Peptide-gebaseerde identificatie van functionele Motieven en hun bindingspartners
30 juni 2013
Technieken om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de afscheiding van HIV-1 Nef in exosomes ontleden worden beschreven. Specifieke korte peptiden afgeleid van Nef en eiwit transfectie werden uitgebuit om de structuur, functie, en bindende partners van Nef's Secretion Wijziging Region bepalen. Deze procedures hebben algemene belang in veel mechanistische studies.
Deze video presenteert een reeks van vier experimenten die worden gebruikt voor het identificeren van functionele HIV-1 NPH-eiwitmotieven en voor het ontwikkelen van op peptiden gebaseerde remmers. Specifieke korte peptiden afgeleid van motieven in volledige eiwitten, behouden zowel hun biologische functie als remmen competitief de functie van het volledige eiwit om apoptotische motieven te identificeren. In HIV-1 NEF jerk cat-cellen worden blootgesteld aan NEF-scanpeptiden en een tunnel apoptose-assay wordt uitgevoerd om peptiden te identificeren die apoptose induceren.
Een tweede set peptiden met variaties op een NEF-secretiemotief. De secretiemodificatieregio of SMR wordt samen met NPH GFP-verlies van functie door competitieve remming getransfecteerd in cellen, aangegeven door verminderde secretie van nph. GFP wordt beoordeeld door fluorometrie om cellulaire factoren te identificeren die interageren met de secretiemodificatieregio of SMR van nef.
Coun-precipitaties worden uitgevoerd met behulp van SMR wild-type NPH als lokaas. Ten slotte, om te testen of deze interacties de secretie beïnvloeden, worden antilichamen tegen geïdentificeerde bindingspartners getransfecteerd in cellen. Om te beoordelen of ze de NF-motiefsecretie antagonizeren, identificeren de verkregen resultaten twee functionele apoptotische motieven in NEF en een remmerpeptide dat een functioneel NEF-secretiemotief antagonizeert, evenals de cellulaire bindingspartners die voor secretie vereist zijn.
Het algemene doel van deze reeks van vier experimenten is om de identificatie van functionele motieven in doeleiwitten te versnellen en vervolgens die gegevens te gebruiken om peptide-basisremmers van deze functionele motieven te ontwikkelen. Deze set protocollen is nuttig geweest voor onze groep om ons te helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot HIV-pathogenese, zoals het begrijpen van de rol van nef-aangedreven secretie in pathogenese en het ontcijferen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan nef's vermogen om de exosomale transportroute te manipuleren. Vandaag zal Dr. Ming Bo Huang, een onderzoeksassistent in mijn laboratorium, de procedures demonstreren.
Begin deze procedure met een reeks peptiden die het gebied van belang voor dit experiment scannen. 20 mer-peptiden met een overlap van 10 aminozuren die het volledige HIV-1 NPH-eiwit beslaan, werden verkregen van het AIDS-reagensprogramma. Om NPH-apoptosemotieven te identificeren, voert u een apoptose-assay uit met behulp van de NEF-scanpeptiden afzonderlijk als volgt: voeg een milliliter kweekmedium toe met 10 nanogram per milliliter peptide per 35 millimeter bord van jerk hat-celculturen en incubeer de culturen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius.
Na de incubatie voert u een terminaal desoxynucleotidyltransferase-gemedieerde DUTP, biotin-nick en labeling- of tunnel-assay uit om apoptose te beoordelen. Om dit te doen, wast u eerst de cellen met PBS, aspireert u de PBS en voegt u 4% Paraformaldehyde in PBS toe, incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te fixeren. Na het fixeren van de cellen, wast u ze met PBS en voegt u Triton X 100 toe, incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om ze te permeabiliseren. Na het fixeren en permeabiliseren van de cellen, voegt u tunnelreagens toe en incubeer de cellen gedurende één uur bij 37 graden Celsius na permeabilisering.
