Name: Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryos van Arabidopsis thaliana Zaden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Leer een efficiënte methode voor het isoleren van vroege embryo's uit Arabidopsis thaliana zaden. Deze techniek maakt transcriptoom- en epigenoomanalyse mogelijk voor plantenontwikkelingsonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen graag Tal Nawy en Martin Bayer bedanken voor hun advies over embryo isolement. MTR, VG, UG en CB bedacht het embryo isolatie materiaal. MTR, VG en CB ontwikkelde het embryo isolatie protocol. MTR, VG en CB gevestigde het protocol, die de embryo&#39;s, en de gegenereerde embryo cDNA, VG deed de PCR, MTR de GUS kleuring, JJ de FISH experimenten. MTR, VG, CG en UG schreef het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door de Universiteit van Zürich, een Fellowship van de Roche Research Foundation (MTR), en subsidies van de Zwitserse Nationale Stichting (tot UG en CB).

De procedure wordt samengevat in het in figuur 1 getoonde stroomdiagram. De microcapillairen en instrumentele instellingen worden getoond in Figuur 2 en Figuur 3, en typische stappen embryo isolement getoond in figuur 4. 1. Materiaal en Buffer Voorbereiding 1.1 Silicon coating van glas microcapillairen <ol><li> Plaats de microcapillairen in een 15 ml Falcon buis met ~ 5 ml Sigmacote (Sigma) en zwenken meerdere malen. </li><li> Verwijder de oplossing, plaats de Falcon buis met de capillairen in een aluminiumfolie en bak ze gedurende 3 uur bij 60 ° C. Bewaar bij kamertemperatuur. </li></ol> 1.2 Verkrijgen ~ 50-100 micrometer diameter microcapillaire tips <ol><li> Pull 1 mm diameter glazen capillairen handmatig over een bunsenbrander of met behulp van een commerciële trekker (verticale filament puller of micropipet trekker). </li><li> Gebruik een diamant-tip pen of mes aan de punt van de getrokken capillaire gesneden om de gewenste opening te creëren. Selecteer de beste-vormige capillairen onder een stereomicroscoop. De opening moet 50-100 urn (figuur 2). </li></ol> 1.3 Slide voorbereiding <ol><li> Siliconize schoon dia&#39;s door die alle de putten met Sigmacote (~ 1 ml / glijbaan) gedurende 5 minuten, te verwijderen. Bak 3 uur in aluminiumfolie. Bewaar bij kamertemperatuur. </li><li> Was de multi-well glazen microscoopglaasjes gedurende 10 min in 10% SDS, 2 x 2 min in nuclease-vrij water (geautoclaveerd DEPC-DDH 2 O), 2 min in 70% ethanol, 2 minuten in 100% ethanol, lucht- drogen. Alle stappen worden gedaan in geautoclaveerde Coplin potten. Slides kunnen worden hergebruikt meerdere keren verschaffen grondige reiniging tussen elk gebruik. </li><li> Vlak voor embryo isolatie verspreid ~ 0,5 ui 10 mg / ml runderserumalbumine (BSA) met een pipet over het gehele oppervlak van elk putje en drogen. </li></ol> 1.4 Microscoop en capillaire setup &lt;ol&gt; <li> Gebruik een omgekeerde microscoop met 10x en 20x objectief. Optimaliseer het licht contrast (embryo&#39;s zijn heel transparant). </li><li> Plaats een micromanipulator om de glazen capillair naast de microscoop te houden. Het glazen capillair is verbonden met een microinjector (figuur 3A) of een normale P-200 pipet via een rubberen slang (figuur 3B, zie Discussion voor een gedetailleerde beschrijving van deze opstelling). </li><li> Plaats de capillaire boven objectglaasje met een hoek ~ 70 ° (fig. 3) en stel de positie van de opening in het gezichtsveld hebben. </li><li> Vlak voor embryo isolatie nemen en los ~ 5-10 gl BSA (1 mg / ml) het bekleden van de capillair. </li></ol> 1.5 Buffers Tabel 1 geeft de isolatie en de bestemming buffers afhankelijk van de downstream-toepassingen. <ol><li> Bereid ~ 1 ml isolatie buffer per monster vers vóór gebruik en bewaar deze op ijs. </li><li> Bereid de bestemming buffer in een 0,5 ml Eppendorf buis met lage bindingsaffiniteit op ijs (moleculaire toepassingen) of op