Name: Tot oprichting van Schimmel Entomopathogens als endofyten: Op weg naar Endofytische Biologische bestrijding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: Leer twee inoculatiemethoden om Beauveria bassiana als endofyt in Phaseolus vulgaris te introduceren. Dit protocol ondersteunt duurzame biologische bestrijding in de landbouw.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De productie en het experimentele werk die hierin weerspiegelen de toegewijde en enthousiaste hulp van Reynaldo Pareja. Gefinancierd door Bestuursdienst Colombia van Wetenschap, Technologie en Innovatie (Colciencias) en door een subsidie ​​van de Bill &amp; Melinda Gates Foundation door de Grand Challenges Explorations initiatief.

1. Planten <ol><li> Oppervlakte-steriliseren jansbroodpitten (cv. Calima) door onderdompeling gedurende twee minuten in 0,5% natriumhypochloriet en twee minuten in 70% ethanol. Spoel de zaden driemaal in steriel gedestilleerd water. </li><li> Evalueer het succes van sterilisatie door uitplaten 100 ul van het laatste spoelwater op aardappel dextroxe agar (PDA) media en incuberen van de plaat gedurende 10 dagen bij 25 ° C. Beëindigen en opnieuw starten van het experiment als een groei wordt gezien op de plaat. </li><li> De zaden in groepen van drie in potten met een steriele mengsel van grond en zand op een 2:1 verhouding. Breng de potten naar een groeikamer bij 25 ° C, ca. 50% RH en 12 uur fotoperiode. Een week na het ontkiemen, elimineren de twee minst krachtige zaailingen. Water om de 2-3 dagen met steriel gedestilleerd water en bemesten 10 en 20 dagen na het planten met een 6 g / L water oplossing van NPK 15-15-15 kunstmest. </li></ol> 2. Zwam <ol><li> Zorg voor een commerciëleciële formulering van Beauveria bassiana stam GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Colombia). </li><li> Om een ​​enkele-spore voorraad cultuur te genereren, op te schorten ca. een entnaald vol conidia in 1 ml van een 0,1% waterige oplossing van Triton X-100 en vortex gedurende 10 sec. Vervolgens plaat 100 ul van de suspensie van 2,5% Noble agar en incubeer gedurende 24 uur bij 25 ° C. Breng een enkele kiemende conidium in een 100 mm plaat met PDA en groeien totdat het omvat de gehele plaat (ca. 3-4 weken). </li><li> Onder steriele omstandigheden, de schimmelgroei schrapen van het oppervlak van het medium en suspendeer in 10 ml steriele 0,1% Triton X-100. Vortex gedurende een minuut. Dan, filter de suspensie door een steriele kaasdoek om hyfen te verwijderen en de bouillon suspensie te verkrijgen. </li><li> Gebruik een hemocytometer om de conidiale concentratie van de voorraad schorsing te schatten. Om conidiale telt vergemakkelijken, bereiden een 10.000-voudige seriële verdunning van de voorraad, elke keer dat de overdracht 100 ul of conidiale suspensie in 900 pi 0,1% Triton X-100 en vortexen 10 sec voor de volgende verdunning. </li><li> Het inoculum genereren aanpassen stock suspensie tot een eindconcentratie van 10 8 conidia / ml, met de formule: <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="vergelijking 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> Om conidiale levensvatbaarheid plaat 100 ul van de 10.000-voudige verdunning beoordelen 2,5% Noble agar en incubeer gedurende 24 uur bij 25 ° C. Dan, inspecteren drie willekeurige groepen van 100 conidia tot procent kieming te schatten. Beschouw een conidium ontkiemd bij een zichtbare kiem buis langer dan de halve diameter van de conidium projecten van. Gebruik alleen de vering, wanneer het gemiddelde percentage kieming meer dan 90%. </li></ol> 3. Inenting <ol><li> Inoculeer planten wanneer zij hun eerste echte bladstadium (ca. 14 dagen na het planten). Waterplanten in de bodem capaciteit met steriel gedistilleerded. water 24 uur voor inentingen. </li><li> Voor de bladspray methode een handmatig verstuiver de conidiale suspensie (behandeling) of 0,1% Triton X-100 (controle) aan de adaxiale (bovenste) oppervlak van bladeren totdat ze verzadiging van toepassing. Bedek de bovenkant van de pot met aluminiumfolie om conidiale afvoer voorkomen dat de bodem. Na het besproeien betrekking planten met een plastic zak voor 24 uur om een ​​hoge luchtvochtigheid vergemakkelijken schimmel invasie handhaven. </li><li> Voor de bodem drench methode gebruikt een maatcilinder tot 10 ml van conidiale suspensie (behandeling) of 0,1% Triton X-100 (controle) aan het oppervlak van de bodem op de basis van de plant. Toepassing </li><li> Na inentingen, terug planten aan de groei kamers regelen van hen in een gerandomiseerd compleet blok design. Liefst vier aanvullende experimentele blokken worden aangebracht om evaluaties van plantengroei mogelijk naast evaluaties van endofytische kolonisatie in hetzelfde experiment. </li></ol> 4. Evalaties <ol><li> Evalueren experiment een blok tegelijk selecteren de blokken in willekeurige volgorde. Dit is bijzonder belangrijk voor grote experimenten die niet kunnen worden geëvalueerd op een dag. </li><li> Voor het verwerken van een plant, meten en registreren de hoogte van de basis naar het apicale meristeem. Dan, voorzichtig ontwortelen en grondig wassen in stromend leidingwater. </li><li> Van elke plant, monster twee folders, twee stukken wortel en twee stukken stam. Willekeurig bijsluiter monsters van de eerste ware blad van de plant. Vervolgens krijgen twee monsters stam, 3 cm lang elk van het midden van de plant en van nabij het bodemoppervlak. Tot slot krijgen twee penwortel monsters, ook 3 cm lang elk, vanuit het midden van de wortel en van 1 cm achter de wortel tip. Plaats de monsters op drie afzonderlijke papieren zakken en label op de juiste wijze. </li><li> Na wassen en bemonstering alle planten in een blok, beginnen de verwerking verlaat, wordt wortels en uiteindelijk de stengels. </li><li> Surface steriliseren tkwesties in een steriele laminaire stroming kap als in 1.1, hierboven. Spoel elk monster driemaal door onderdompeling in steriel gedestilleerd water en laat het drogen in een steriele handdoek papier. Dan, ontleden en gooi de buitenste randen, waar endofyten zou kunnen zijn geëlimineerd door contact met desinfecterende middelen. </li><li> Snijd de bijgesneden monster in zes afdelingen, met een gemiddelde 6x6 mm voor bladeren en 6 mm lang voor stengels en wortels. Plaat de zes secties in een 60 mm Petri plaat met PDA medium aangevuld met antibiotica tetracycline, streptomycine en penicilline 2 mg / L elk. Dicht de plaat met parafilm en geïncubeerd in het donker bij 25 ° C. Elke plant levert zes borden, twee per plantendeel. </li><li> Verander het spoelwater na verwerking elk blok van een gegeven plantendeel. Ontdoen voordat het gebruikte spoelwater, een plaat 100 pl monster PDA media en incubeer gedurende 10 dagen bij 25 ° C gesteriliseerd succes te beoordelen. Als schimmelgroei ontstaat, houden geen rekening met de overeenkomstige monsters voor analyses. </li><li> Controleer de platen elke 2-3 dagen gedurende 20 dagen te observeren en opnemen schimmelgroei. Accijnzen en overdracht installatiedelen vertonen aanwezigheid van schimmel endofyten om platen met verse PDA. Dit voorkomt besmetting van naburige installatiedelen in de originele plaat. </li><li> Record B. bassiana groei van installatiedelen. Beauveria bassiana kunnen worden geïdentificeerd door karakteristieke witte dichte mycelia steeds crème tot lichtgele aan de rand. Bij twijfel, het monster te monteren in een druppel water en inspecteren onder een microscoop, op zoek naar bolvormig sporen en zigzag-vormige conidioforen, karakteristiek voor de soort. </li><li> Gebruik extra experimentele blokken om de gevolgen van de behandelingen op plantaardige biomassa te evalueren. Eerste meet de hoogte van de basis naar de top van het apicale meristeem. Dan, voorzichtig ontwortelen en wassen planten in leidingwater en laat ze drogen bij 45 ° C gedurende drie dagen de tijd om hun droge gewicht te bepalen. </li></ol>