Spoel de cellen twee keer met PBS. Bepaal vervolgens het percentage gekleurde cellen door epifluorescentie op een computergestuurd microscoopsysteem. Na transfectie van jca-cellen met NPH, GFP-plasmide en verschillende variaties van het SMR-peptide met behulp van chariot-eiwitbezorgingsreagenskit zoals beschreven in het bijbehorende document, verzamelt u het medium om de transfectie-efficiëntie te bepalen door middel van fluorescentiemicroscopie.
Maak fluorescente en lichtveldbeelden en bepaal het percentage cellen. Vervolgens om de remming van NPH GFP-secretie te beoordelen, brengt u 100 microliter van het celvrije geconditioneerde medium over naar afzonderlijke putjes van een 96-putjes zwarte microtiterplaat. Gebruik een fluorimeter met excitatiegolflengte 485 nanometer en emissiegolflengte 515 nanometer om de GFP-fluorescentie in het medium te meten in relatieve fluorescentie-eenheden.
Nadat de meting is voltooid, brengt u de gegevens over naar een pc. Stel het niveau van GFP-fluorescentie in het controlemedium op 100% in. Vergelijk dit vervolgens met het niveau van GFP-fluorescentie in het medium van cellen die co-getransfecteerd zijn met verschillende SMR-peptiden om veranderingen in NPH GFP-secretie te bepalen. De co-IP voor het isoleren van motiefbindingspartners is een moeilijke stap.
Zorg ervoor dat de kralen goed worden geschud tijdens de incubaties en dat zoveel mogelijk vloeistof wordt verwijderd uit de kralen tijdens elke wasstap. Laat jerk hat-cellen groeien in RPMI 1640-medium met 10%FBS bij 37 graden Celsius in een T 75 weefselkweekkolf, bepaal de celpelleti door centrifugatie bij 1000 keer G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer het cellenpellet in één milliliter PBS en breng het over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.
Centrifugeer gedurende één minuut bij 1000 keer G. Resuspendeer vervolgens het pellet in één milliliter Anti-Flag-lyseringsbuffer door voorzichtig pipetten en differentieel microcentrifugeren.
De suspensies bij 2000 keer G gedurende vijf minuten en bij 13.000 keer G gedurende 10 minuten. Om het cellulaire debris en DNA te pelleten, verzamelt u het supernatant, hierna lysaat genoemd. Na bepaling van de eiwitconcentratie, voegt u één milligram lysate-eiwit en één microgram van de SMR wild-type of SMR-mutante peptide toe aan 20 microliters van Anti-Flag M two affiniteitsgel.
Dit affiniteitsgel wordt hierna het hars genoemd. Breng het mengsel op een eindvolume van één milliliter in co-IP-buffer. Bereid ook een negatieve controle voor waarin het lysaat wordt gecombineerd met hars in afwezigheid van een van beide peptiden. Incubeer de mengsels gedurende één nacht bij vier graden Celsius met eind-over-einde rotatie.
<Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft technieken om de mechanismen van HIV-1 Nef-secretie in exosomen te onderzoeken. Het benadrukt het gebruik van specifieke peptiden en eiwittransfectie om de structuur en functie van Nef's Secretion Modification Region te verkennen.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Virologie
- Celbiologie
Achtergrond
- HIV-1 Nef is een cruciaal eiwit dat betrokken is bij virale pathogenese.
- Inzicht in de secretiemechanismen kan inzichten bieden in de biologie van HIV.
- Exosomen spelen een belangrijke rol in intercellulaire communicatie.
- Peptid-gebaseerde remmers kunnen helpen bij het bestuderen van eiwitfuncties.
Doel van het onderzoek
- Om de mechanismen van HIV-1 Nef-secretie te ontleden.
- Om bindingspartners van het Secretion Modification Region te identificeren.
- Om peptid-gebaseerde remmers te ontwikkelen die gericht zijn op Nef.
Gebruikte methoden
- Transfectie van cellen met peptiden afgeleid van Nef.