een objectglaasje (cytologische toepassingen) in een vochtige kamer. </li></ol> 2. Zaad Dissection en Embryo Extraction 2.1 Synchronisatie van Seed Development <ol><li class="jove_content"> Ontmannen bloemen en houd ze 2 dagen in de groei kamer terwijl het vermijden van contact van de blootgestelde stampers met andere bloemen, dan bestuiven ze (bijv. 11). </li><li class="jove_content"> Test de fase van ontwikkeling onder je groeiomstandigheden door microscopisch onderzoek van gewist zaden. Met onze groei-omstandigheden (16 uur licht bij 21 ° C, 8 uur donker bij 18 ° C en 70% luchtvochtigheid) zaden verzameld 2,5 dagen na bestuiving (DAP) leverde voornamelijk 2-4 cel embryo&#39;s en zaden verzameld 3,5-4 DAP leverde bolvormige embryo. </li></ol> 2.2 Seed Dissection en Rupture <ol><li> Verwijder de sBehoeften 10-15 siliques (~ 2.5 DAP) onder een stereomicroscoop met een pincet en insuline naalden. </li><li> Dompel de zaden in 20 gl isolatiebuffer in een 2 ml rondbodem Eppendorf buisje geplaatst op ijs. </li><li> Voorzichtig verpletteren de zaden met een plastic stamper (vooraf gereinigd met 10% SDS, gespoeld met DEPC-DDH 2 O en gewassen met 70% ethanol) aan de embryo los wanneer het extract troebel. De kracht van toepassing is moet worden vastgesteld door elke gebruiker op proef. </li><li> Spoel de stamper met 300 ul van isolatie buffer om de stamper te wassen en verdun het monster. </li><li> Spin-down het extract bij 5000 xg gedurende 5 sec. Voorzichtig resuspendeer de pellet extract door pipetteren up-en-down 2-3 keer. </li><li> Filtreer het extract met een 30 um nylon (gemonteerd op buis adapters, bv van PartecCelltricks). Spoel het gaas met een extra 200 ul isolatie buffer. </li></ol> 3. Embryo Isolatie 3.1 Slide voorbereiding <ol> &lt;li&gt; Plaats een schone, BSA-gecoate en gesiliconiseerde multi-well glijbaan op het podium van de omgekeerde microscoop, resuspendeer het gefilterde extract van de zaden door pipetteren zachtjes op en neer en pipet 2 druppels van 40-50 ul extract van de zaden in 1 of 2 waterputten . Screening slechts 1 of 2 druppels per keer voorkomt verdamping van het monster. </li><li> Breng 50 pl vers isolatiebuffer (1 st wash druppel) in een putje van een andere dia bereid zoals voorheen. Bewaar deze dia in een overdekte, vochtige kamer om verdamping te voorkomen. </li></ol> 3.2 Scherm, schoon, verzamelen <ol><li> Screenen de druppeltjes extract van embryo&#39;s in het gewenste stadium met de 10x vergroting doelstelling. Indien nodig, bevestig het podium met de 20x vergroting. De embryo meestal naar de bodem van de schuif. </li><li> Handmatig verwijderen van rommel rond het embryo met een wolfraam naald, een insuline naald of soortgelijke apparatuur. </li><li> Verplaats de glazen capillaire nabij het embryo met behulp van de micromanipulator, take het embryo met zo weinig mogelijke oplossing. </li><li> Verzamel een aantal embryo&#39;s (bv. al een druppel) en laat ze in de 1 e wassen druppel (moleculaire toepassing) of in de bestemming buffer (cytologische toepassingen). Elke verzameling ronde moet binnen 5-10 minuten en embryo&#39;s worden bewaard in een minimaal volume (het totale volume van alle verzamelen ronden moet &lt;5 ul be) worden verzameld. </li><li> Herhaal de screening en ophalen tot de gewenste hoeveelheid embryo wordt verzameld in de 1e wash druppel (centrale, indien mogelijk, herinnering vergemakkelijken). </li><li> Herinneren alle embryo&#39;s in een keer uit het wassen druppel (als puin worden overgedragen, verwijder ze dan met een naald vóór herinnering). </li><li> Laat de embryo&#39;s in een 2 e wassen daling van 50 pl. Herhalen 3.2.6. </li><li> Laat de embryo&#39;s in de bestemming buffer. De overdracht mag slechts betrekking hebben op een contact, en niet onderdompeling, van de capillaire tip. </li><li> Vervang de microcapilLary voor het volgende monster. </li></ol>

