Name: Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Leer de isolatie van muiseilandjes van Langerhans voor intracellulaire cAMP-bepaling met behulp van een enzymimmunoassay. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van β-celfunctie in diabetesonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Renee L. Pasker en Harpreet K. Brar bedanken voor deskundige technische bijstand aan de in dit werk beschreven protocollen. Verder willen we de begeleiding van Christopher B. Newgard erkennen aan de Duke University en Alan D. Attie aan de Universiteit van Wisconsin-Madison, samen met de steun van hun laboratorium leden, wat ons toeliet de tijd en ondersteuning nodig om het optimaliseren van de beschreven protocollen. In het bijzonder danken wij Hans Hohmeier, Danhong Lu, en Helena Winfield in de Newgard Laboratorium en Mary Rabaglia in de Attie Laboratorium voor productieve discussies en advies. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie ​​DK080845 en Juvenile Diabetes 594 Research Foundation subsidie ​​17-2011-608 (MEK)

<ol><li>Cryer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoglycaemia%3A+the+limiting+factor+in+the+glycaemic+management+of+Type+I+and+Type+II+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes.</a> Diabetologia. 45, 937-948 (2002).</li>
<li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition%2C+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1%3A+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li>
<li>Muoio, D. M., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+disease%3A+molecular+and+metabolic+mechanisms+of+insulin+resistance+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).</li>
<li>Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+islet+structure+and+cellular+interactions+in+the+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion.</a> Islets. 3, 41-47 (2011).</li>
<li>Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+development+is+correlated+with+insulin+content+in+the+pancreatic+B+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell.</a> Science. 209, 1026-1028 (1980).</li>
<li>Hohmeier, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+INS-1-derived+cell+lines+with+robust+ATP-sensitive+K%2B+channel-dependent+and+-independent+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion.</a> Diabetes. 49, 424-430 (2000).</li>
<li>Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from pancreatic islets.</a> Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).</li>
<li>Field, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+insulin+by+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Extraction of insulin by liver.</a> Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).</li>
<li>Emmanouel, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+metabolism+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Glucagon metabolism in the rat.</a> J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).</li>
<li>Kimple, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+GalphaZ+protein+protects+against+diet-induced+glucose+intolerance+via+expansion+of+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass.</a> J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).</li>
<li>Rabaglia, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Ketoisocaproate-induced+hypersecretion+of+insulin+by+islets+from+diabetes-susceptible+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).</li>
<li>Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+exposure+of+mouse+pancreatic+islets+to+oleate+or+palmitate+results+in+reduced+glucose+induced+somatostatin+and+oversecretion+of+glucagon%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon.</a> Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).</li>
<li>Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Replication+and+Beta+Cell+Function+in+Adenovirally-transduced+Isolated+Rodent+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine pancreatic islet isolation.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+pancreatic+islets+into+the+kidney+capsule+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Kimple, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+G%28z%29+in+pancreatic+islet+beta-cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology.</a> J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).</li>
<li>Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+the+prevalence+of+diabetes+for+2010+and+2030%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Res+Clin+Pract%22%5BJournal%5D)">Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030.</a> Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).</li>
<li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).</li>
<li>Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57%2FBL6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).</li>
<li>Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).</li>
<li>Davis, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxM1+is+up-regulated+by+obesity+and+stimulates+beta-cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation.</a> Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).</li>
<li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hypoxia+on+insulin+secretion+by+isolated+rat+and+canine+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans.</a> Diabetes. 42, 12-21 (1993).</li>
<li>Linetsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+islet+isolation+using+a+new+enzyme+blend%2C+liberase%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase.</a> Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).</li>
<li>Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Islet cell transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).</li>
<li>Brandhorst, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+comparison+of+Liberase+HI+and+collagenase+NB1+utilized+for+human+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation.</a> Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Met de prevalentie van diabetes naar verwachting invloed hebben op 7,7% van de wereldbevolking, de eis van nieuwe onderzoekstechnieken is het noodzakelijk om zowel te begrijpen en te behandelen diabetes 18. De huidige eilandje isolatie is een gevestigde protocol dat wordt gebruikt voor in vitro experimenten en is al eerder gepresenteerd met lichte wijzigingen 11,14,16. Hoewel insuline secretie is een veel voorkomende downstream applicatie voor geïsoleerde eilandjes, met de nadruk op upstre...

