor de specifieke golflengte van de fluorofoor. Voor GCaMP een standaard GFP-filter ingesteld geoptimaliseerd voor excitatie bij 488 nm en emissie bij 525 nm. Geen verdere optische aanpassingen nodig zijn. </li><li&gt; Voor ratiometrisch fluoroforen, zoals Cameleon, gebruik maken van een dual imaging-systeem zodanig dat identieke beelden kunnen gelijktijdig worden opgenomen op twee aparte golflengten. Dit wordt bereikt door het projecteren van de dubbele beelden naast elkaar op de camera. Een eenvoudige installatie om dit te bereiken, gebruikmakend van basis optische componenten op een optische kwaliteit breadboard, wordt geïllustreerd in figuur 1. Het bestaat uit: <ol class="ualpha"><li> Een microscoop filter in te stellen met 440 ± 20 nm excitatiefilter en 455 nm lang voorbij dichroïsche spiegel. </li><li> Een beeldmasker geplaatst op de eerste beeldvlak direct buiten de microscoop imaging-poort (waar de camera CCD-sensor normaal zou gaan zitten). Dit beperkt het gezichtsveld zodanig zijn dat het slechts de helft van de camerasensor vullen. Het plaatsen van dit masker bij het eerste beeldvlak resultaten in scherp beeld randen en geen overlap wanneer de twee beelden naast elkaar geprojecteerd. </li><li> De eerste relais lens ingesteld een brandpuntsafstand weg van thij de eerste beeldvlak zodanig dat het licht collimeert. </li><li> Een dichroïsche spiegel die het licht splitst in de twee afzonderlijke imaging golflengten of kanalen reflecterende een kleur (&gt; 515 nm, geel) tijdens het zenden de andere (&lt;515 nm, cyaan). </li><li> Emissiefilters (banddoorlaatfilters) verder beperken doorgelaten licht de specifieke imaging golflengten (cyaan op 485 ± 40 nm en geel 535 ± 30 nm), </li><li> Het tweede relais lenzen (een voor elk kanaal) geplaatst in de straalpaden zodanig dat het licht kerndoel een tweede beeldvlak bij de CCD camera. </li><li> Een paar spiegels en een tweede dichroïsche spiegel richt de bundel paden zodanig dat de twee beelden gerecombineerd en worden geprojecteerd side-by-side op de camera CCD sensor. Figuur 4A toont een voorbeeld van het resultaat. </li></ol></li><li> Eerste optische uitlijning: Start setup en uitlijning van de optiek met een hoog contrast image het gebruik van een lage vergroting lens en verzonden wide-field verlichting (een zwarte fijnschrijver getekend op een microscoopglaasje werkt goed). Breng het beeld te richten door de microscoop oculair en vervolgens in de microscoop te gebruiken poort. Met hoge licht verlichting geven het beeld op een index-kaart bij de eerste focal plane (een paar cm buiten de microscoop poort). Plaats de eerste relais lens (C) in de stralengang zodat het een brandpuntsafstand van de eerste brandvlak en collimeert het licht terwijl niet afbuigen van de stralengang (dus direct gecentreerd in de stralengang). Plaats het masker in het eerste brandvlak aangepast aan half het gezichtsveld beperken en een scherpe grens te produceren in het beeld. Plaats de spiegels en filters (D, E, G) zodat de stralengang evenwijdig blijft aan het tafelblad en loopt in twee parallelle trajecten side-by-side, zoals getoond in figuur 1B. Centreer de tweede relais lenzen (F) in hun bundel paden enbewegen ze heen en weer langs de paden naar de foto&#39;s tot een focus op een index-kaart geplaatst waren de camera CCD-sensor zal zijn. Als dit juist gebeurt de twee beelden moeten parfocaal met de microscoop oculair en andere camera-poorten. Tot slot plaatst u de camera in positie en fine-tunen van de uitlijning. </li><li> Fine Tuning Optische uitlijning: Gebruik de dubbele beeld bekeken door de CCD-camera te fine-tunen van de optische uitlijning. Gebruik een hoog contrast beeld en beginnen met een lagere vergroting, overschakelen naar een hogere vergroting voor de definitieve uitlijning. Plaats het doorgezonden beeld (cyaan kanaal in Figuur 1B) de helft van het gezichtsveld van de camera gezien dekken door de camera in X en Y. Position het spiegelbeeld (gele kanaal in figuur 1B) op de andere helft van het gebied van dekking bekijken door aanpassing van de laatste twee spiegels (G) in de stralengang. Optimaliseer richten door het bewegen van het tweede relais lens voor elk kanaal heen en weer langs de stralengang. Indien verlatenonveranderd de optische opstelling moet stabiel en vereisen slechts zelden fijnafstemming aanpassing. </li></ol> 2. Monstervoorbereiding and Data Acquisition. <ol><li> Acquire dieren uitdrukken van een calcium gevoelige fluorofoor in het neuron van belangstelling van de Caenorhabditis Genetics Center (CGC) of andere bronnen. Als alternatief kunnen transgene dieren worden geconstrueerd met behulp van standaard C. elegans technieken. Single cell expressie niet nodig (en soms wenselijk dat meerdere neuronen worden onderzocht, zie 12) zolang afbeeldingen en metingen uit meerdere cellen kan gemakkelijk worden gescheiden. Als de fluorofoor transgen is niet geïntegreerd in het genoom, kan sterk uiteenlopen expressie komen van dier tot dier. In dit geval voorselectie dieren met hogere expressie gebruikmaking van een fluorescentie dissectiemicroscoop betere signaal-ruisverhouding en verbetert de metingen. Fluorofoor expressie niveaus need toereikend gemakkelijk worden afgebeeld met de camera onder verkrijging parameters die door de experiment. </li><li> Maak de agarose pads voor de gewenste immobilisatietechniek (zie 2.3) door een kleine druppel gesmolten agarose tussen twee glasplaatjes gescheiden door twee stukken laboratorium tape. Indien nodig kan agarose pads worden overgebracht naar een glazen dekglaasje alvorens de dieren. Zie Figuur 2. </li><li> Immobiliseren C. elegans voor beeldvorming via een van de volgende technieken: <ol class="ualpha"><li> Farmacologische Paralyzation: Voeg 0,05% Levamisol tot 2% agarose pads (mengen in de gesmolten agarose voordat u de pads in 2.2). Neem 5 tot 10 dieren op het pad en dek af met een deksel slip. Breng een kleine hoeveelheid warm was mengsel (50% paraffine en 50% vaseline) de hoeken van het dekglaasje te houden deze vast. Laat 5-10 minuten voor de Levamisol van kracht en de dieren nemen naar become volledig stil. </li><li> Stiff Agarose Immobilisatie: C. elegans kan fysiek worden geïmmobiliseerd met behulp van stijve 10% agarose pads en 0,05 micrometer diameter polystyreen nanodeeltjes. Maken 10% agarose pads (10% agarose in NGM buffer gewicht) als in 2.2. Voeg ~ 3 pl bead oplossing (1:10 polystyreen microsferen in NGM volume) aan de bovenkant van de pad. Snel, pak 5 tot 10 C. elegans in het zwembad van de kraal oplossing op de pad en voorzichtig te bedekken met een dekglas. Gebruik gesmolten was toegepast op de hoeken van het dekglaasje te houden deze vast. (Zie voor meer informatie over deze techniek 7, alsook een eerder Jove artikel 8) </li><li> Lijmen: C. elegans worden gelijmd met kleine hoeveelheden veterinaire kwaliteit lijm aangebracht op een zijde van het dier. </li><li> Microfluïdische apparaten: Tal van microfluïdische apparaten zijn ontworpen om fysiek te houden C. elegans op zijn plaats voor de beeldvorming. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Plaats de voorbereide dia op de microscoop en de focus op de gewenste neuron. Vaak is het makkelijkst te vinden C. elegans met helderveld verlichting en lage vergroting. Over te schakelen naar een hoge vergroting en fluorescentie beeldvorming te vinden en zich richten op de specifieke neuron. </li><li> Stimulus: Als een neuronale reactie op een specifieke stimulus gewenst (licht, elektrisch veld, smaak-en olfactorische signalen, temperatuur enz.) moet de stimulus inrichting worden ontworpen in de microscoop setup, zodat het kan worden toegediend aan de dieren in de monstervoorbereiding terwijl beeldvorming. </li><li> Acquire beelden met behulp van de microscoop CCD-camera. Belichtingstijden en excitatielicht niveau zal afhangen van de basislijn signaal en het expressieniveau van de fluorofoor, bij zwakkere signalen die een langere belichtingstijden met concordantly minder tijdsresolutie. Wij gebruiken meestal ~ 300 msec belichtingstijden. </li><li> Acquire beelden hetzij individueel, hetzij als een time-Lapse-film. Omdat C. elegans neuronen algemeen langzaam activering dynamiek (dwz ze missen natrium gebaseerd actiepotentialen) weer te geven, relatief langzame frame rates van ~ 1 sec zijn vaak voldoende om neuron dynamiek te meten. Overname rates tot ongeveer 90 frames per seconde werden gebruikt hoewel deze kan worden beperkt door de integratietijd nodig zwakke fluorescentie. Afzonderlijke films van een neuron kan eenvoudig uitbreiden enkele minuten (~ 5-10 min) of langer indien de immobilisatie preparaat is stabiel en de framesnelheid relatief traag. </li></ol> 3. Data-analyse <ol><li> Er zijn een aantal verschillende fluorescerende beeldvorming software pakketten beschikbaar met dynamische en ratiometrisch analyse mogelijkheden, waaronder ImageJ en NOS-Elements. We gebruiken een eenvoudige aangepaste MATLAB programma dat de gemiddelde fluorescent signaal over een geselecteerd gebied van belang meet. </li><li> Voor individuele beelden (of time-lapse filmpjes die blijvenonbeweeglijk) selecteer een gebied van belang (ROI) in de belichte neuron en een aparte nabijgelegen regio voor achtergrondmeting. Voor ratiometrische vergelijkbare beelden te selecteren en achtergrond ROI&#39;s voor elk van de dubbele beelden. </li><li> Een lichte beweging van de afgebeelde neuron binnen een time-lapse film vereist aanvullende analyse om automatisch de ROI in elk frame, die kan worden bereikt met behulp van tal van object tracking systemen. Ons programma geeft een gecomprimeerd beeld van alle beelden in de film waar een ruwe grens (omvat het doel van belangen in alle frames) handmatig is geselecteerd en een onafhankelijke achtergrond regio geselecteerd. Voor het eerste frame, wordt een ROI handmatig vanuit het grensgebied. Voor elk volgend frame, het programma selecteert de helderste pixels binnen het grensgebied genereren van een ROI van de juiste grootte (dwz hetzelfde aantal pixels als de manuele eerste frame ROI). Voor afbeeldingen waar de doelstelt van belang is voldoende helderder dan de omringende achtergrond binnen het grensgebied dit protocol selecteert een redelijke ROI voor elk frame. </li><li> Het fluorescentiesignaal, F voor elk frame wordt berekend als het gemiddelde pixelintensiteit in het ROI minus de gemiddelde intensiteit op de achtergrond regio. Ratiometrische waarden worden berekend als de verhouding van de twee signalen (YFP-YFP achtergrond) / (CFP CFP-achtergrond) -0,65. De factor van 0,65 compenseert bloeden door de GVB kanaal in het kanaal YFP, die afhankelijk van de fluoroforen en de specifieke set filter gebruikt (deze waarde is waarschijnlijk ~ 0,6 voor cameleon setups) zijn. </li><li> De relatieve calcium voor elk frame berekend als het percentage verandering in intensiteit genormaliseerd tot een nulmeting gemeten vanaf het eerste frame (of een reeks frames): AF / F = (F (t)-F o) / F o, waarin F (t) de fluorescentie op tijdstip t en F ois de initiële uitgangswaarde. </li><li> Een ROI selecteren cellichaam genereert de sterkste signalen meest robuuste maar het is ook mogelijk om signalen te meten en een ROI langs de zenuw processen. </li></ol> 4. Problemen oplossen <ol><li> Bleken: Blootstelling aan excitatielicht kan bleken van de fluorofoor en wordt gekenmerkt door een gestage afname in signaal dat afhankelijk is van blootstelling. Ratiometrisch metingen helpen om dit te compenseren. Maar selectief bleken van een golflengte kan nog steeds optreden (meestal GVB bleekmiddelen sneller dan YFP). Als het bleken gebeurt verminderen van de blootstelling aan licht niveau door het verminderen van de blootstelling tijden en / of excitatie-intensiteit (met grijsfilters in de verlichting route). Indien nodig kan men compenseren bleken door het uitvoeren schijnprocessen (dezelfde excitatie blootstelling maar neuronale stimulus) en kwantificeren van de tijdconstante van signaal verval. </li><li><strong&gt; Immobilisatie: Om de eenvoudige beeldanalyse hier beschreven het cruciaal is het dier blijft relatief nog steeds gedurende de registratietijd C.. elegans reageren belichting en experimentele stimuli, waardoor ze waarschijnlijk te bewegen op het moment van opname. Lichte beweging kan voor belangrijke ruis in de metingen vooral bij het meten van de axon processen. Ratiometrische analyse helpt om deze effecten te verminderen enigszins en metingen van het cellichaam robuuster zijn. Zorgvuldige uitvoering en verfijning van de immobilisatie procedures zal leiden tot volledig stil dieren. </li><li> Selectie achtergrond: Zorgvuldige selectie van een achtergrond regio is nodig voor een succesvolle beeldanalyse. Achtergrond regio&#39;s moet redelijk uniform en donkerder dan de afgebeelde neuron. Het moet voldoende worden verwijderd verstrooide licht (en dus pickup een signaal) van de afgebeelde neuron voorkomen. We vinden een uniforme regio twintig-vijf0 micron van de ROI werkt goed in de meeste gevallen. </li><li> Ratiometrisch Optiek: correcte uitlijning van de imaging optiek is van cruciaal belang voor het genereren van een duidelijke dubbele beeld. Commerciële microscoop hulpstukken voor ratiometrisch beeldvorming zijn beschikbaar. Een alternatieve techniek is het gebruik van een snelle sequentiële beeldvorming met behulp van een snelle filterwiel snel schakelen tussen emissiegolflengten tijdens het opnemen van afzonderlijke beelden voor elk. </li><li> Ratiometrische analyse: De analyse hier beschreven is een relatief eenvoudige techniek die sterke signaal genereert op grond van gemiddelde over een ROI. Het vereist een herkenbaar helder object te selecteren de ROI. Verfijndere ratiometrische analyse kan door aanpassing nauwkeurig in kaart brengen en de dubbele beelden zodanig dat de fluorescerende verhouding kan worden berekend pixel voor pixel. </li></ol>

