Peptide-gebaseerde identificatie van functionele Motieven en hun bindingspartners

Deze video presenteert een reeks van vier experimenten die worden gebruikt voor het identificeren van functionele HIV-1 Nef-proteinmotieven en voor de ontwikkeling van peptidegebaseerde remmers. Specifieke korte peptiden, afgeleid van motieven in eiwitten in volledige lengte, behouden zowel hun biologische functie als hun vermogen om de functie van het eiwit in volledige lengte competitief te remmen om apoptotische motieven te identificeren. Bij HIV-1 Nef worden Jurkat-cellen blootgesteld aan Nef-scanningpeptiden en wordt een TUNEL-apoptose-assay uitgevoerd om peptiden te identificeren die apoptose induceren.

Een tweede reeks peptiden die variaties bevatten van een NEF-secretiemotief. De secretiemodificatieregio of SMR wordt samen met NPH GFP in cellen getransfecteerd; functieverlies van NPH GFP als gevolg van competitieve inhibitie wordt aangegeven door een verminderde secretie van nph. GFP wordt beoordeeld via fluorometrie om cellulaire factoren te identificeren die interageren met de secretiemodificatieregio of SMR van nef.

Co-precipitaties worden uitgevoerd met SMR wild type NPH als bait. Ten slotte worden, om te testen of deze interacties de secretie beïnvloeden, antilichamen tegen geïdentificeerde bindingspartners in cellen getransfecteerd. Om te beoordelen of zij de secretie van het NF-motief antagoniseren, identificeren de verkregen resultaten twee functionele apoptotische motieven in NEF en een inhibitorpeptide dat een functioneel NEF-secretiemotief alsook de cellulaire bindingspartners die nodig zijn voor secretie antagoniseert.

Het algemene doel van deze set van vier experimenten is om de identificatie van functionele motieven in doeleiwitten te versnellen en deze gegevens vervolgens te gebruiken voor de ontwikkeling van peptide-gebaseerde remmers van deze functionele motieven. Deze set protocollen is voor onze groep nuttig geweest bij het beantwoorden van kernvragen met betrekking tot de pathogenese van hiv, zoals het begrijpen van de rol van neff-gestuurde secretie bij pathogenese en het ontcijferen van de mechanismen die ten grond liggen aan het vermogen van neff om het exosomale transportpad te manipuleren. Vandaag zullen de procedures worden gedemonstreerd door Dr. Ming Bo Huang, die onderzoekinstructeur is in mijn laboratorium.

Begin deze procedure met een set peptiden die de voor dit experiment relevante regio scannen. 20-mer peptiden met een overlap van 10 aminozuren die het gehele HIV-1 NPH-eiwit beslaan, werden verkregen via het AIDS-reagentiaprogramma. Om NPH-apoptotische motieven te identificeren, wordt een apoptose-assay uitgevoerd met de NEF-scanningspeptiden afzonderlijk als volgt: voeg één milliliter kweekmedium toe dat 10 nanogram per milliliter peptide bevat per 35 millimeter plaat met jerk hat-celculturen, en incubeer de culturen gedurende 24 uur bij 37 °C.

Voer na de incubatie een terminale deoxynucleotidyltransferase-gemedieerde DUTP-biotine-nick- en labelingsanalyse of TUNEL-assay uit om apoptose te beoordelen. Was hiervoor eerst de cellen met PBS, aspireer vervolgens het PBS en voeg 4% paraformaldehyde in PBS toe; incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te fixeren. Was de cellen na fixatie met PBS en voeg Triton X 100 toe; incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur om ze te permeabiliseren. Voeg na de fixatie en permeabilisatie van de cellen het TUNEL-reagens toe en incubeer de cellen gedurende één uur bij 37 °C.

Spoel de cellen twee keer met PBS. Bepaal vervolgens het percentage gekleurde cellen via epi-fluorescentie op een computergestuurd microscopiesysteem. Na het transfecteren van jca-cellen met NPH, GFP-plasmide en verschillende variaties van het SMR-peptide met behulp van de chariot protein delivery reagent kit, zoals beschreven in het bijbehorende document, wordt het medium geoogst om de transfectie-efficiëntie via fluorescentiemicroscopie te bepalen.