<ol><li>Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+demethylation+of+repetitive+elements+during+seed+development+underlies+gene+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting.</a> Science. 324, 1447-1451 (2009).</li>
<li>Muller, B., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinin+and+auxin+interaction+in+root+stem-cell+specification+during+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis.</a> Nature. 453, 1094-1097 (2008).</li>
<li>Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+parent-of-origin+allelic+expression+in+Arabidopsis+thaliana+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds.</a> PLoS One. 6, 23687-23 (2011).</li>
<li>NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://estdb.biology.ucla.edu/seed/">http://estdb.biology.ucla.edu/seed/</a> (2006).</li>
<li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+gene+expression+and+metabolic+network+dynamics+during+embryo+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).</li>
<li>Nawy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GATA+factor+HANABA+TARANU+is+required+to+position+the+proembryo+boundary+in+the+early+Arabidopsis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 19, 103-113 (2010).</li>
<li>Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+triploid+endosperm+genome+of+Arabidopsis+adopts+a+peculiar%2C+parental-dosage-dependent+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization.</a> Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).</li>
<li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145, 707-719 (2011).</li>
<li>Wohrmann, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+DNA+methylation-independent+imprinting+control+region+at+the+Arabidopsis+MEDEA+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus.</a> Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).</li>
<li>Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+Flexibility+of+Genomic+Imprinting+during+Seed+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development.</a> Plant Cell. 23, 16-26 (2011).</li>
<li>Rea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+DNA+methylation+of+imprinted+genes+in+Arabidopsis+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm.</a> J. Vis Exp. 47 (47), e2327(2011).</li>
<li>SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics">http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics</a> (2010).</li>
<li>Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+WOX+genes+mediates+apical-basal+axis+formation+in+the+Arabidopsis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 14, 867-876 (2008).</li>
<li>Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana+MEDEA+Polycomb+group+protein+controls+expression+of+PHERES1+by+parental+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting.</a> Nature. 37, 28-30 (2005).</li>
<li>Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf">http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf</a> (2007).</li>
<li>Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).</li>
<li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of single cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2634(2011).</li>
<li>Nodine, M. D., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+and+paternal+genomes+contribute+equally+to+the+transcriptome+of+early+plant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos.</a> Nature. 482 (7383), (2012).</li>
<li>Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fusions%3A+beta-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).</li>
<li>Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polycomb+group+protein+MEDEA+and+the+DNA+methyltransferase+MET1+interact+in+Arabidopsis+to+repress+autonomous+endosperm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development.</a> Plant J. 73 (5), In Press (1111).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

We ontwikkelden een embryo isolatieprotocol dat snel doeltreffende en kan gemakkelijk worden overgedragen naar andere laboratoria. De hier beschreven apparatuur bestaat uit een omgekeerde microscoop, een micromanipulator, glas microcapillairen, een verticale gloeidraad trekker en een microinjector (figuur 3A). De opstelling is vergelijkbaar met die beschreven voor de enkele dierlijke cel isolement transcriptomics analyses 17. We hebben ook met succes gewerkt met e...