- Fluorometrische beoordeling van Nef-GFP-secretie.
- Apoptotische assays om functionele motieven te identificeren.
- Competitieve remmingsstudies met behulp van korte peptiden.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van peptiden die apoptose induceren in HIV-1 Nef.
- Demonstratie van verminderde secretie van Nef-GFP als gevolg van competitieve remming.
- Karakterisering van cellulaire factoren die interageren met Nef's Secretion Modification Region.
- Inzichten in de biologische functies van afgeleide peptiden.
Conclusies
- De studie biedt waardevolle technieken voor het onderzoeken van HIV-1 Nef.
- Peptid-gebaseerde benaderingen kunnen belangrijke functionele motieven onthullen.
- Inzicht in Nef-secretie kan therapeutische strategieën tegen HIV informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This peptide-based approach enables rapid identification of functional motifs in pathogenic proteins, supporting target validation and mechanistic de-risking in antiviral discovery. By using short overlapping peptides to pinpoint apoptosis-inducing and secretion-modifying regions, the method accelerates hypothesis testing and inhibitor design. The competitive inhibition format provides a direct path to peptide-based therapeutics that disrupt protein-protein interactions critical to viral function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Identifies functional motifs responsible for apoptosis induction and protein secretion in HIV-1 Nef.
- Operational Value: Uses overlapping 20-mer peptides with 10-amino acid shifts to systematically scan functional domains.
- Therapeutic Value: Reveals motifs that can be competitively inhibited to block pathogenic activity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Enables fluorometric quantification of secreted Nef-GFP as a measurable output for inhibition studies.
- Reproducibility: Standardizes co-immunoprecipitation with SMRwt peptide as bait to isolate specific binding partners.
- Scalability: Supports high-throughput screening of peptide variants for inhibitory potency against exosome secretion.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links Nef secretion via exosomes to HIV pathogenesis, a mechanism of intercellular viral signaling.
- Translational Continuity: Uses peptide inhibitors to validate target engagement and mechanism of action in cellular models.
- Predictive De-risking: Demonstrates that disrupting Nef-mortalin interaction abolishes exosomal secretion, supporting target essentiality.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where motif mapping informs inhibitor design and target validation precedes preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking specific peptides to apoptotic and secretory functions through gain- and loss-of-function assays.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence readouts from secreted GFP to measure inhibition of Nef exosome secretion.
- Analytics: Enables comparison of peptide variants via fluorescence intensity to rank inhibitory potency and specificity.
- Translational Research: Connects motif inhibition to reduced exosomal Nef release, a pathway implicated in viral immune evasion.
- Enterprise Reuse: The peptide scanning and co-IP workflow can be adapted to other pathogenic proteins with known functional domains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into Nef-driven apoptosis and exosome secretion, reducing ambiguity in target function.
- Operational Value: Standardizes peptide-based binding assays and secretion readouts for cross-project consistency.
- Strategic Value: Enables early go/no-go decisions by validating whether peptide inhibition phenocopies full-length protein blockade.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of motifs with dual functionality in apoptosis and secretion for broader therapeutic impact.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peptide handling, transfection, and fluorescence-based secretion assays.
- Dependent on fluorometry platforms capable of detecting GFP in conditioned medium at 485/515 nm.
- Necessitates standardized co-IP protocols with controlled bead washing to minimize background in binding partner identification.
- Must account for peptide solubility and stability when testing inhibitory concentrations across variants.
- Limited to proteins where functional motifs can be inferred from known domains or prior structural data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:55
Nef Scanning Peptide TUNEL Assay
4:43
Competitive Inhibition Analysis Using Peptides
9:25
Nef-GFP Secretion Fluorescent Plate Reader Assay of Antibody Inhibition
13:23
Conclusion
6:02
Isolating Motif Binding Partners Using Peptides as Bait
10:33
Identification of Nef Functional Motifs and their Binding Partners