Leg fluorescentie- en brightfield-beelden vast en bepaal het percentage cellen. Om vervolgens de inhibitie van NPH GFP-secretie te beoordelen, brengt u 100 µL van het celvrije geconditioneerde medium over naar individuele wells van een zwarte 96-well microtiterplaat. Gebruik een fluorimeter met een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 515 nm om de GFP-fluorescentie in het medium te meten in relatieve fluorescentie-eenheden.

Nadat de meting is voltooid, worden de gegevens overgedragen naar een pc. Stel het niveau van GFP-fluorescentie in het controlemedium in op 100%. Vergelijk dit vervolgens met het niveau van GFP-fluorescentie in het medium van cellen die gecotransfecteerd zijn met verschillende SMR-peptiden om veranderingen in de NPH-GFP-secretie vast te stellen. De co-IP voor het isoleren van motiefbindende partners is een lastige stap.

Zorg ervoor dat de kralen tijdens de incubaties goed worden geschud en dat bij elke wasstap zoveel mogelijk vloeistof van de kralen wordt verwijderd. Kweek Jurkat-cellen in RPMI 1640-medium met 10% FBS bij 37 °C in een T 75 weefkweekfles. Pelletiseer de cellen door centrifugatie bij 1000 ×g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de celpellet in 1 mL PBS en breng deze over naar een microcentrifugebuisje van 1,5 mL.

Centrifugeer gedurende één minuut bij 1000 ×g. Resuspendeer vervolgens het pellet in één milliliter Anti-Flag lysisbuffer door voorzichtig te pipetteren in een microcentrifuge.

Centrifugeer de suspensies bij 2000 ×g gedurende vijf minuten en bij 13 000 ×g gedurende 10 minuten. Verzamel het supernatant, hierna aangeduid als het lysaat, om respectievelijk het celdebris en het DNA te pelletteren. Voeg na bepaling van de eiwitconcentratie één milligram lysaat-eiwit en één microgram van ofwel het SMR wild-type of het SMR-mutante peptide toe aan 20 µL Anti-Flag M2 affiniteitsgel.

Deze affiniteitsgel wordt hierna aangeduid als de hars. Breng het mengsel aan met co IP-buffer tot een eindvolume van 1 ml. Bereid daarnaast een negatieve controle voor waarin het lysaat wordt gecombineerd met de hars in afwezigheid van beide peptiden. Incubeer de mengsels gedurende de nacht bij 4 °C met end-over-end rotatie.

Pellet de hars de volgende dag door microcentrifugatie bij 5.000 tot 8.000 ×g gedurende 30 seconden. Wacht na het centrifugeren één tot twee minuten voordat de monsters worden gehanteerd, zodat de hars in de buis kan bezinken. Verwijder het supernatant met een nauwe pipetpunt of een Hamilton-spuit, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen hars wordt overgebracht.

Was de hars vier keer door deze te resuspenderen in 500 µL wasbuffer, gevolgd door microcentrifugatie. Om de gebonden cellulaire eiwitten te elueren, wordt 15 µg overmaat three x flag-peptide in 50 µL wasbuffer aan de buis toegevoegd. Incubeer dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rocker-shaker. Centrifugeer na de incubatie 30 seconden bij 5.000 tot 8.000 ×g.

Laat de buisjes twee minuten bezinken, waarna het supernatant met de geëlueerde eiwitten wordt verzameld en bewaard. Nadat de EITs zijn geconcentreerd door acetonprecipitatie, worden de monsters gekookt in laly monsterbuffer. Scheid vervolgens de eiwitten via SDS-PAGE op een 40 tot 20% triss, HCL criterion precast gel en kleur de gel met kumasi brilliant blue R two 50.

Om antilichaaminhibitie te beoordelen, worden JCA-cellen gecotransfecteerd met NGFP en ofwel anti-α-tubuline of anti-mortality-antilichamen met gebruik van de chariot protein delivery reagent kit zoals beschreven in het bijbehorende document; verzamel vervolgens het celvrije geconditioneerde medium van de geoogste cellen. Breng 100 µL over naar individuele putjes van een zwarte 96-wells microtiterplaat. Meet daarna de GFP-fluorescentie in het medium met een fluorimeter bij een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 515 nm in relatieve fluorescentie-eenheden.