<ol><li>Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerr%2C+R+%22WormBook%22">WormBook</a>. , The C. elegans Reseach Community. (2006).</li>
<li>Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875(2009).</li>
<li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
<li>Rand, J. B. Acetylcholine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRand%2C+JB+%22WormBook%22">WormBook</a>. , The C. elegans Reseach Community. (2005).</li>
<li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), e53419(2013).</li>
<li>Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Laser+Axotomy+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo Laser Axotomy in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (51), e2707(2011).</li>
<li>Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26, 583-594 (2000).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li>
<li>Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+mediate+electrosensory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).</li>
<li>Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Core+Apoptotic+Executioner+Proteins+CED-3+and+CED-4+Promote+Initiation+of+Neuronal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 10, e1001331(2012).</li>
<li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30(2006).</li>
<li>Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+dynamic+range+of+fluorescent+indicators+for+Ca%282%2B%29+by+circularly+permuted+yellow+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).</li>
<li>Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+mediates+context-dependent+modulation+of+sensory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 55, 662-676 (2007).</li>
<li>Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+a+circuit+for+olfactory+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 63-70 (2007).</li>
<li>Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+activity+patterns+in+thermosensory+neurons+of+freely+moving+Caenorhabditis+elegans+encode+spatial+thermal+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients.</a> J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).</li>
<li>Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+diacylglycerol+kinase+modulates+long-term+thermotactic+behavioral+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans.</a> Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).</li>
<li>Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li>
<li>Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxic+MEC-4%28d%29+DEG%2FENaC+sodium+channel+conducts+calcium%3A+implications+for+necrosis+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation.</a> Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Genetisch gecodeerd calcium indicatoren zijn op grote schaal gebruikt in C. elegans neurobiologie. Talrijke groepen gebruikt deze technieken reactie van primaire sensorische neuronen externe stimuli bestuderen zoals hier aangetoond met ASJ reactie op een elektrisch veld. Prominente voorbeelden zijn gevoel van mechanische druk, specifieke chemicaliën, temperatuur en een elektrisch veld 12, 16-19. Activiteit van interneuron en spiercellen zijn ook gecontroleerd als respons op stimuli en controle van di...