De embryo van bloeiende planten wordt omgeven door het endosperm, een voedingsweefsel afgeleid van een tweede fertilisatiegebeurtenis. Zowel embryo en endosperm zijn omgeven door verschillende cellagen van de zaadhuid. Gezamenlijk vormen deze weefsels een zaad dat in de vrucht te ontwikkelen. Zo zijn weefsel-en cel-specifieke analyses van Arabidopsis embryo&#39;s sterk aangetast vanwege hun ontoegankelijkheid. Toch embryo&#39;s in de late-bolvormige of latere stadia zijn relatief goed vatbaar voor handmatige dissectie met behulp van fijne wolfraam naalden onder de stereomicroscoop, of door lichte druk op het zaad met behulp van een tang om ze te halen. Dergelijke technieken zijn met succes toegepast transcriptoom of epigenoom profilering analyses zoals microarray hybridisatie bisulfietsequencing of RNA sequentie (bijvoorbeeld 1-3). In tegenstelling, studies van embryo&#39;s in de zygote tot begin bolvormige stadium blijven technisch uitdagend. Tot op heden slechts een paar studies hebben reported transcriptoomanalyses op jonge embryo&#39;s met behulp van laser-capture microdissectie (LCM) van embryonale weefsels van vaste zaad hoofdstukken 4 of manuele extractie van individuele embryo vanuit zaden met behulp van fijne instrumenten 5. Echter, LCM apparatuur niet algemeen beschikbaar en handmatige extractie embryo in een vroeg stadium is tijdrovend en vereist uitstekende dissectie vaardigheden die niet makkelijk overdraagbaar. Naast genoom-brede analyses, in situ genexpressie analyses zijn ook moeilijk te voeren op jonge hele-mount embryo van Arabidopsis. Tot op zekere hoogte kunnen jonge embryo op objectglaasjes worden vrijgegeven door lichte druk op de zaden en gebruikt voor reporter assays of proteindetectie door immunokleuring (zie bijvoorbeeld 6,7). Deze techniek is echter niet mogelijk high-throughput embryo isolatie, waardoor kwantitatieve analyse belemmeren. Daarom is een efficiënt en snel ontwikkeld protocolvoor vroege embryo isolatie van Arabidopsis zaden die is eenvoudig op te zetten, gemakkelijk overdraagbaar, en geschikt voor een verscheidenheid van downstream toepassingen. Het basisprincipe is om voorzichtig te verpletteren zaden - ontleed van jonge siliques in een Eppendorf buisje met een plastic stamper in een geschikte isolatie buffer. Het extract wordt in druppels op een multi-well glijbaan en gescreend op de aanwezigheid van vrijgekomen embryo&#39;s in de gewenste fase met behulp van een omgekeerde microscoop. Embryo&#39;s worden verzameld met behulp van een glazen microcapillaire bevestigd aan een microinjector of een standaard laboratorium pipet. Voor moleculaire toepassingen, worden embryo&#39;s tweemaal gewassen door herhaalde introductie in druppels van nieuwe isolatie buffer voor het overzetten naar de bestemming buffer in een minimaal volume. Voor cytologische toepassingen (reporter assays, immunokleuring, FISH), kunnen wasstappen worden weggelaten. De methode biedt verschillende voordelen: (i) het levert 25-40 embryo ~ 45 min voor cytologische appcaties of 3-4 uur gedurende moleculaire toepassingen (waaronder de wasstappen), (ii) het mogelijk isoleren van specifieke embryonale stadia, (iii) het kan gemakkelijk worden overgedragen aan andere personen laboratoria vanwege de eenvoudige installatie, (iv) vereist betaalbaar Voorzieningen voor basale configuratie die vatbaar is voor upgrades, en (v) werd met succes gebruikt voor verschillende stroomafwaartse toepassingen zoals RNA sequencing 8, genspecifieke DNA-methylatie analyse 9 reporter assays (10 en Raissig et al.., in prep.) en VIS (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux ongepubliceerde, zie figuur 5).