De strikte handhaving van euglycemia is noodzakelijk om morbiditeiten zoals neuropathie, nefropathie en retinopathie, die alle kenmerken van de pathologie van ongecontroleerde type 1 en 2 diabetes 1 worden voorkomen. Verminderde β-celfunctie en massa zowel type 1 en 2 diabetes verstoren bloedglucoseconcentraties 2. Dat immuun-gemedieerde type 1 diabetes resultaten van een verwoestende verlies van insulineproducerende β-cellen, verminderde β-cel insulinesecretie en perifere insuline signalering van Type 2 diabetes samen bevorderen hyperglycemie, dyslipidemie en verhoogde hepatische glucoseproductie, wat uiteindelijk resulteert in zowel verlies van β-celmassa en insuline secretoire capaciteit van individuele β-cellen 3. Inzicht in de onderliggende β-cel mechanismen in de progressie van type 1 en 2 diabetes hopelijk leiden tot nieuwe therapieën ter voorkoming en behandeling van deze ziekten. In vitro tissue cultuur modellen, zoals de INS-1 en MIN6 β-geïmmortaliseerde cellijnen, kunnen nuttige hulpmiddelen voor het begrijpen van specifieke β-celfuncties. De wisselwerking tussen de verschillende celtypes in de eilandjes kunnen zelf regelen β-celfunctie. Bijvoorbeeld, de paracriene invloed van glucagon (vrijgemaakt uit α-cellen) en somatostatine (vrijgemaakt uit δ-cellen) in stijgende en dalende insuline secretie, respectievelijk, toont het belang van cel-cel in de nabijheid endocriene respons 4. Bovendien gap junctions tussen β-cellen versterken de afgifte van insuline 5. En hoewel vooruitgang geboekt bij het ​​genereren insulinoma lijnen die beter gerepliceerd de fysiologische respons van geïsoleerde eilandjes tot glucose (bijvoorbeeld de INS-1-afgeleide 832/13 en 832/3 cellijnen), de glucose response verschilt nog van normale rat eilandjes 6,7. Bovendien is de respons van deze klonale cellijnen insulinomaglucagon-achtige peptide-1 (GLP-1) agonisten drastisch verschillen van elkaar, en van normale eilandjes 6. Daarom kan geïmmortaliseerde cellijnen vertegenwoordigen de beste model voor het testen van middelen die invloed op cAMP-productie. In tegenstelling tot de-insulinoom afgeleide cellijnen, het bestuderen van β-cel functie uitsluitend in gehele dierlijke modellen heeft zijn eigen set van complicaties. Een van de grootste uitdagingen bij het werken met endocriene weefsel meet de precieze concentratie hormoon vrijgegeven. Specifiek, de lever speelt een belangrijke rol metaboliseren insuline en de alvleesklier bloedstroom gaat rechtstreeks naar de lever. Zo kan een plasma insuline meting niet nauwkeurig beeld van de hoeveelheden insuline wordt uitgescheiden door de alvleesklier zelf of de impact van verschillende behandelingen op de snelheid van de insuline secretie 8. Bovendien kan niermetabolisme van glucagon de betrouwbaarheid van glucagon productie beperken van eilandje α-cellen 9. Daarom is het isoleren van primaire muis eilandjes voor in vitro experimenten geeft een duidelijker inzicht in hoe het eilandje reageert op specifieke stimuli om metingen in vivo te vullen. Het huidige protocol voor de isolatie van de muis eilandjes is een gevestigde protocol dat wordt gebruikt door een aantal groepen (met lichte wijzigingen die kunnen helpen om succes te vergroten) 10,11. Bovendien is de bepaling van cAMP-productie maakt een directe aflezing van de incretine responsiviteit van de β-cellen. Samen met cAMP meet, eiwitgehalte en insuline secretie kan worden gekwantificeerd uit hetzelfde cAMP monstervoorbereiding, om te bepalen of een defect in β-celfunctie ligt proximaal of distaal van cAMP 10. Het uiteindelijke cAMP gehalte en insuline secretie toepassing in dit protocol kan een zeer krachtig instrument voor het begrijpen van de invloed van de farmaceutische en voedingsbestanddelen, onder andere zijns op cAMP en insuline secretie. Naast het stimuleren van glucose alleen, kunnen andere verbindingen worden gebruikt om veranderingen in cAMP en insuline secretie 10,11 meten. Tot slot, hoewel insuline is de primaire hormoon we assay van geïsoleerde eilandjes, andere hormonen, zoals glucagon en somatostatine, maar ook cytokinen, eicosanoïden, en cyclisch adenosine monofosfaat, kan ook worden gemeten, hetzij door een tijdelijke stimulatie test of kwantificatie van hun niveau in kweekmedium 12. Tot slot, hoewel buiten de reikwijdte van dit manuscript, eilandje isolatie met de beschreven collagenase isolatiemethode maakt eilandje conservering zodat vele verdere toepassingen kan worden uitgeoefend, zoals eilandjeoverplanting, RNA isolatie kwantitatieve real time PCR en microarray analyses, eiwit isolatie voor Western blotting, eilandje inbedding en immunofluorescentie imaging en [3H]-thymidine opname als een maat eilandje cellen replikation, waarvan sommige zijn beschreven in eerdere artikelen Jupiter 13-16. Over het algemeen, als gevolg van de in het protocol beschreven eilandje isolatie procedure kan een onderzoeker met belangrijke en nuttige informatie voor het ontwikkelen van therapieën en bevorderen van drug discovery gericht op verbetering van β-cel functie.