Hier presenteren we praktische methoden voor in vivo calcium beeldvorming in C. elegans neuronen. De ontwikkeling van genetisch gecodeerde calcium-gevoelige fluoroforen met een hoge signaal-ruisverhouding wordt C. elegans een relatief eenvoudig en kostenbesparend systeem voor het meten van de neurofysiologie en activiteit. Onze beeldvorming wordt gedaan met een standaard samengestelde microscoop met behulp van wide-field fluorescentie beeldvorming van de algemeen beschikbare fluoroforen. We presenteren verschillende technieken inzet van verschillende fluoroforen en verschillende monster voorbereiding, het bespreken van de sterke en zwakke punten van elk. Gegevens worden gepresenteerd op twee voorbeeldexperimenten. Een uitstekende extra bron op de hier beschreven technieken zijn te vinden in WormBook, &quot;Beeldvorming van de activiteit van neuronen en spieren&quot; door R. Kerr, ( <a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a> ) 3. Twee belangrijke klassen van genetischautomatisch gecodeerd fluorescerende calcium reporters worden vaak gebruikt in C. elegans: een kanaal GCaMP en FRET-gebaseerde cameleon. Beschrijven we methoden en tonen voorbeelden voor gegevens die zijn gegenereerd door elk. GCaMP is gebaseerd op een gemodificeerd Green Fluorescent Protein (GFP) die gevoelig is voor de omringende calciumconcentratie. Dit wordt bereikt door fusie van GFP en de hoge affiniteit calcium eiwit calmoduline, zodat de binding van calcium door calmodulin de GFP molecuul brengt in een efficiënte fluorescerende bevestiging 2. De recente ontwikkelingen in deze fluoroforen genereren uitzonderlijke signaal formaat met tot 500% toename van de fluorescentie-intensiteit over een fysiologische bereik van calcium niveaus en redelijk snel kinetiek van ~ 95 msec stijgtijd en ~ 650 msec decay tijd 4. Over relatief korte perioden (minuten), kan deze grote signalen zorgen voor lagere resolutie imaging (lagere vergroting) en, gegeven een goed opgevoede initial nulmeting, ontkennen de noodzaak van permanente basislijn of vergelijkende metingen. Cameleon heeft het voordeel dat een FRET-gebaseerde fluorofoor die een ratiometrische meting vergelijken van twee onafhankelijke kanalen of golflengten 1 genereert. Het bestaat uit twee fluoroforen (cyaan-en gele-emitterende fluorescerende eiwitten, CFP en YFP) verbonden door een calmoduline eiwit. Het complex is verlicht met blauw licht (440 nm) dat het GVB prikkelt. Binding van calcium brengt de fluoroforen dichter bij elkaar, waardoor fluorescentie resonantie energie overdracht (FRET) van de CFP (donor) de YFP (acceptor) en waardoor de emissie CFP (480 nm) en neemt de emissie YFP (535 nm) om het . Relatieve calciumgehalte gemeten als de verhouding van de YFP / CFP intensiteit. Cameleon kinetiek langzamer dan GCaMP, gemeten in vivo een stijgtijd van ~ 1 sec en een vervaltijd van 3 sec 5 hebben. Echterde verhouding van tegengesteld bewegende signalen verhoogt de signaalgrootte en compenseert een aantal mogelijke artefacten als gevolg van veranderingen in fluorofoor concentratie beweging of aandacht drift en bleken. Genetisch gecodeerd fluorescerende verslaggevers ontkennen veel van de monstervoorbereiding vereist met exogeen toegediende sondes en C. elegans kleine transparant lichaam maakt beeldvorming binnen de intacte dier met behulp van eenvoudige brede veld fluorescentie. De belangrijkste technische uitdaging in monstervoorbereiding is dan ook om veilig te immobiliseren de dieren. Er zijn een aantal verschillende algemeen gebruikte technieken elk met voor-en nadelen. Met een farmacologisch middel om de dieren verlammen is eenvoudig te implementeren, de bevestiging van meerdere dieren een preparaat (Levamisol, een cholinerge agonist die spierweefsel veroorzaakt grijpen om wordt meestal gebruikt 6). C. elegans kan ook fysiek inactief worden gemaakt door ze aan te koppelenop stijve 10% agarose 7, 8. Dit minimaliseert impact op de dierlijke fysiologie, laat de lange termijn beeldvorming (uur) en het herstel van meerdere dieren, maar is meer technisch moeilijk. Beide technieken de fysieke toegang tot de dieren (die onder een dekglas) en kan daarom alleen worden gebruikt met bepaalde experimentele stimuli (zoals licht, temperatuur, elektrisch veld of laser schade). Voor stimuli waar fysieke toegang nodig is, zoals aanraking of toediening van chemicaliën, hebben vele studies met succes geplakt C. elegans op zijn plaats (met behulp van veterinaire graad lijm) 9. Dit is technisch meer uitdagende, is een enkel dier voorbereiding en staat niet toe dat dierlijke herstel. Ten slotte hebben talloze microfluïdische apparaten in dienst die fysiek C. beperken elegans, kan het behoud van dierfysiologie, waardoor de blootstelling aan de meeste soorten stimuli (afhankelijk van het apparaat ontwerp) en maken een snelle uitwisseling en herstel van de dieren <sup&gt; 10, 11. Maar microfluidics extra technische vaardigheden en mogelijkheden in ontwerp, fabricage en uitvoering. In geïmmobiliseerd dieren activiteit en stimulus respons kan over het algemeen worden gemeten in sensorische en interneuronen. De activiteit van de motorneuronen vereist meer geavanceerde technieken voor beeldvorming bij bewegende dieren. Hier presenteren we gedetailleerde methoden gebruik van de twee meest eenvoudige technieken van farmacologische paralyzation en immobilisatie met stijve agarose. De hier gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om neuronale activiteit en celfysiologie in C. meten elegans. We geven een voorbeeld van elk: GCaMP met de sensorische respons van de ASJ neuron een extern elektrisch veld meten, en het gebruik Cameleon de fysiologische reactie op calcium laser schade van neuron meten. Deze voorbeelden tonen de voordelen en nadelen van de twee soorten fluoroforen en illustreren wat mogelijk is met het systeem.