<ol><li>Vega, F. E., Meyling, N. V., Luangsa-ard, J. J., Blackwell, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVega%2C+FE+%22Fungal+entomopathogens+in+Insect+Pathology%22">Fungal entomopathogens in Insect Pathology</a>. Vega, F. E., Kaya, H. K. , Elsevier. San Diego. 171-220 (2012).</li>
<li>Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+pathology+and+fungal+endophytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Insect pathology and fungal endophytes.</a> Journal of invertebrate pathology. 98, 277-279 (2008).</li>
<li>Sasan, R. K., Bidochka, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect-pathogenic+fungus+Metarhizium+robertsii+%28Clavicipitaceae%29+is+also+an+endophyte+that+stimulates+plant+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+botany%22%5BJournal%5D)">The insect-pathogenic fungus Metarhizium robertsii (Clavicipitaceae) is also an endophyte that stimulates plant root development.</a> American journal of botany. 99, 101-107 (2012).</li>
<li>Elena, G. J., Beatriz, P. J., Alejandro, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhizium+anisopliae+%28Metschnikoff%29+Sorokin+promotes+growth+and+has+endophytic+activity+in+tomato+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+biological+research%22%5BJournal%5D)">Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin promotes growth and has endophytic activity in tomato plants.</a> Advances in biological research. 5, 22-27 (2011).</li>
<li>Bing, L. A., Lewis, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Ostrinia+nubilalis+%28H%C3%BCbner%29%28Lepidoptera%3A+Pyralidae%29+by+endophytic+Beauveria+bassiana+%28Balsamo%29+Vuillemin%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+entomology%22%5BJournal%5D)">Suppression of Ostrinia nubilalis (Hübner)(Lepidoptera: Pyralidae) by endophytic Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin.</a> Environmental entomology. 20, 1207-1211 (1991).</li>
<li>Akello, J., Dubois, T., Coyne, D., Kyamanywa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+Beauveria+bassiana+in+banana+%28Musa+spp.%29+reduces+banana+weevil+%28Cosmopolites+sordidus%29+fitness+and+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+protection%22%5BJournal%5D)">Endophytic Beauveria bassiana in banana (Musa spp.) reduces banana weevil (Cosmopolites sordidus) fitness and damage.</a> Crop protection. 27, 1437-1441 (2008).</li>
<li>Gurulingappa, P., Sword, G. A., Murdoch, G., McGee, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+crop+plants+by+fungal+entomopathogens+and+their+effects+on+two+insect+pests+when+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Biological%22%5BJournal%5D)">Colonization of crop plants by fungal entomopathogens and their effects on two insect pests when in planta.</a> Biological. 55, 34-41 (2010).</li>
<li>Akello, J., Dubois, T., Coyne, D., Kyamanywa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+endophytic+Beauveria+bassiana+on+populations+of+the+banana+weevil%2C+Cosmopolites+sordidus%2C+and+their+damage+in+tissue-cultured+banana+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+experimentalis+et+applicata%22%5BJournal%5D)">Effect of endophytic Beauveria bassiana on populations of the banana weevil, Cosmopolites sordidus, and their damage in tissue-cultured banana plants.</a> Entomologia experimentalis et applicata. 129, 157-165 (2008).</li>
<li>Ownley, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beauveria+bassiana%3A+Endophytic+colonization+and+plant+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Beauveria bassiana: Endophytic colonization and plant disease control.</a> Journal of invertebrate pathology. 98, 267-270 (2008).</li>
<li>Ownley, B. H., Gwinn, K. D., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+fungal+entomopathogens+with+activity+against+plant+pathogens%3A+ecology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22BioControl%22%5BJournal%5D)">Endophytic fungal entomopathogens with activity against plant pathogens: ecology and evolution.</a> BioControl. 55, 113-128 (2010).</li>
<li>Akello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beauveria+bassiana+%28Balsamo%29+Vuillemin+as+an+endophyte+in+tissue+culture+banana+%28Musa+spp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin as an endophyte in tissue culture banana (Musa spp.).</a> Journal of invertebrate pathology. 96, 34-42 (2007).</li>
<li>Gómez-Vidal, S., Lopez-Llorca, L. V., Jansson, H. B., Salinas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+colonization+of+date+palm+%28Phoenix+dactylifera+L.%29+leaves+by+entomopathogenic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Endophytic colonization of date palm (Phoenix dactylifera L.) leaves by entomopathogenic fungi.</a> Micron. 37, 624-632 (2006).</li>
<li>Posada, F., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Ascomycota%3A+Hypocreales%29+as+an+endophyte+in+cocoa+seedlings+%28Theobroma+cacao%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Establishment of the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales) as an endophyte in cocoa seedlings (Theobroma cacao).</a> Mycologia. 97, 1195-1200 (2005).</li>
<li>Tefera, T., Vidal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+inoculation+method+and+plant+growth+medium+on+endophytic+colonization+of+sorghum+by+the+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana%5BTitle%5D)+AND+%22BioControl%22%5BJournal%5D)">Effect of inoculation method and plant growth medium on endophytic colonization of sorghum by the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana.</a> BioControl. 54, 663-669 (2009).</li>
<li>Posada, F., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inoculation+and+colonization+of+coffee+seedlings+%28Coffea+arabica+L.%29+with+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Ascomycota%3A+Hypocreales%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoscience%22%5BJournal%5D)">Inoculation and colonization of coffee seedlings (Coffea arabica L.) with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales.</a> Mycoscience. 47, 284-289 (2006).</li>
<li>Akello, J., Dubois, T., Coyne, D., Kyamanywa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+Beauveria+bassiana+dose+and+exposure+duration+on+colonization+and+growth+of+tissue+cultured+banana+%28Musa+sp.%29+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biological%22%5BJournal%5D)">The effects of Beauveria bassiana dose and exposure duration on colonization and growth of tissue cultured banana (Musa sp.) plants.</a> Biological. 49, 6-10 (2009).</li>
<li>Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inoculation+of+coffee+plants+with+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Ascomycota%3A+Hypocreales%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mycological+research%22%5BJournal%5D)">Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales).</a> Mycological research. 111, 748-757 (2007).</li>
<li>Brownbridge, M., Reay, S. D., Nelson, T. L., Glare, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+Beauveria+bassiana+%28Ascomycota%3A+Hypocreales%29+as+an+endophyte+following+inoculation+of+radiata+pine+seed+and+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+control%22%5BJournal%5D)">Persistence of Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales) as an endophyte following inoculation of radiata pine seed and seedlings.</a> Biological control. 61, 194-200 (2012).</li>
<li>Posada, F. J., Chaves, F. C., Gianfagna, T. J., Pava-Ripoll, M., Hebbar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+as+an+endophyte+in+cocoa+pods+%28Theobroma+cacao+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+U.D.C.A.+actualidad+%26+divulgaci%C3%B3n+cient%C3%ADfica%22%5BJournal%5D)">Establishment of the fungal entomopathogen Beauveria bassiana as an endophyte in cocoa pods (Theobroma cacao L.).</a> Revista U.D.C.A. actualidad & divulgación científica. 13, 71-78 (2010).</li>
<li>Quesada-Moraga, E., Landa, B. B., Muñoz-Ledesma, J., Jiménez-Díaz, R. M., Santiago-Alvarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+colonisation+of+opium+poppy%2C+Papaver+somniferum%2C+by+an+entomopathogenic+Beauveria+bassiana+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Endophytic colonisation of opium poppy, Papaver somniferum, by an entomopathogenic Beauveria bassiana strain.</a> Mycopathologia. 161, 323-329 (2006).</li>