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>SIGMA</td><td>SL2-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Invitrogen (life technologies)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>First- strand buffer</td><td>Invitrogen (life technologies)</td><td>18064-022</td><td>contained in Superscript II package</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen (life technologies)</td><td>18064-022</td><td>contained in Superscript II package</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml </td><td>New England Biolabs Inc.</td><td></td><td>Different suppliers will also work </td></tr><tr><td>Thin wall Capillaries 1.0 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind tube 0.5 ml</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>0030108.035</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics&#916; 30 &#956;m</td><td>PARTEC</td><td>04-0042-2316</td><td></td></tr><tr><td>5wells 10 mm diameter slides</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63421-10</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slide</td><td>Thermo Fisher</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gl&#228;ser</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Fluka</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>Micro Pestle</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>Microfine insulin syringes</td><td>BD</td><td>U-100</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Forceps N5</td><td>Dumont</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer Pico Chip</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon TMS (Japan),</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Leitz</td><td></td><td>Leica</td></tr><tr><td>Micomanipulator Post mount LH1 probe</td><td>Leica microsystems</td><td>39430101</td><td>Different brand will also do the work</td></tr><tr><td>Vertical filament puller</td><td>Sutter instrument</td><td>P-20 model</td><td>Other model are also suitable </td></tr><tr><td>Cell Tram vario</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>5176.000.033</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Invitrogen (life technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo&#39;s van<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; zaden

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In bloeiende planten, het embryo zich ontwikkelt binnen een voedende weefsel - het endosperm - omringd door de moederlijke zaad integumenten (of zaadhuid). Als gevolg daarvan, is de isolatie van de plant embryo&#39;s in een vroeg stadium (1 cel tot bolvormige stadium) technisch uitdagende vanwege hun relatieve ontoegankelijkheid. Efficiënte handmatige dissectie in de aanloopfase wordt sterk belemmerd door de kleine omvang van jonge Arabidopsis zaden en de kleverigheid van het embryo aan het omringende weefsel. Hier beschrijven we een werkwijze die de efficiënte isolatie van jonge Arabidopsis embryo maakt, bevatten tot 40 embryo&#39;s in 1 uur tot 4 uur, afhankelijk van de stroomafwaartse toepassing. Embryo&#39;s worden uitgebracht in een isolement buffer met iets breken 250-750 zaden met een plastic stamper in een Eppendorf buis. Een glazen microcapillaire bevestigd aan ofwel een standaard laboratorium pipet (via een rubberen buis) of een hydraulisch gestuurde microinjector wordt gebruikt om embryo&#39;s te verzamelen van druppeltjes plaatsd op een multi-well slide op een omgekeerde lichtmicroscoop. De technische vaardigheden die nodig zijn eenvoudig en gemakkelijk overdraagbaar, en de basis-setup is dure apparatuur nodig. Verzamelde embryo&#39;s zijn geschikt voor verschillende stroomafwaartse toepassingen zoals RT-PCR, RNA sequentie, DNA methylatie analyse, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), immunokleuring en reporter assays.

Onze embryo isolatieprocedure (figuur 1) maakt isolatie van maximaal 40 embryo&#39;s in 4 uur als wassingen worden uitgevoerd, bijvoorbeeld voor moleculaire toepassingen, of in minder dan een uur als wast zijn weggelaten, bijvoorbeeld voor cytologische toepassingen. Figuur 2 toont hoge en lage kwaliteit microcapillaire tips en Figuur 3 de inrichting van de embryo isolatie machine. Figuur 4 toont het proces van embryo isolatie op het om...