<table><tbody><tr><td>Eclipse Ti-U inverted microscoop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intensilight HG Illuminator</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td>Fluorescente lichtbron</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optische tafel of 3'X3' optische kwaliteit broodplank</td><td>Thor Labs</td><td></td><td>Als er geen optische tafel wordt gebruikt, dient een optische kwaliteitsbroodplank op een solide laboratoriumbank voldoende te zijn.</td></tr><tr><td>Clara Interline Camera</td><td>Andor Technology</td><td></td><td>Hoge gevoeligheid CCD-camera</td></tr><tr><td>wtGFP Longpass Emissie</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>41015</td><td>GFP-filterset voor GCaMP-beeldvorming</td></tr><tr><td>Filter 440 +/- 10 nm</td><td>Chroma</td><td>D440/20x EX</td><td>excitatiefilter voor cameleon</td></tr><tr><td>Dichroic spiegel &gt; 455 nm longpass</td><td>Chroma</td><td>455DCLP BS</td><td>microscoop dichroic voor cameleon beeldvorming</td></tr><tr><td>Dichroic spiegel &gt; 515 nm longpass</td><td>Chroma</td><td>515DCLP BS</td><td>dichroic spiegel voor cameleon beeldvorming</td></tr><tr><td>Filter 535 +/- 15 nm</td><td>Chroma</td><td>D535/30m EM</td><td>YFP-emissiefilter</td></tr><tr><td>Filter 480 +/- 20 nm</td><td>Chroma</td><td>D485/40m EM</td><td>CFP-emissiefilter</td></tr><tr><td>Lens, 200 mm, Achromat</td><td>Thor Labs</td><td>AC508-200-A1</td><td>Relaislens voor FRET-optica (3)</td></tr><tr><td>Zilveren breedbandspiegel</td><td>Thor Labs</td><td>ME2S-P01</td><td>FRET-optica (2)</td></tr><tr><td>NGM-buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Microspheres</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08691-10, 2,5% per volume, 50 nm diameter</td><td>polystyreen nanodeeltjes voor C. elegans immobilisatie</td></tr><tr><td>Transgene stam, Stam gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) </td><td>Sternberg Lab</td><td>Stam PS6388</td><td></td></tr><tr><td>Transgene stam, mec- 4::YC3.60</td><td>Gabel Lab</td><td>Stam CG1B</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo neuronale calcium imaging in c. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