<li>Biswas, C., Dey, P., Satpathy, S., Satya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+as+a+season+long+endophyte+in+jute+%28Corchorus+olitorius%29+and+its+rapid+detection+using+SCAR+marker%5BTitle%5D)+AND+%22BioControl%22%5BJournal%5D)">Establishment of the fungal entomopathogen Beauveria bassiana as a season long endophyte in jute (Corchorus olitorius) and its rapid detection using SCAR marker.</a> BioControl. , 1-7 (2011).</li>
<li>Bing, L. A., Lewis, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+the+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Balsamo%29+Vuillemin+in+different+tillage+regimes+and+in+Zea+mays+L.+and+virulence+towards+Ostrinia+nubilalis+%28H%C3%BCbner%29%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture%2C+ecosystems+%26+environment%22%5BJournal%5D)">Occurrence of the entomopathogen Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin in different tillage regimes and in Zea mays L. and virulence towards Ostrinia nubilalis (Hübner).</a> Agriculture, ecosystems & environment. 45, 147-156 (1993).</li>
<li>Akello, J., Sikora, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+acropedal+influence+of+endophyte+seed+treatment+on+Acyrthosiphon+pisum+and+Aphis+fabae+offspring+development+and+reproductive+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Biological%22%5BJournal%5D)">Systemic acropedal influence of endophyte seed treatment on Acyrthosiphon pisum and Aphis fabae offspring development and reproductive fitness.</a> Biological. 61, 215-221 (2012).</li>
<li>Reddy, N. P., Ali Khan, A. P., Devi, U. K., Sharma, H. C., Reineke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+millet+crop+plant+%28Sorghum+bicolor%29+with+the+entomopathogenic+fungus+%28Beauveria+bassiana%29+to+combat+infestation+by+the+stem+borer%2C+Chilo+partellus+Swinhoe+%28Lepidoptera%3A+Pyralidae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Asia+Pacific%22%5BJournal%5D)">Treatment of millet crop plant (Sorghum bicolor) with the entomopathogenic fungus (Beauveria bassiana) to combat infestation by the stem borer, Chilo partellus Swinhoe (Lepidoptera: Pyralidae.</a> Journal of Asia Pacific. 12, 221(2009).</li>
<li>Quesada-Moraga, E., Muñoz-Ledesma, F. J., Santiago-Alvarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+protection+of+Papaver+somniferum+L.+against+Iraella+luteipes+%28Hymenoptera%3A+Cynipidae%29+by+an+endophytic+strain+of+Beauveria+bassiana+%28Ascomycota%3A+Hypocreales%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+entomology%22%5BJournal%5D)">Systemic protection of Papaver somniferum L. against Iraella luteipes (Hymenoptera: Cynipidae) by an endophytic strain of Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales).</a> Environmental entomology. 38, 723-730 (2009).</li>
<li>Cherry, A. J., Banito, A., Djegui, D., Lomer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+the+stem-borer+Sesamia+calamistis+%28Lepidoptera%3B+Noctuidae%29+in+maize+following+seed+dressing%2C+topical+application+and+stem+injection+with+African+isolates+of+Beauveria+bassiana%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+pest+management%22%5BJournal%5D)">Suppression of the stem-borer Sesamia calamistis (Lepidoptera; Noctuidae) in maize following seed dressing, topical application and stem injection with African isolates of Beauveria bassiana.</a> International journal of pest management. 50, 67-73 (2004).</li>
<li>Gurulingappa, P., McGee, P. A., Sword, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+Lecanicillium+lecanii+and+Beauveria+bassiana+reduce+the+survival+and+fecundity+of+Aphis+gossypii+following+contact+with+conidia+and+secondary+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+protection%22%5BJournal%5D)">Endophytic Lecanicillium lecanii and Beauveria bassiana reduce the survival and fecundity of Aphis gossypii following contact with conidia and secondary metabolites.</a> Crop protection. 30, 349-353 (2011).</li>
<li>van Schoonhoven, A., Voysest, O. Common beans in Latin America and their constraints in Bean production problems in the tropics. Schwartz, H. F., Pastor-Corrales, M. A. , Second, CIAT. Cali. 33-57 (1989).</li>
<li>De Vos, M., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+and+no-choice+assays+for+testing+the+resistance+of+A.+thaliana+to+chewing+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Choice and no-choice assays for testing the resistance of A. thaliana to chewing insects.</a> J. Vis. Exp. (15), e683(2008).</li>
<li>Parsa, S., Sotelo, G., Cardona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+herbivore+resistance+mechanisms%3A+spittlebugs+on+Brachiaria+spp.+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Characterizing herbivore resistance mechanisms: spittlebugs on Brachiaria spp. as an example.</a> J. Vis. Exp. (52), e3047(2011).</li>
<li>Atamian, H., Roberts, P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+low+throughput+screens+with+root-knot+nematodes+Meloidogyne+spp%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High and low throughput screens with root-knot nematodes Meloidogyne spp.</a> J. Vis. Exp. (61), e3629 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Vele factoren kunnen invloed hebben op de specifieke uitkomst van een experiment om een ​​schimmel entomopathogen als een endofyt vast te stellen. Onze resultaten tonen de beëntingsmethode is er een van. Biologische factoren om te experimenteren met onder meer het gewas of de cultivar geselecteerd en de schimmel entomopathogen soort stam of isoleren gebruikt. Andere factoren om te overwegen het manipuleren van bijvoorbeeld de concentratie van het inoculum, de leeftijd van de plant tijdens de inentingen, en de plant groeiomstandigheden. Het zou ideaal zijn voor een inenting methode om de systemische planten kolonisatie leiden door een schimmel entomopathogen 14,17,18,21. In plaats daarvan blijkt dat infectiemethoden vaak een bepaald patroon van lokale kolonisatie bevorderen. In koffie, bijvoorbeeld, blad sprays voorstander blad kolonisatie overwegende dat de bodem doorweekt voorstander wortelkolonisatie 17. We vonden hetzelfde patroon in de gewone boon. Uiteindelijk moet de keuze van de inoculatie methodegeleid door de geplande locatie van de endofyt binnen een plant, vermoedelijk overeenkomt met de niche van het doel herbivoor of plant pathogeen. Hoewel vaak gebruikt, endofyt detectie en kwantificering op basis van media culturen kan kostbaar, moeilijk en gevoelig voor fouten. Zo werden er in totaal 10.800 installatiedelen (uitgeplaat op 1.800 petrischaaltjes) geëvalueerd in een experiment om B. te optimaliseren bassiana inentingen op banaan 16. Van deze werden 4.496 secties gekoloniseerd door een vermeende B. bassiana, zoals geïdentificeerd voornamelijk door kolonie morfologie. Uiteraard zou microscopische controle van de soort per kolonie is een gewenst maar onbetaalbaar stap. Anderzijds werden 1176 delen gekoloniseerd door andere schimmels en werden weggegooid en behandeld als ontbrekende gegevens 16. De kans bestaat echter dat B. bassiana was een arme concurrent of langzamer te groeien, en kan uiteindelijk zijn voortgekomen uit die secties als er eenllowed voldoende tijd. Daarom endofyt detectiemethoden op basis van media-culturen zijn onderworpen aan valse positieven en valse negatieven. Bijgevolg is de ontwikkeling van betrouwbare detectie en kwantificering, bijvoorbeeld die gebaseerd op polymerase chain reaction (PCR) assays 20,21,24 wordt gerechtvaardigd. Het uiteindelijke doel voor inoculatie-experimenten zou moeten zijn om een ​​efficiënte behandeling die duurzame systemische resistentie biedt tegen herbivorie en / of ziekte te ontwikkelen. Een plausibel, maar nog niet getest, hypothese is dat de mate van endofytische kolonisatie positief moeten correleren met de mate van endofyt-gemedieerde resistentie. Een logische volgende stap na verfijning infectiemethoden dus zou kunnen zijn om deze correlatie te onderzoeken. Verschillende video-protocollen kan onderzoekers helpen een geschikte weerstand test te ontwerpen voor een doel plaag-of ziektedruk 29-31. Uiteindelijk is deze assay wat bepaalt het succes van de inoculathode en de bijbehorende mogelijkheden voor endofytische biologische bestrijding.