Wij rapporteren een efficiënte en eenvoudige methode om embryo&#39;s te isoleren in een vroeg stadium van de ontwikkeling van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Zaden. Tot 40 embryo&#39;s kunnen worden afgezonderd 1 uur tot 4 uur, afhankelijk van de stroomafwaartse toepassing. De procedure is geschikt voor transcriptome, DNA-methylatie, reporter genexpressie, immunostaining en fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie analyses.

Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo&#39;s van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Zaden

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Het algemene doel van deze procedure is om jonge plantembryo's te isoleren. Dit wordt bereikt door eerst de zaden te dissecteren. De tweede stap is om de zaden voorzichtig te pletten in een isolatiebuffer.Vervolgens worden embryo's gescreend en verzameld door micro-aspiratie onder een omgekeerde microscoop. De laatste stap is om alle embryo's na het wassen opnieuw te verzamelen in een minimale hoeveelheid en ze over te brengen naar de bestemmingsbuffer. Uiteindelijk kunnen embryo's worden gebruikt voor RNA- of DNA-extractie om het transcriptoom of epigenoom te analyseren, of voor cytologische analyses, zoals gen-reporterassays, of fluorescente in situ hybridisatie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om plantembryo's in bulk en in specifieke ontwikkelingsstadia te kunnen isoleren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode geen problemen ondervinden om het snel en efficiënt toe te passen. Om te beginnen, selecteer de best gevormde capillairen onder een stereomicroscoop die eerder siliconiseerd, getrokken en gesneden zijn.Zoals beschreven in het tekstprotocol, moet de opening glad zijn en ongeveer 50 tot 100 micron. Was vervolgens de siliconisatie multi-well glazen microscoopglazen in coplin potten gedurende 10 minuten in 10%SDS volgende detergentwas. Was de glazen twee keer gedurende twee minuten.In nucleasevrij water gedurende twee minuten in 70%ethanol gedurende twee minuten in 100%ethanol en droog vervolgens aan de lucht. Verspreid vervolgens ongeveer 0,5 microliter 10 milligram per milliliter bovien serum albumine, of BSA met een pipet over het hele oppervlak van elk wel en droog aan de lucht. Bereid vervolgens de embryo-isolatiemicroscoop voor.Gebruik een omgekeerde microscoop met een objectief van 10 x en 20 x vergroting. Verbind de glazen capillair met een micro-injector om de micro capillair te coaten. Neem ongeveer zes microliter BSA op en laat het los.Verzamel sleeks in het gewenste ontwikkelingsstadium, hetzij na kruisingen of zelfbevruchtingen alleen. 2,5 dagen na bestuiving worden hier gebruikt en bevatten twee tot vier cel embryo's. Verwijder de zaden van 10 tot 15 LIC's onder een stereomicroscoop met pincetten en insuline naalden.Dompel de zaden in 20 microliter isolatiebuffer in een twee milliliter ronde bodem eendbuis geplaatst op ijs. Plettl de zaden voorzichtig met een plastic stamper voorgereinigd zoals beschreven in het tekstprotocol om de embryo's vrij te maken totdat het zaadextract troebel is. De kracht die moet worden toegepast, moet door elke gebruiker bij proef worden bepaald.Spoel de stamper met 300 microliter isolatiebuffer om de stamper te wassen en het monster te verdunnen. Draai het extract neer met 5.000 chi gedurende vijf seconden na