De nematode worm C. elegans is een ideaal modelorganisme voor relatief eenvoudige, goedkope neuronale imaging in vivo. Zijn kleine transparante lichaam en eenvoudig, goed gekarakteriseerde zenuwstelsel maakt de identificatie en fluorescentie beeldvorming van een neuron in het intacte dier. Eenvoudige immobilisatie technieken met minimale impact op de fysiologie van het dier kunnen langere time-lapse imaging. De ontwikkeling van genetisch gecodeerde calcium gevoelige fluoroforen zoals cameleon 1 en 2 laten GCaMP in vivo beeldvorming van neuronale calcium worden zowel celfysiologie en neuronale activiteit. Talrijke transgene stammen die deze specifieke fluoroforen in neuronen gemakkelijk verkrijgbaar of kunnen worden geconstrueerd met gevestigde technieken. We beschrijven gedetailleerde procedures voor het meten van calcium dynamiek van een neuron in vivo in zowel GCaMP en cameleon. We bespreken voordelen en disadvantleeftijd waarop en verschillende werkwijzen van monstervoorbereiding (dier immobilisatie) en beeldanalyse. Tenslotte presenteren we de resultaten van twee experimenten: 1) Gebruik GCaMP de sensorische respons van een bepaald neuron aan een extern elektrisch veld en 2) Met Cameleon de fysiologische reactie van een calcium neuron traumatische beschadiging laser meten. Calcium beeldvormingstechnieken zoals deze worden veel gebruikt in C. elegans en zijn uitgebreid tot metingen in vrij bewegende dieren, meerdere neuronen tegelijk en vergelijking tussen genetische achtergronden. C. elegans presenteert een robuust en flexibel systeem voor in vivo neuronale beeldvorming met voordelen ten opzichte van andere modelsystemen in technische eenvoud en kosten.