Schimmel entomopathogens belangrijke regulatoren zijn van insecten populaties met een aanzienlijk potentieel als mycopesticides 1. Pas recent hebben echter schimmel entomopathogens aangetoond dat het plaatsvindt als endofyten, zowel natuurlijk als reactie op verschillende infectiemethoden 2. De ecologische functie van endofytische schimmel entomopathogens blijft grotendeels onbekend, maar sommige studies hebben ze in de groei van planten 3,4, herbivoor weerstand 5-8, en ziekteresistentie 9,10. De algemene doelstelling van de methoden die hier gepresenteerd is een schimmel entomopathogen te introduceren als een endofyt, ter voorbereiding van de volgende evaluaties van endofytische biologische bestrijding. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) is de best bestudeerde endofytische schimmel entomopathogen 5-9,11-19, en het is beschikbaar als een commercieel mycopesticide. Infectiemethoden getest om vast te stellen <em&gt; B. bassiana als endofyt zijn bodem doorweekt 14,17, zaadcoatings 18 en onderdompelingen 14, kiemwortel dressings 13,15, wortel en wortelstok onderdompelingen 11,16,18, stengel injecties 17, blad-sprays 14,17,20 en bloemtakken 19. Met behulp van deze methoden, hebben de onderzoekers geïntroduceerd B. bassiana in banaan 11, bonen 7, cacao 13, koffie 17, maïs 7, katoen 7, dadelpalm 12, jute 21, opium poppy 20, pompoen 7, pine 18, sorghum 14, tomaat 7 en tarwe 7. Recente gegevens wijzen erop dat endofytische B. bassiana heeft de potentie om planten te beschermen niet alleen geleedpotigen plagen 5-7,22-27, maar ook van een plantpathogenen 9. De gewone boon (Phaseolus vulgaris) behoort tot de meest kwetsbare gewassen tegen ziektenen ziekten. Het kan worden beïnvloed door meer dan 400 plagen en 200 pathogenen waarvan aanval wordt beschouwd als de meest beperkende factor boonproductie tussen regio 28 zijn. Bijgevolg kunnen de gewone boon zijn een uitstekend model gewas om het volledige spectrum van endofytische biologische bestrijding te onderzoeken door B. bassiana. Als eerste stap in deze richting, in dit artikel beschreven blad sprays en bodem doorweekt als inoculatie methoden om B.bassiana te introduceren als een endofyt in de gewone boon.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Naam van reagens/materiaal</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td></td></tr><tr><td>Mycotrol SE </td><td>Laverlam</td><td>4167</td><td></td></tr><tr><td>Nobele agar</td><td>Sigma</td><td>A5431-250G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline G natriumzout</td><td>Sigma</td><td>P3032-25MU</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal (100 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal (60 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Aardappel dextrose agar</td><td>Difco</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>Regelmatige bleekvloeistof (NaOCl)</td><td>CLOROX</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycinesulfaat zout</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>T3258-25G</td><td></td></tr><tr><td>Triple quince (NPK)</td><td>ABOCOL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Biologische veiligheidskast</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM LB microscoop</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