centrifugatie. Breng het bezinkte extract voorzichtig weer in suspensie door het op en neer te pipetten twee tot drie keer.Filter het extract met een 30 micron nylon gaas gemonteerd op buisadapters en slinger de buis. Spoel het gaas met nog eens 200 microliter isolatiebuffer en slinger. Weer. Om dia's voor embryo-isolatie voor te bereiden, plaats een schone BSA-gecoate en siliconiseerde multi-well slide op het stadium van de omgekeerde microscoop.Plaats de capillair boven de slide en pas de positie aan om de opening in het gezichtsveld te hebben. Na Resus, suspendeer het gefilterde zaadextract door voorzichtig op en neer te pipetten twee druppels van 40 tot 50 microliter zaadextract in een of twee putjes. Screening slechts één of twee druppels tegelijk, voorkomt verdamping van het monster, plaats 50 microliter verse isolatiebuffer in een putje van een andere slide voorbereid zoals eerder.Om als eerste wasdruppel te dienen. Bewaar deze slide in een afgedekte vochtige kamer om verdamping te voorkomen. Screen de druppels zaadextract op embryo's in het gewenste stadium met het objectief van 10 x vergroting indien nodig.Bevestig het stadium met de 20 x vergroting. De embryo's zinken meestal naar de bodem van de slide. Het belangrijkste aspect van deze procedure is om embryo's te verzamelen met minimale puin.Dit kan worden bereikt door te reinigen met een wolfraamnaald, door zorgvuldig de wasdruppel te controleren op potentieel gedragen puin en door wassing te herhalen indien nodig. Verwijder handmatig puin rond het embryo met een wolfraamnaald, een insulinenaad of soortgelijk materiaal. Beweeg de glazen capillair in de buurt van het embryo met behulp van de micro manipulator en neem het embryo op met zo min mogelijk oplossing.Verzamel verschillende embryo's en laat ze vrij in de eerste wasdruppel. Voor moleculaire toepassingen voor cytologische toepassingen kunnen de embryo's direct naar de bestemmingsbuffer gaan. Elke verzameltronde moet binnen vijf tot tien minuten worden gehouden en embryo's moeten in een minimale hoeveelheid worden verzameld.Herhaal het screenen en verzamelen totdat de gewenste hoeveelheid embryo's in de eerste wasdruppel is verzameld. Als er puin in de wasdruppel wordt overgedragen, verwijder deze met een naald voordat alle embryo's tegelijk worden opnieuw verzameld uit de druppel. Laat de embryo's vrij in een tweede wasdruppel van 50 microliter en herhaal de herhaling.Ten slotte worden de embryo's in de bestemmingsbuffer vrijgelaten. De overdracht mag alleen een contact zijn en geen onderdompeling van de capillaire punt getoond. Hier zijn verschillende embryo's in de laatste druppel na wassen.De geïsoleerde plantembryo's kunnen nu worden gebruikt voor verschillende downstream toepassingen om de embryonale CD NA.Bibliotheken te beheersen vóór sequencing. Embryospecifieke transcripten werden aangetoond versterkt. Hier zijn de resultaten van PCR-amplificatie op CD NA.Bibliotheken van twee tot vier cel embryo's gewassen één keer, en op genomisch DNA embryo-isolatie heeft zich zeer nuttig bewezen in reportergen-assays met lage embryonale expressie en waar de maternale zaadmantel detectie verwart getoond hier is een embryo dat een GUS-reportergen tot expressie brengt onder de controle van de Madea-promotor.Ten slotte werd fluorescente in C twee hybridisatie toegepast om de nucleaire architectuur in geïsoleerde

