Isolatie van de Native Soil Micro-organismen met Potentieel voor Breaking Down Biologisch afbreekbaar plastic mulch films gebruikt in de landbouw

Het algemene doel van het volgende experiment is om bodembewonende schimmels en bacteriën te isoleren die biologisch afbreekbare mulchfolies koloniseren en afbreken. Dit wordt bereikt door biologisch afbreekbare mulchfolies in gaaszakken lang genoeg in de bodem te incuberen om aanzienlijke kolonisatie door inheemse bodemmicroben mogelijk te maken. Na incubatie worden de mulches geëxtraheerd en in verdunning geplateerd, wat opbrengt enkele geïsoleerde kolonies van elk cultiveerbaar type van intiem geassocieerde microbe.

Vervolgens worden geïsoleerde microben op een verse oppervlakte gepatcht, dis geïnfecteerde, biologisch afbreekbare mulches, evenals op agarplaten met of zonder koolstofbron. Om de groei te vergelijken, worden de resultaten vervolgens bevestigd in vloeibaar medium. De resultaten tonen kolonisatie en/of afbraak door bepaalde isolaten op basis van rasterelektronenmicroscopie en kunnen worden geverifieerd door gelpermeatiechromatografie.

Vergeet niet dat het werken met niet-geïdentificeerde schimmel- en bacterie-isolaten gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure, zoals het dragen van handschoenen, het afdichten van kweekbuisjes en schotels, en het werken in een bioveiligheidskast. Na het incuberen van mulchstukken in de bodem en het voorbereiden van media en reagentia volgens het tekstprotocol, snijdt u nieuwe mulchstukken in vierkantjes van 4,25 centimeter om de mulchstukken te decontamineren. Steriiliseer ze als ze niet zullen veranderen of afbreken voor niet-steriileerbare mulchstukken zoals die gemaakt van kunststoffen.

Na het voorbereiden van een bioveiligheidskast volgens het tekstprotocol, plaatst u de mulchstukken in de gedecontamineerde kap in rijen en incubeert u de mulchstukken twee uur onder UV-licht, met behulp van een schone gesteriliseerde pincet en begint u met de voorste rij en werkt u naar de achterkant om te voorkomen dat u handen en armen over de nieuw gedecontamineerde oppervlakken plaatst. Draai de mulchstukken om en plaats de ontsmette kant op een schone plaats, blootgesteld aan UV-licht, maar niet eerder in contact met mulch. Na twee uur UV-behandeling aan elke kant, werkt u opnieuw van voor naar achter.

Gebruik steriele pincetten om de mulchstukken uit de bioveiligheidskast te verwijderen en plaats ze in steriele droge afgesloten containers zoals met folie bedekte bekers. Bewaar ze op kamertemperatuur in het donker onder een steriele overdrachtskast. Gebruik asseptiektechniek om de UV-ontsmette mulchstukken op het oppervlak van agarplaten te leggen, waarbij u eerst een hoek neerzet en voorzichtig laat rollen zodat de rest van het vierkant in contact komt met de agar.

Voor niet-waterdoorlatende films, plaatst u vier druppels van 10 microliter gesmolten semi-solide, minimaal medium bovenop de hoeken van de mulchstukken om een water- en voedselbron te bieden voor initiële kolonisatie van hydrofobe kunststoffen. Raak het oppervlak van de mulchstukken niet aan. Met de pipettentip zullen de druppels verharden tot kralen.

Incubeer de afgedekte platen rechtop een nacht bij kamertemperatuur om te stollen. Bewaar vervolgens de platen agar-zijde omhoog in het donker bij vier graden Celsius. Alle materialen die nodig zijn voor de bioassays zijn nu voorbereid en u bent klaar om te beginnen met het isoleren van potentiële mulch afbrekende schimmels van mulchstukken die in de bodem zijn begraven.

Graaf gaaszakken uit de bodem en verwijder mulchstukken uit de gaaszakken. Gebruik een steriele spatel en pincetten om voorzichtig het overtollige grond van de mulches te verwijderen zonder de grond die aan het oppervlak kleeft te verstoren. Snijd BDM-folie in stukken van één centimeter vierkant totdat 0,5 gram materiaal is teruggewonnen.

Voor elke replicaatmonsteroverdracht, brengt u 0,5 gram mulchstukken en aangehechte grond over in 25 milliliter. Kweekbuisjes met 9,5 milliliter PBS. Voeg 0,5 gram grond toe aan de grond-alleen controlebuisjes of aan monsters waar de mulch volledig is afgebroken om eventuele biofilms te breken en cellen los te maken van mulchstukken. Vortex de buisjes gedurende 30 seconden op hoge snelheid, soniceer ze vervolgens in een waterbad gedurende 10 minuten en vortex ze opnieuw.

Dit zou een homogene suspensie moeten opleveren van microbiële cellen die geassocieerd waren met de mulchstukken. Voor een seriële verdunning van monsters. Bereid een kweekbuis voor met 4,5 milliliter steriele PBS en vul drie putjes van een diepe putjesplaat met 450 microliter PBS per monster van de oorspronkelijke suspensiebuisjes.

Breng 0,5 milliliter over in de 4,5 milliliter steriele PBS om een 5,0 keer 10 tot de negatieve derde verdunning te verkrijgen na vortexen op hoge snelheid gedurende 30 seconden, voeg 50 microliter toe aan 450 microliter PBS in het 96-putjes plaat mix door voorzichtig 10 keer op en neer te pipetten. Herhaal tot verdunning van maximaal 5,0 keer 10 tot de negatieve zes compleet zijn. Gebruik vlam gesteriliseerde gebogen glazen staven om 100 microliter van elk van de verdunningsmonsters gelijkmatig te verspreiden over het agaroppervlak van PDA-platen die chlooramfenicol bevatten om bacteriegroei te remmen. Bewaar platen rechtop gedurende 30 minuten om de vloeistof te laten intrekken.

Versluit vervolgens de platen met paraform om te voorkomen dat sporen ontsnappen uit niet-geïdentificeerde isolaten. Incubeer omgekeerde platen bij 20 graden Celsius in het donker gedurende vijf dagen om zowel snel als langzaam groeiende schimmels toe te laten om kolonies te vormen in een bioveiligheidskast. Onderzoek de verdunningsplaten op enkele geïsoleerde kolonies met behulp van een enkele steriele tandenstoker.

Raak voorzichtig een kolonie aan en raak vervolgens het agar van schimmelminimaal medium, schimmelminimaal medium plus plastic en glucose minimaal medium platen in die volgorde om agarparels bovenop plastic films te inoculeren. Wrijf de tandenstoker voorzichtig over het oppervlak van de agar dot en veeg het vervolgens over he