tot oprichting van schimmel entomopathogens als endofyten: op weg naar endofytische biologische bestrijding

Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Beauveria bassiana is een schimmel entomopathogen met de mogelijkheid om endophytically koloniseren planten. Als endofyt, B. bassiana kunnen een rol spelen bij het ​​beschermen van planten herbivorie en ziekte. Dit protocol laat twee infectiemethoden te stellen B. bassiana endophytically in de gewone boon (Phaseolus vulgaris), ter voorbereiding van de volgende evaluaties van endofytische biologische bestrijding. Planten worden gekweekt uit het oppervlak gesteriliseerde zaden gedurende twee weken voordat een B. bassiana behandeling van 10 8 conidia / ml (of water) toegepast hetzij als bladspray of een bodem doordrenken. Twee weken later worden de planten geoogst en hun bladeren, stengels en wortels worden bemonsterd om endofytische schimmelkolonisatie te evalueren. Hiervoor worden monsters afzonderlijk oppervlak gesteriliseerd, in meerdere secties gesneden en geïncubeerd in aardappel dextrose agar media gedurende 20 dagen. De media wordt gecontroleerd om de 2-3 dagen tot schimmelgroei te observeren alssamenhingen met installatiedelen en noteer het optreden van B. bassiana de omvang van de kolonisatie endofytische schatten. Analyses van inoculatie succes vergelijken het optreden van B. bassiana binnen een bepaald plantendeel (dat wil zeggen bladeren, stengels of wortels) over behandelingen en controles. Naast de beëntingsmethode de specifieke resultaat van het experiment afhangen van de gewassen soort of variëteit, de schimmel entomopathogen species stam of isolaat gebruikt en de plant groeiomstandigheden.

B. bassiana was in staat om endophytically-koloniseren P. vulgaris in reactie op de inoculatie behandelingen aangetoond (figuur 1). Zowel blad sprays en bodem doorweekt resulteerde in endofytische kolonisatie door B. bassiana in meer dan 80% van de behandelde planten (Figuur 2). De mate van kolonisatie afhankelijk van de geëvalueerde plantendeel en de gebruikte beëntingsmethode. Bladeren gereageerd best om spuiten inentingen. Wortels, anderzijds, reageerde alleen doordrenken inentingen. Tenslotte heeft ook te reageerde op beide infectiemethoden. B. bassiana werd niet gedetecteerd in de controle installatiedelen. Onafhankelijk van de behandeling, andere dan endofyten B. bassiana groeide van 15% van de geëvalueerde installatiedelen, maar ze werden ontleed uit de media platen voordat ze konden binnenvallen naburige secties en de resultaten beïnvloeden. Behandeling en controle planten waren zichtbaar onderscheiden twee weken na inentingen. Er werden geen verschillen gevonden in het drooggewicht en hun lengte. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Representatieve resultaten van inoculatie behandelingen op endofytische kolonisatie van bonen planten (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Door Beauveria bassiana Linksboven:. Controle platen zonder groei. Rechtsboven: Schimmel endofyt van een plant gedeelte vervuilende hele plaat. Linksonder: B. bassiana groeien van twee installatiedelen. Rechtsonder: Endofytische B. bassiana sporen en conidioforen gezien onder een microscoop. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="Figuur 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> Figuur 2. Effect van inoculatie behandelingen op endofytische kolonisatie van bean (Phaseolus vulgaris cv. Calima) door Beauveria bassiana, twee weken na inoculatie van de stam GHA. Percent kolonisatie geeft het aantal gekoloniseerde installatiedelen gedeeld door het aantal gekweekte secties.

Dit protocol laat twee inoculatie methoden om de schimmel entomopathogen introduceren<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; Als endofyt in de gewone boon (<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;), Ter voorbereiding van de volgende evaluaties van endofytische biologische bestrijding.

Tot oprichting van Schimmel Entomopathogens als endofyten: Op weg naar Endofytische Biologische bestrijding

