Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van gezonde eilandjes van Langerhans om verschillen in de productie van cyclisch AMP te meten als reactie op diverse experimentele behandelingen. Dit wordt bereikt door de pancreas in een tweede stap eerst op te blazen en vervolgens te verwijderen. De gezonde eilandjes worden geïsoleerd via een reeks centrifugaties en wasstappen.

Vervolgens worden de levensvatbare eilandjes overgebracht naar vers kweekmedium voor eilandjes en gedurende de nacht geïncubeerd. In de laatste stap worden de eilandjes blootgesteld aan de gewenste experimentele behandelingen en wordt er een cyclic AMP-assay uitgevoerd. Ten slotte wordt een enzyme-immunoassay gebruikt om veranderingen in de productie van cyclic AMP te meten als reactie op de verschillende behandelingen die op de eilandjes zijn toegepast.

Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn aan deze methode moeite hebben, omdat het veel oefening kost om een volledige inflatie van de pancreas te bereiken. Vul eerst een spuit en canule voor met vijf milliliter collagenase-oplossing. Bevestig een stompe 30 gauge naald aan de canule en plaats de spuit met de canule op ijs.

Nadat de dunne darm naar de rechterzijde van de muis is verschoven, lokaliseer je de sphincter van Odd, die zich aan het uiteinde van de gemeenschappelijke galgang bevindt en zich uitwaaiert over de dunne darm, waarbij een witte driehoek wordt gevormd. Zodra de sphincter is gelokaliseerd, neem je een nummer vijf Dumont-pincet en schuif je de punt onder de gemeenschappelijke galgang, zo dicht mogelijk bij de dunne darm. Wees voorzichtig om de gang niet te doorboren.

Nadat er door de dunne darm en het bindweefsel is geprikt, gebruikt u de punt van de Dumont-pincet om de hechtdraad vast te pakken en eronderdoor te trekken onder de gemeenschappelijke galgang. Ligeeer de gemeenschappelijke galgang zo dicht mogelijk bij de sphincter van Oddi, waarbij u ervoor zorgt dat de knoop strak staat om lekkage te voorkomen. Pak vervolgens beide uiteinden van de hechtdraad vast en trek deze richting de staart om spanning op de gemeenschappelijke galgang te zetten.

Maak vervolgens met een vrije hand met een microschaar een kleine incisie in de gemeenschappelijke galgang, net boven de laatste vertakking naar de lever, terwijl de twee uiteinden van het touwtje worden vastgehouden om de gemeenschappelijke galgang strak te trekken. Haal de spuit en canule uit het ijsbad. Zet de spuit neer en voeg de voorbereide, stompe 30 gauge naald in de incisie in.

Gemeenschappelijke galgang. Wees voorzichtig om niet door de wand van de gang heen te prikken. Het verkrijgen van een volledige opblazing van de pancreas is het meest uitdagende deel.

We gebruiken een naald die een goede afdichting biedt. Als de eerste naald geen goede afdichting geeft, gebruik dan een grotere, zoals een naald van 27 gauge. Druk nu de zuiger van de spuit langzaam in, waarbij de druk pulserend wordt afgevoerd totdat het eerste deel van de pancreas opblaast.

Oefen hierna een zachte, constante druk uit totdat de pancreas niet langer opblaast. Bij een succesvolle inflatie is het exocriene weefsel gelijkmatig verdeeld en is het deel van de pancreas bovenop de maag opgeblazen. Om de pancreas te verwijderen, gebruikt u in één hand een pincet om de dunne darm vast te pakken bij de sphincter van Oddi.

Scheid met de andere hand een deel van de pancreas van de dunne darm door de gesloten punt van een gebogen schaar in te brengen. Beweeg de punt langs de dunne darm naar het roze bindweefsel. Pak vervolgens de dunne darm vast nabij de aanhechting aan de maag en snijd de pancreas los van de rest van de dunne darm.

Pak zoveel mogelijk van de pancreas vast en til deze voorzichtig op. Knip met de gebogen schaar de resterende verbindingen tussen de pancreas en de borstholte door.