Wij presenteren resultaten van twee afzonderlijke experimenten. De eerste werk GCaMP de reactie van een specifieke sensorische neuron naar een gedefinieerde externe stimulus te meten, wat een goed voorbeeld van hoe fluorescente calcium reporters kan worden gebruikt om optisch monitoren neuronale activiteit intact C. elegans. De tweede dienst cameleon het meten van de intracellulaire calcium voorbijgaande geactiveerd bij een neuron in antwoord op specifieke laser schade Dit illustreert hoe calcium fysiologie kan...

Met zijn kleine transparante lichaam, goed gedocumenteerde neuroanatomie en een groot aantal vatbaar genetische technieken en reagentia,<em&gt; C. elegans</em&gt; Is een ideale modelorganisme voor<em&gt; In vivo</em&gt; Neuronale beeldvorming met relatief eenvoudige, goedkope technieken. Hier beschrijven we enkel neuron imaging binnen intacte volwassen dieren met behulp van genetisch gecodeerd fluorescerende calcium indicatoren.

In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om genetisch gecodeerde fluoro fours te gebruiken om calciumdynamica van enkele neuronen binnen de nematode worm te meten. Zie elegantie, dit wordt bereikt door eerst intacte C elegance te monteren en te demobiliseren die een calciumgevoelig fluorofoor in de neuronen van belang uitdrukken op een standaard microscoopglasplaat. Vervolgens worden individuele neuronen in vivo geïmagingd met behulp van videomicroscopie en standaard epi-fluorescente beeldtechnieken.Vervolgens wordt het video geanalyseerd om de fluorescentie-intensiteit op specifieke locaties in het neuron te meten voor twee veel gebruikte Fluor fours G camp, die een robuust groot amplitude enkelkanaals signaal geeft, en fret-gebaseerde kameleon, die een dual-kanaals ratio genereert. Metrische meetresultaten worden verkregen door de getoonde neuronale activiteit in reactie op een specifiek sensorisch stimulus te meten, evenals cellulaire calciumfysiologie in reactie op cellulaire schade, beide gebaseerd op optische meting van relatieve calciumniveaus binnen het geïmaged neuron. De belangrijkste voordelen van deze techniek boven vergelijkbare methoden in gewervelde systemen