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

Hallo. Mijn naam is Ush Parsa en ik ben entomoloog bij SEA aan het International Center for Tropical Agriculture. Ik ben ViiV Artiz, ook van het International Center for Tropical Agriculture, en ik ben Fernando Vega van het United States Department of Agriculture. Het algemene doel van deze video is om te demonstreren hoe men de vestiging van een schimmel in een pathogeen kan faciliteren en verifiëren.Als endofyt is het gebruikelijk om in de natuur een insect of mijt te vinden die is geïnfecteerd met een pathogene schimmel, en er is een lange geschiedenis van het gebruik van deze schimmelpathogenen als biologische bestrijdingsmiddelen. Recentelijk zijn schimmelpathogenen af en toe aangetroffen in planten, maar zonder dat er duidelijke symptomen van hun aanwezigheid optraden. Deze ontdekking wijst op hun potentieel voor gebruik als beschermende endofyten tegen landbouwongedierte.Om dit potentieel te onderzoeken, is het eerst essentieel om een inoculatiemethode te ontwikkelen die een schimmelpathogeen betrouwbaar als endofyt in een doelgewas vestigt. B Bassiana is een van de best bestudeerde schimmelpathogenen en is gemakkelijk verkrijgbaar als commercieel pesticide. Deze schimmel is aangetroffen als endofyt in veel plantensoorten, waaronder bananen, koffie en foelie.Recent bewijs suggereert dat B. bassiana in staat is om planten niet alleen tegen arthropodenplagen, maar ook tegen sommige plantpathogenen te beschermen. De mechanismen die deze breedspectrumbescherming verklaren, zijn nog onvoldoende begrepen. Toch kan dit in het gebied van de tic-klep veelbelovend zijn voor gewassen die geen genetische resistentie tegen een plaag of pathogeen hebben, maar voor gewassen die gewoonlijk lijden onder de gelijktijdige aanval van meerdere vijanden, waarbij fas vulgaris een primair voorbeeld is.Het kan worden aangetast door meer dan 400 plagen en 200 pathogenen, waarvan wordt aangenomen dat de aanval de meest beperkende factor voor de bonenproductie in verschillende regio's is. Om deze reden achten wij de gewone boon een geschikte kandidaat om het beschermende potentieel van Endo bbar te onderzoeken. Als eerste stap in deze richting demonstreert Arvid de effectiviteit van bladbespuitingen en bodeminoculaties als inoculatiemethoden om Bana als endofyt te vestigen.Zaden van de gewone boon uit de variëteit TOMA worden oppervlakgesteriliseerd door een tweeminutige onderdompeling in 0,5% natriumhypochloriet, gevolgd door een tweeminutige onderdompeling in 70% ethanol en drie spoelingen met steriel gedestilleerd water om het succes van de sterilisatie te verifiëren. Een monster van 100 µL van het spoelwater wordt geplaatst op een Petri-schaal van 100 mm met PDA-medium en 10 dagen in het donker geïncubeerd bij 25 °C. Het experiment dient te worden afgebroken en opnieuw gestart indien er groei wordt waargenomen in deze controles.Zaden worden in groepen van drie gezaaid in potten van 11,5 centimeter breed, gevuld met een dampgesteriliseerd mengsel van grond en zand in een verhouding van twee op één. Planten worden gekweekt onder gecontroleerde omstandigheden bij 25 °C, 50% relatieve vochtigheid en een fotoperiode van 12 uur met een lichtintensiteit van 9 200 lux, een week na kieming. De planten worden uitgedund tot één per pot om de vitaliteit te waarborgen en competitie te elimineren.Ze worden naar behoefte elke twee tot drie dagen geïrrigeerd en 10 en 20 dagen na het planten bemest met een oplossing van NPK-meststof van zes gram per liter water. Om de genetische uniformiteit van onze schimmels te waarborgen, moeten isolaten worden gekweekt vanuit enkele Canadese culturen. Als de bron van de schimmel een insect met mycose is, brengen we het specimen naar de laminaire flowkast en gebruiken we een entlus om een kleine hoeveelheid sporulerende DYS-schimmel over te brengen naar PDA-medium.Vervolgoverplantingen naar nieuwe mediumplaten kunnen noodzakelijk zijn om contaminanten te verwijderen zodra een doelschimmel groeit en zich verspreidt in een reine cultuur. Het kleine monster van sporen wordt gesuspendeerd in één milliliter van een 0,1% waterige oplossing van Triton X 100 en gevortexd; Triton X 100 is een surfactant die de oppervlaktespanning van water verlaagt en ervoor zorgt dat sporen dispergeren. Een aliquot van 100 µL van deze suspensie wordt uitgestreken op een Petri-schaal van 100 mm die een dunne laag 2,5% agar bevat, wat de visualisatie van sporen onder een stereoscoop mogelijk maakt.De plaat wordt 24 uur bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd, waarna één kiemend medium wordt overgebracht naar de mediaplaat met PDA en drie tot vier weken de tijd krijgt om te groeien totdat het de gehele mediaplaat bedekt en sporuleert. Deze methode levert een zuivere cultuur van de schimmel op voor daaropvolgende experimenten. Voor deze demonstratie gebruiken we een zuivere cultuur van Bavaria Bassiana, stam GH HA, verkregen uit het commerciële product Microt.Het inoculum wordt onder steriele omstandigheden voorbereid. In een laminaire flowkast gebruiken we een steriele spatel om ongeveer één gram van de schimmelgroei van het oppervlak van het medium af te schrapen en op te lossen in 10 milliliters steriele 0,1% Triton X. De suspensie wordt één minuut gevortexd en door een steriel kaasdoek gefilterd om de conidia van het mycelium te scheiden. Deze stap resulteert in een dikke suspensie die moet worden aangepast naar een eindconcentratie van 10⁸ conidia per milliliter voor de inoculaties.Ten eerste wordt de concentratie van de voorraad geschat via een seriële verdunning die het tellen van kedia vergemakkelijkt. In een Hema Cytometer worden 100 µL van de voorraad verdund in 900 µL 0,1% Triton X en gevortext, wat resulteert in een verdunning van 1:10. De procedure wordt seriëel nog drie keer herhaald om een verdunning van 1:10.000 te verkrijgen.In de eerste verdunning zullen de kedia in extreem grote aantallen aanwezig zijn, terwijl ze in de laatste verdunning in lage aantallen voorkomen die eenvoudig geteld kunnen worden. Beide kamers van de Hema-cytometer worden gevuld met 10 µL van de 1:10.000 verdunning en onder een microscoop geplaatst om de kedia te tellen. Het getuurde gebied van de Hema-cytometer bestaat uit negen grote vierkanten die elk 100 nL of dienovereenkomstig 0,0001 mL bevatten.Om de concentratie ED in het monster te schatten, tellen we de ED in de vier grote hoekvierkanten van elke kamer, berekenen we hiervan het gemiddelde en delen we dit gemiddelde door 0,0001. Door deze concentratie te vermenigvuldigen met onze verdunningsfactor van 10.000, verkrijgen we de concentratie van de stockoplossing om vervolgens het uiteindelijke volume te berekenen waartoe een stockoplossing moet worden aangepast. Om een inoculum van 10 38 edia per milliliter te verkrijgen, passen we de formule toe.Het eindvolume is gelijk aan het volume van de voorraadoplossing vermenigvuldigd met de concentratie van de voorraadoplossing, gedeeld door de eindconcentratie. In onze demonstratie moet de voorraadoplossing worden aangevuld tot een eindvolume van 195.5 milliliters om de gewenste concentratie te verkrijgen. Voordat het inoculum