<table><tbody><tr><td>Collagenase van Clostridium histolyticum geschikt voor het isoleren van actieve eilandjes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution 10X</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (poeder)</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Albumine uit runderserum (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7888</td><td></td></tr><tr><td>3/0 Zijde Sutuurdraad</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>0.8 mm Pincet&nbsp;&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen Schaartje</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml;bingen Spring Schaartje - Recht/Scherp/8.5 cm/5 mm Snijrand</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie Schaartje</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>5 ml BD Luer-Lok Spuit</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1 ml BD spuit</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30 G BD Naald 1/2" Lengte</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>27 G BD Naald 1/2" Lengte</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Slijpsteen</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2-tribromoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Monokaliumfosfaat (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat (NaCHO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#183;2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&#183;7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30088.03HI</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5879-100MG</td><td></td></tr></tbody></table>

een methode voor muis eilandjes van langerhans isolatie en intracellulaire camp bepaling

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Ongecontroleerde glycemie is een kenmerk van diabetes mellitus en bevordert morbiditeiten zoals neuropathie, nefropathie en retinopathie. Met de toenemende prevalentie van diabetes, zowel immuun-gemedieerde type 1 en obesitas verbonden type 2, studies gericht op het afbakenen van diabetes pathofysiologie en therapeutische mechanismen van essentieel belang zijn. De β-cellen van de pancreatische eilandjes van Langerhans zijn verantwoordelijk voor passende afscheiden insuline in reactie op verhoogde bloedglucoseconcentraties. Naast glucose en andere voedingsstoffen, worden de β-cellen gestimuleerd door specifieke hormonen, genaamd incretines, die worden uitgescheiden uit de darm in reactie op een maaltijd en werken op β-cel receptoren die de productie van intracellulair cyclisch adenosine monofosfaat verhogen ( cAMP). Verminderde β-celfunctie, massa en incretine responsiviteit zijn goed zou bijdragen aan de pathofysiologie van type 2 diabetes, en worden ook steeds gekoppeld with type 1 diabetes. De huidige muis eilandje isolatie en cAMP vastberadenheid protocol kan een hulpmiddel om af te bakenen mechanismen ter bevordering van progressie van de ziekte en therapeutische interventies, met name degenen die worden gemedieerd door de incretin receptoren of verwante receptoren die werken door middel van modulatie van intracellulaire cAMP productie. Terwijl slechts cAMP metingen worden beschreven, beschreven eilandje isolatieprotocol creëert een schone preparaat die ook zorgt voor veel andere stroomafwaartse toepassingen, waaronder glucose gestimuleerde insuline secretie, [3H]-thymidine, eiwitgehalte en mRNA expressie.

Om een ​​hoge eilandje opbrengst in isolatie te garanderen, moet chirurgische technieken beschreven in het protocol nauwlettend worden gevolgd. Hoewel de hier gepresenteerde technieken worden aangepast aan elk laboratorium, zijn er enkele belangrijke stappen die leiden tot een succesvolle isolatie. Om de galbuis bereikbaar te maken, wordt aanbevolen dat de organen worden verplaatst naar de rechterkant van de muis (Figuur 1). Bovendien zal dit mogelijk de alvleesklier om opblazen met een kleinere hoeveel...

Het testen in vitro β-celfunctie met geïsoleerde eilandjes van Langerhans muis is een belangrijke component in de studie van diabetes pathofysiologie en therapie. Terwijl veel downstream applicaties beschikbaar zijn, dit protocol beschrijft specifiek de meting van intracellulaire cyclische adenosine monofosfaat (cAMP) als een essentiële parameter bepalen van β-cel functie.

Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van gezonde eilandjes van Langerhans om verschillen in de productie van cyclisch AMP te meten als reactie op diverse experimentele behandelingen. Dit wordt bereikt door de pancreas in een tweede stap eerst op te blazen en vervolgens te verwijderen. De gezonde eilandjes worden geïsoleerd via een reeks centrifugaties en wasstappen.Vervolgens worden de levensvatbare eilandjes overgebracht naar vers kweekmedium voor eilandjes en gedurende de nacht geïncubeerd. In de laatste stap worden de eilandjes blootgesteld aan de gewenste experimentele behandelingen en wordt er een cyclic AMP-assay uitgevoerd. Ten slotte wordt een enzyme-immunoassay gebruikt om veranderingen in de productie van cyclic AMP te meten als reactie op de verschillende behandelingen die op de eilandjes zijn toegepast.Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn aan deze methode moeite hebben, omdat het veel oefening kost om een volledige inflatie van de pancreas te bereiken. Vul eerst een spuit en canule voor met vijf milliliter collagenase-oplossing. Bevestig een stompe 30 gauge naald aan de canule en plaats de spuit met de canule op ijs.Nadat de dunne darm naar de

a-method-for-mouse-pancreatic-islet-isolation-intracellular-camp

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het volgende protocol schetst het proces van het pancreas dissectie voor virtuele slice beeldvorming, en de daaropvolgende kwantificering van alle GFP-gelabelde beta-cellen in de gehele alvleesklier.

In situ kwantificering van beta-celmassa in Muizen

Een gedetailleerde beschrijving van muis eilandje isolatie wordt beschreven door de techniek van in situ pancreas ductaal infusen en perfusie van een combinatie van gezuiverd collagenase en neutrale protease.

Muis Islet van Langerhans Isolatie met behulp van een combinatie van Gezuiverde Collagenase en neutraal protease

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. This protocol explains a method for isolating pancreatic islets by first perfusing collagenase via Ampulla of Vater to digest the exocrine pancreatic tissue and a simplified density gradient centrifugation to purify the islets from mice.

Pancreatic Islets Isolation through Collagenase Perfusion: An Enzymatic Method to Isolate Pancreatic Islet Cells

We presenteren hier een protocol voor de isolatie van eilandjes uit het muismodel van type 2 diabetes, Leprdb en details van een live-cel assay voor het meten van insulinesecretie uit intacte eilandjes dat gebruikmaakt van 2 foton microscopie.

LepR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes

Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van de alvleesklier eilandjecellen muis voor het screenen van de ROS inducties door de xenobiotica teneinde de potentiële diabetogenic xenobiotische chemische stoffen.

Een lymfkliertest alvleesklier Islet cel-gebaseerde Screening voor Diabetogenic milieu chemische stoffen

Beschrijven we een methode voor de isolatie van de endocriene cellen uit embryonale, Neonatale en postnatale pancreases gevolgd door eencellige RNA sequencing. Met deze methode kunt analyses van de ontwikkeling van de alvleesklier endocriene bloedlijn, cel heterogeniteit en transcriptomic dynamiek.

Eencellige Transcriptomic Analyses van muis alvleesklier endocriene cellen

Hier presenteren we een protocol voorbeeld vorming en kwantificeren van de calcium dynamica in heterogene celpopulaties, zoals de eiland cellen van de alvleesklier. Fluorescerende verslaggevers worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het eilandje, die vervolgens wordt geïmmobiliseerd en imaged, en per-cel analyse van de dynamiek van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgevoerd.

Imaging calcium dynamica in subpopulaties van muizen pancreatic eilandje cellen

Dit protocol beschrijft de isolatie van endotheelcellen van muizen uit de hele alvleesklier.

Isolatie van endotheelcellen van de pancreas van muizen

Deze studie maakt gebruik van multi-kleuring fluorescentie-gebaseerde markers van celdood en apoptose in combinatie met confocale microscopie om cytokine-geïnduceerde apoptose en β-celspecifieke dood in pancreaseilandjes te beoordelen. Het onthult ruimtelijke en temporele veranderingen in celdood en apoptose als reactie op extracellulaire stimuli.

Geïsoleerde behandeling van pancreaseilandjes en meting van apoptose

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de muizenalvleesklier te extraheren, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de pathogenese van Acute Pancreatitis-geïnduceerde Diabetes.

Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

Leer de isolatie van muiseilandjes van Langerhans voor intracellulaire cAMP-bepaling met behulp van een enzymimmunoassay. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van β-celfunctie in diabetesonderzoek.

Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling

Meer video's verkennen