efficient-rapid-isolation-early-stage-embryos-from-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont een procedure voor het isoleren van intacte protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis. Gezien het feit dat de geïsoleerde protoplasten intact blijven gedurende minstens 96 uur en worden geïsoleerd van zaailingen in plaats van een-maand-oude volwassen planten, deze procedure versnelt assays die intact protoplasten.

Isolatie van Protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis thaliana</em

Imprinting is een fenomeen in plant en zoogdier reproductie. DNA-methylatie speelt een belangrijke rol in de mechanismen van imprinting. Isoleren endosperm en het bepalen van methylatie status van de ingeprente genen...

Bepaling van de DNA-methylatie van genen in Imprinted Arabidopsis Endosperm

We presenteren de procedure om een zaadhuid beddengoed assay (SCBA) monteren van Arabidopsis thaliana zaden. De MKBA bleek een krachtig instrument genetisch en in vitro onderzoeken worden hoe het endosperm controles zaadkieming slapende zaden en in reactie op licht signalen. De MKBA is in beginsel van toepassing onder elke situatie waar het endosperm wordt vermoed dat de embryonale groei beïnvloeden.

Een zaadhuid Bedding Assay om Genetisch Explore<em&gt; In Vitro</em&gt; Hoe de Endosperm Controls zaadontkieming in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Het doel is om te illustreren dat het model-legume Medicago truncatula gemakkelijk kan worden gebruikt om de regulatie van vroege plantenembryogenese te onderzoeken als aanvulling op het niet-legume Arabidopsis-model. De morfologie van peulen is gekoppeld aan stadia van zygotische embryogenese en er wordt ook een protocol gegeven om embryo's te verzamelen met behulp van weefselkweek.

Protocollen voor het verkrijgen Zygotic en somatische embryo&#39;s voor het bestuderen van de verordening van de vroege embryo ontwikkeling in de Model Legume<em&gt; Medicago truncatula</em

Dit protocol beschrijft een methode voor de waarneming van de embryogenese Arabidopsis via zaadknop goedkeuring, gevolgd door de inspectie van embryo patroonformatie onder een microscoop.

Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

We demonstreren een methode om de succesvolle of mislukte bevruchting te bepalen op basis van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting met behulp van een epifluorescentie Microscoop.

Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting

Een high-throughput protocol voor de oppervlaktesterilisatie van Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) zaden wordt geleverd, waarbij de vloeistofbehandelingsstappen worden geoptimaliseerd met een eenvoudig zuigapparaat dat is gebouwd met een vacuümpomp. Honderden zaadmonsters kunnen op één dag aan de oppervlakte worden gesteriliseerd.

High-throughput, robuuste en zeer tijdflexibele methode voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden

Hier beschrijven we een verbetering van de semi-in vitro (SIV) methode voor het observeren van pollenbuisgeleiding en -ontvangst in Arabidopsis thaliana, die de ontvankelijkheid van eitjes verhoogt. De high-throughput SIV cum septum-methode kan worden gekoppeld aan gametofytmarkerlijnen en genetisch gecodeerde biosensoren om het dynamische proces van bevruchting te volgen.

Live beeldvorming van Arabidopsis pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting met behulp van de semi-in vitro cum septum methode

Een verbeterde methode om pollenhydratatieprofielen in Arabidopsis thaliana te meten wordt hier beschreven. De nieuwe methode biedt een hogere resolutie, is niet-invasief en is zeer reproduceerbaar. Het protocol vertegenwoordigt een nieuw hulpmiddel voor een fijnere ontleding van de processen die de vroege stadia van bestuiving reguleren.

Een hoge resolutie, enkelkorrelig, in vivo pollenhydratatiebioassay voor Arabidopsis thaliana

Dit protocol beschrijft de bereiding van intacte monsters van de endospermcellaag in Arabidopsis thaliana zaden. De methode vereist alleen gewone laboratoriumapparatuur, zoals een injectienaald en een precisietang, en maakt fluorescerende levende celbeeldvorming met hoge resolutie mogelijk van endospermcellen in zowel ontwikkelende als rijpe zaden.

Preparaat van intact weefsel voor microscopische analyse van de endospermcellaag in zich ontwikkelende en rijpe Arabidopsis-zaden

Leer een efficiënte methode voor het isoleren van vroege embryo's uit Arabidopsis thaliana zaden. Deze techniek maakt transcriptoom- en epigenoomanalyse mogelijk voor plantenontwikkelingsonderzoek.

Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo's van

Meer video's verkennen