wordt gebruikt, is het belangrijk om een kiemtest uit te voeren om de levensvatbaarheid van de kanalen te beoordelen.Voor deze test brengen we 100 µL van de 1:10.000 verdunning aan op een Petri-schaal van 100 mm met 2,5% noble egg of medium. Het monster wordt met een steriele glazen staaf over het oppervlak van het medium verspreid en 24 uur in het donker geïncubeerd bij 25 °C. De levensvatbaarheid wordt onder de microscoop beoordeeld door het percentage media met een groeiende kiembuis te schatten.Voor drie willekeurige monsters van 100 sporen kan de Canadese suspensie alleen voor inoculaties worden gebruikt als de gemiddelde kieming boven de 90% ligt. In deze demonstratie vinden we een gemiddelde kieming van 97%. We zullen twee inoculatiemethoden demonstreren, bladsprays en bodembegietingen, die beide worden toegepast wanneer de planten hun eerste echte bladstadium bereiken. Ongeveer 14 dagen na het planten wordt de bladspraymethode uitgevoerd met een handmatige verstuiver die de suspensie op de abaxiale of bovenzijde van de bladeren richt tot ze verzadigd zijn. De bovenkant van elke pot wordt bedekt met aluminiumfolie om runoff naar de bodem te voorkomen. Na het spuiten wordt elke plant gedurende 24 uur afgedekt met een plastic zak om een hoge luchtvochtigheid te behouden, wat de schimmelinvasie faciliteert.De inoculatiemethode via bodemdrenching wordt uitgevoerd bij de veldcapaciteit van de bodem. Ongeveer 24 uur nadat de planten tot verzadiging zijn bewaterd, worden 10 milliliters van een cial suspensie op het bodemoppervlak aangebracht. De controleplanten ontvangen aan de basis een steriele 0,1% Triton X, op dezelfde wijze aangebracht als bij de overeenkomstige behandelingen.De planten worden teruggeplaatst in de groeikamers en gerangschikt in een gerandomiseerd volledig blokontwerp met drie herhalingen per behandeling. We hebben de vestiging twee weken na de inoculaties geëvalueerd, één blok per keer. De planten worden zorgvuldig geoogst en per plant individueel afgespoeld onder stromend kraanwater.We nemen monsters van twee bladscheutjes, twee stukjes wortel en twee stukjes stengel. De bladscheutjes worden willekeurig geselecteerd van het eerste echte blad van de plant en bijgesneden tot vierkanten. Stengelsamples van ongeveer drie centimeter lang worden verkregen uit het midden van de plant en van vlakbij het bodemoppervlak. Penwortelmonsters van een soortgelijke lengte worden verkregen uit het midden van de wortel en vanaf één centimeter achter de wortelpunt.Elk monster wordt individueel oppervlaktesteriliseerd in een steriele zuinigheidskap in 0,5% natriumhypochloriet gedurende twee minuten, gevolgd door 70% ethanol gedurende twee minuten, waarna het drie keer wordt gespoeld met steriel gedestilleerd water voordat het aan de lucht wordt gedroogd. Op steriel keukenpapier wordt het gesteriliseerde monster vervolgens voorzichtig gedissecteerd om de buitenrand te verwijderen, waar endofyten mogelijk zijn geëlimineerd door contact met de desinfectiemiddelen. Het getrimde monster wordt vervolgens in kleinere secties gesneden van gemiddeld zes bij zes millimeter voor bladeren en zes millimeter lang voor stengels en wortels.De secties worden geplaatst op Petriplaten van 60 millimeter met PDA, aangevuld met de antibiotica tetracycline, streptomycine en penicilline in een concentratie van elk twee milligram per liter. Ten slotte worden de platen verzegeld met paraffine en in het donker geïncubeerd bij 25 graden Celsius. Het spoelwater wordt na de verwerking van elk blok vervangen, maar voordat een monster van 100 microliter op een Petriplaat van 100 millimeter met PDA-medium wordt geplaatst en 10 dagen lang bij 25 graden Celsius wordt geïncubeerd om vast te stellen of de sterilisatie succesvol was.Als er groei wordt waargenomen in deze controle, wordt het blok weggegooid en niet meegenomen in de analyse. De platen worden elke twee tot drie dagen gedurende 20 dagen geïnspecteerd om schimmegroei waar te nemen en te registreren. Gekoloniseerde plantsecties worden uitgesneden en individueel overgebracht naar nieuwe mediumplaten om contaminatie van naburige secties te voorkomen.De groei van B bassiana wordt geregistreerd op basis van karakteristieke witte, dichte mycelia die aan de rand crèmekleurig tot bleekgeel worden. Bij twijfel wordt het monster in een druppel water op een microscoopglaasje geplaatst en onderzocht op globale scania en zigzagvormige kedia force, die kenmerkend zijn voor de soort; op dezelfde dag wordt de kolonisatie geëvalueerd. We schatten daarnaast de impact van onze behandelingen op de plantengroei in.We meten eerst de plantlengte vanaf de basis van de plant tot aan de top van het groeipunt. Vervolgens trekken we de planten voorzichtig uit de grond, wassen we ze met kraanwater en laten we ze drie dagen drogen bij 45 °C om het drooggewicht te bepalen. Voor deze demonstratie hebben we het volledige experiment tweemaal uitgevoerd om representatieve resultaten te verkrijgen.Beide inoculatiemethoden resulteerden in fysicalisatie door Bana in meer dan 80% van de behandelde planten. De mate van kolonisatie was echter afhankelijk van het geëvalueerde plantendeel en de gebruikte inoculatiemethode. De bladeren reageerden het best.Wortels reageerden daarentegen alleen op drench-inoculaties, terwijl spray-inoculaties geen effect hadden. Tot slot reageerden stengels vergelijkbaar op beide inoculatiemethoden. Bana werd niet gedetecteerd in enige van de gecontroleerde plantsecties, onafhankelijk van de behandeling met endofyten, behalve Bana die in 15% van de geëvalueerde plantsecties werd aangetroffen; deze werden echter uit de mediaplaten gesneden voordat ze naburige secties konden binnendringen en onze resultaten konden beïnvloeden.De behandelde planten en de controleplanten waren twee weken na de inoculaties visueel niet van elkaar te onderscheiden, en er werden geen significante verschillen vastgesteld in hun droggewicht en in hun hoogte. Veel factoren kunnen de specifieke uitkomst van een experiment beïnvloeden om een endopathogeen als een eindeffect vast te stellen. Zoals deze video demonstreert, is de inoculatiemethode daar één van; biologische factoren waarmee men kan experimenteren zijn onder andere de gekozen gewassoort of het ras en de keuze van de OMA-pathogeensoort of het isolaat. Andere factoren waarvan manipulatie kan worden overwogen zijn de concentratie van het inoculum, de leeftijd van de plant tijdens de inoculaties en de groeiomstandigheden van de plant.Het uiteindelijke doel van deze experimenten moet zijn om een efficiënte behandeling te ontwikkelen die een duurzame systemische resistentie biedt tegen INE of ziekten. Wanneer u klaar bent om te testen op resistentie gemedieerd door endofyten, raden wij u aan een video te bekijken over de karakterisering van Herbal Resistance Mechanisms, eveneens gepubliceerd in het Journal of Visualized Experiments. Houd er rekening mee dat endofyten zeer algemeen voorkomen in planten en dat ze waarschijnlijk uw vermogen beïnvloeden om een doelwit-schimmelpathogeen persistent als endofyten te vestigen en te detecteren.We hopen dat u deze demonstratie nuttig vindt. Veel succes met uw experimenten.