Nadat de plaat is uitgelezen, worden de gegevens overgezet naar een pc en wordt het niveau van GFP-fluorescentie in de anti-fat tubulin controle ingesteld op 100%. Vergelijk dit met het niveau van GFP-fluorescentie in het medium van cellen die niet zijn getransfecteerd met het anti-mortaliteitsantilichaam om veranderingen in de NEF GFP-secretie te bepalen. Om apoptotische motieven van HIV-1 Nef-eiwitten in kaart te brengen, werd een peptide-scanninganalyse uitgevoerd zoals beschreven in deze video. De y-as toont het percentage TUNEL-gelabelde cellen en de x-as geeft de behandelingsconditie aan. Zoals hier te zien is, zijn twee afzonderlijke regio's van HIV-1 Nef geïdentificeerd die apoptose induceren. Deze worden aangeduid door een verhoogde TUNEL-labeling van cellen die zijn blootgesteld aan Nef-peptiden.

De pieken van apoptose worden aangeduid als motief één en motief twee om de competitieve inhibitie van neff-secretie door SMR wild-type peptiden te beoordelen. Kweekmedium van Jurkat T-cellen, gecotransfecteerd met een NPH GFP-kloon en diverse SMR-peptiden, werd geanalyseerd op exosomale NPH-secretie, zoals aangetoond door GFP-fluorescentie in het medium. Peptiden die één of meer wild-type NPH SMR-sequentiemotieven bevatten, inhibeerden de secretie van exosomale NEF, terwijl vervanging van elk aminozuur binnen deze regio door alanine de effectiviteit van de peptiden sterk verminderde. Dit suggereert dat het SMR wild-type peptide exosomale nph inhibeert, een gescramblade versie van 11 aminozuren van het apoptotische motief van neff. Eén SM één, eerder beschreven en verkregen van Sigma Genesis, werd gebruikt als negatieve controle en had geen effect op de exosomale NEP-secretie.

Deze afbeelding van de met Coomassie gekleurde SDS-PAGE-gel laat de co-immunoprecipitatie zien van vier eiwitten door het SMR wild-type peptide met grootten van 60, 65, 75 en 250 kilodalton. Het negatieve controle-SMR-mutantpeptide legde deze eiwitten niet vast, en deze eiwitten vertoonden geen aspecifieke interactie met de affiniteithars. In afwezigheid van het SMR wild-type peptide suggereren deze resultaten dat de co-geprecipiteerde eiwitten specifiek interacteerden met de SMR-motieven van het SMR wild-type peptide.

De plaatlezer-assay laat zien dat cotransfectie van het anti-mortaal antilichaam met het neph-expressieplasmid de exomaal NPH-secretie volledig ophief. Het niet-gerelateerde antilichaam had geen effect op de exomaal ne-secretie. Deze resultaten suggereren dat een intacte NM-talentinteractie vereist is voor exomaal neph-secretie.

Concluderend zou u na het bekijken van deze video een goed begrip moeten hebben ontwikkeld van hoe de beschreven technieken kunnen worden gebruikt om functionele motieven in doeleiwitten te identificeren en hoe deze gegevens kunnen worden aangewend om peptidegebaseerde remmers van deze functionele motieven te ontwikkelen. Bij het uitvoeren van de co-IP-procedure is het cruciaal om zorgvuldige aandacht te besteden aan de incubatiewassingen; zorg ervoor dat de beads tijdens de incubaties voldoende worden geschud en dat bij elke wasstap zoveel mogelijk vloeistof uit de beads wordt verwijderd. Laat daarnaast bij de wassingen van de cellen en het lysaat-hars de hars altijd bezinken na de centrifugatie.

Gebruik pipetpunten met een smalle opening en voer vier wasbeurten uit om de achtergrond voldoende te verminderen tot aanvaardbare niveaus.