in-vivo-neuronal-calcium-imaging-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video introduceert de concepten achter calciumbeeldvorming en bevat een voorbeeldprotocol voor time-lapse beeldvorming van wormen in gegoten agaroseputten.

Calcium imaging: een methode om neurale activiteit in levende C. elegans te visualiseren

This video demonstrates a technique for calcium imaging in individual neurons of behaving Caenorhabditis elegans using genetically encoded fluorescent reporter proteins. It outlines the steps involved in imaging worm movement and measuring reporter fluorescence ratios from neurons to correlate intracellular calcium levels with neuronal activity and behavioral changes during egg-laying.

Calcium Imaging in Individual Neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans

Source: Doser, R., et al. Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo. J. Vis. Exp. (2023)This video demonstrates in vivo imaging of subcellular calcium flux in the ventral nerve cord neurons of transgenic Caenorhabditis elegans strains. Two distinct calcium indicators are employed: a cytoplasmic indicator in one strain and a mitochondrial indicator in another. Neurons are observed under a fluorescence microscope to monitor real-time changes in fluorescence intensity within the...

Imaging Subcellular Calcium Dynamics in Neurons of Caenorhabditis elegans

Het in beeld brengen van gedrag en neurale activiteit over lange tijdschalen zonder het dier te immobiliseren, is een voorwaarde om gedrag te begrijpen. Agarose microfluïdische kamersbeeldvorming (AMI) kan worden gebruikt om neurale activiteit en gedrag voor alle levensfasen van Caenorhabditis elegans in beeld te brengen.

Agarose microkamers naar Lange termijn Calcium Imaging van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dit protocol beschrijft het gebruik van genetisch gecodeerde Ca2 + verslaggevers om recordwijzigingen in neurale activiteit in gedragen Caenorhabditis elegans wormen.

Ratiometric Calcium beeldvorming van individuele neuronen in gedragen Caenorhabditis Elegans

Deze methode biedt een manier om te koppel optogenetics en genetisch gecodeerde calcium sensoren om beeld Baseline cytosolische calcium niveaus en veranderingen in opgeroepen calcium transiënten in het lichaam muur spieren van het modelorganisme C. elegans.

In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

Hier gerapporteerd is een systeem voor calciumbeeldvorming bij vrij gedragende Caenorhabditis elegans met goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen. Dit systeem stelt onderzoekers in staat om niet-gelokaliseerde trillingen op te roepen met goed gecontroleerde eigenschappen op nanoschaalverplaatsing en om calciumstromen te kwantificeren tijdens reacties van C. elegans op de trillingen.

Calciumbeeldvorming bij vrij gedragen caenorhabditis elegans met goed gecontroleerde, niet-gelokaliseerde trillingen

Dendritische stekels zijn belangrijke cellulaire kenmerken van het zenuwstelsel. Hier worden live beeldvormingsmethoden beschreven voor het beoordelen van de structuur en functie van dendritische stekels in C. elegans. Deze benaderingen ondersteunen de ontwikkeling van mutante schermen voor genen die de dendritische wervelkolomvorm of -functie definiëren.

Beeldvorming van dendritische stekels bij Caenorhabditis elegans

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Hier presenteren we protocollen en hulpmiddelen voor het visualiseren van calcium tijdens bevruchting en vroege embryogenese met behulp van een genetisch gecodeerde calciumreporter die tot expressie komt in de kiembaan van de modelnematode C. elegans.

In vivo visualisatie van calciumtransiënten tijdens bevruchting en vroege ontwikkeling in C. elegans

Leer in vivo calcium-imaging van enkele neuronen in C. elegans met fluorescentie-microscopie. Deze methode meet neurale activiteit en calciumdynamica in reactie op prikkels en celbeschadiging.

In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

Meer video's verkennen