establishing-fungal-entomopathogens-as-endophytes-towards-endophytic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hierbij rapporteren we de verschillende fasen die betrokken zijn bij de kennisgebaseerde ontwikkeling van een effectief mycoinsecticide, waaronder de isolatie, identificatie, screening en selectie van de "best fit" entomopathogene schimmel, Metarhizium anisopliae , voor de bestrijding van insectenpest in de landbouw .

Ontwikkeling<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Als een mycoinsecticide: van isolatie tot veldprestatie

Hier presenteren we een protocol op basis van het meelworm (Tenebrio molitor)-aassysteem dat werd gebruikt voor het isoleren en selecteren van entomopathogene schimmels (EPF) uit bodemmonsters. Een effectieve conidia-getalformule (ECN) wordt gebruikt om een hoge stresstolerante EPF te selecteren op basis van fysiologische kenmerken voor microbiële bestrijding van plagen in het veld.

Isolatie en selectie van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters en evaluatie van schimmelvirulentie tegen insectenplagen

Entomopathogene schimmels hebben aan belang gewonnen als de biologische bestrijders van landbouwinsectenplagen. In deze studie werd de massaproductie van een voldoende aantal veerkrachtige infectieuze propagules van Zuid-Afrikaanse isolaten van zowel Metarhizium robertsii als M. pinghaense voor commerciële toepassing tegen insectenplagen met succes uitgevoerd met behulp van landbouwproducten.

Massaproductie van entomopathogene schimmels, Metarhizium robertsii en Metarhizium pinghaense, voor commerciële toepassing tegen insectenplagen

Entomopathogene schimmelkolonies worden geïsoleerd uit tropische bodemmonsters met tenebrio-aas , Galleria-aas en selectief kunstmatig medium, d.w.z. aardappeldextrose-agar verrijkt met gistextract aangevuld met chlooramfenicol, thiabendazool en cycloheximide (CTC-medium).

Vergelijking van methoden voor het isoleren van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters

Entomopathogene nematoden leven in symbiose met bacteriën en samen infecteren ze met succes insecten door hun aangeboren immuunsysteem te ondermijnen. Om onderzoek naar de genetische basis van nematodeninfectie te bevorderen, worden methoden beschreven voor het handhaven en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden.

Kweken en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden

Vanwege de ondoorzichtigheid van de bodem kunnen interacties tussen de samenstellende microben niet gemakkelijk worden gevisualiseerd met cellulaire resolutie. Hier worden twee microfluïdische hulpmiddelen gepresenteerd, die nieuwe mogelijkheden bieden voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties. De apparaten zijn veelzijdig en eenvoudig te gebruiken, waardoor hoge spatiotemporale controle en beeldvorming met hoge resolutie op cellulair niveau mogelijk is.

Microfluïdische hulpmiddelen voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties op cellulair niveau

Het huidige artikel heeft tot doel gedetailleerde en adequate protocollen te bieden voor de isolatie van plant-geassocieerde endofytische schimmels, langdurige bewaring van isolaten, morfologische karakterisering en totale DNA-extractie voor daaropvolgende moleculaire identificatie en metagenomische analyses.

Isolatie, karakterisering en totale DNA-extractie om endofytische schimmels in mycoheterotrofe planten te identificeren

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerd vrijstaand bioassaysysteem voor het evalueren van de effectiviteit van entomopathogene schimmels (EPF) tegen de mosterdluis (Lipaphis erysimi (Kalt.)), een parthenogenetisch insect. De methode schetst het gegevensverzamelingsproces tijdens experimenten met petrischaaltjes, waardoor onderzoekers consequent de virulentie van EPF kunnen meten tegen mosterdbladluizen en andere parthenogenetische insecten.

Beoordeling van bladluis effect van entomopathogene schimmels tegen parthenogenetisch insect, mosterdluis, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van entomopathogene schimmels van een boshoutboorder en een vervangende manier om hun entomopathogene activiteiten te evalueren met behulp van een Coleoptera-modelinsect. Deze methode is efficiënt en handig voor het verkennen van entomopathogene schimmelbronnen van houtborende insectenplagen in natuurlijke bossen.

Isolatie, gedragsidentificatie en pathogeniteitsbeoordeling van entomopathogene schimmels van een boshoutboorder

We beschrijven het gebruik van dunne-laagchromatografie, directe bioautografie-assay en vloeistofchromatografie-massaspectrometrie om microbiële natuurlijke producten te identificeren die antagonisme vertonen tegen schimmelpathogenen, met behulp van de ziekteverwekker Sclerotinia sclerotiorum en biopesticide Bacil-isolaten als modelsysteem.

Bioassay-geleide identificatie van natuurlijke producten voor biologische bestrijding door dunnelaagchromatografie-directe bioautografie

Er werd een bioassayprotocol met losstaande bladeren opgesteld voor het massaal kweken van chilitrips met behulp van een aangepaste methode met vrijstaande bladeren in agarhoudende glazen containers, wat een hoge overleving en gesynchroniseerde ontwikkeling garandeert. Dit systeem maakt een efficiënte screening van entomopathogene schimmelvirulentie tegen 2e instar-larven mogelijk en biedt een betrouwbare tripsvoorziening voor laboratorium-, kas- en veldevaluaties.

Opzetten van een kweeksysteem voor chilitrips (Scirtothrips dorsalis hood) voor virulentiescreening van entomopathogene schimmels

Leer twee inoculatiemethoden om Beauveria bassiana als endofyt in Phaseolus vulgaris te introduceren. Dit protocol ondersteunt duurzame biologische bestrijding in de landbouw.

Tot oprichting van Schimmel Entomopathogens als endofyten: Op weg naar Endofytische Biologische bestrijding

Meer video's verkennen