Om de alvleesklier volledig te verwijderen, bewaart u elke verwijderde alvleesklier in ongeveer 2,5 milliliter collagenase-oplossing. Gebruik individuele 50 milliliter conische buizen op ijs om de alvleesklieren te wassen. Draag vervolgens elke alvleesklier over naar een nieuwe 50 milliliter conische buis met 25 milliliter collagenase.

Plaats vervolgens de pancreas in 50 milliliter conische buizen. Zet deze rechtop in een schudwaterbad van 37 °C, dat in staat is om met 220 tot 250 RPM te oscilleren, terwijl de schudder is uitgeschakeld. Gas vervolgens elke 50 milliliter conische buis gedurende vijf minuten met 95% zuurstof en 5% kooldioxide.

Sluit elke buis stevig af met een pasteurpipet en plaats deze zijlings in het schuddende waterbad onder het wateroppervlak. Begin vanaf minuut zes met het schudden van de buisjes bij 220 tot 250 RPM gedurende 20 seconden om de minuut, voor een totale duur van maximaal 16 minuten. Centrifugeer de buizen na het schudden bij 400 tot 500 Gs bij kamertemperatuur, waarbij de centrifuge onmiddellijk wordt uitgeschakeld zodra de maximale snelheid is bereikt.

Zuig vervolgens, zonder het pellet te verstoren, ongeveer 22,5 milliliters van de collagenase-oplossing uit elke buis weg met een vacuümaspirator. Resuspendeer de pellets daarna in 12,5 milliliter HBSS en vortex de buizen voorzichtig om de pellets op te lossen. Na het wassen en vortexen van de cellen met nog meer HBSS, giet elke cel-suspensie door een mesh van 1000 micron in nieuwe individuele conische buizen van 50 milliliter.

Centrifuge vervolgens de cel-suspensies opnieuw en gebruik een vacuümtrap om voorzichtig al het HBSS af te zuigen zonder de pellet te verstoren. Zodra al het HBSS is verwijderd, worden aan elke buis 4,8 milliliters van de 25%F-call-oplossing toegevoegd. Na het vortexen om de pellet op te lossen, worden 2,4 milliliters van de 23%20,5% en 11%fial-oplossing voorzichtig langs de wand van de 50 milliliter conische buis gedoseerd terwijl de buis wordt gedraaid.

Om een gelijkmatige gelaagdheid na het centrifugeren van de FI-oproepoplossing te garanderen, schenkt u alle FI-oproep in een nieuwe conische buis van 50 milliliter, waarbij u er zorg voor draagt dat het pellet van exocrien weefsel achterblijft. Voeg ijskoud HBSS toe aan de nieuwe buis tot aan de markering van 50 milliliter. Sluit de buis vervolgens af en keer deze vier tot zes keer om.

Om de FI-oproep en HBSS te mengen. Gebruik de vacuümtrap om voorzichtig het grootste deel van het HBSS-flesmengsel af te zuigen zonder de losse pellet te verstoren. Verplaats de pellet vervolgens naar een nieuwe buis.

Gebruik een pasteurpipet om de oogjes over te brengen naar een Petrischaal met oogjeskweekmedium, waarbij zorgvuldig wordt vermeden om ASIN-weefselresten over te brengen. Plaats de Petrischaal op een dissectiemicroscoop met achtergrondverlichting.

Gezonde oogjes zijn bolvormig en hebben een goudbruin tot donkerbruin centrum. Alle oogjes die verbonden zijn met ASIN of weefsel, welke er dof en grijs uitzien, mogen niet worden gebruikt en moeten worden weggegooid. Bovendien moeten grotere oogjes die na een incubatie van één nacht een donker necrotisch centrum ontwikkelen, worden weggegooid omdat ze niet correct functioneren.

Als de eyelet-preparatie veel debris bevat, worden de eyelets tweemaal handmatig overgebracht naar vers medium; voeg DNA toe aan de digestiebuffer om klontering van de eyelets te beperken. Begin deze stap door de eyelets naar het midden van de Petrischaal te wervelen. Gebruik een P 20-pipet om de eyelets over te brengen naar een nieuwe polystyreen Petrischaal van 15 millimeter bij 60 millimeter die vijf milliliter van de pre-incubatieoplossing bevat, om het glucosehoudende cultuurmedium van de eyelets af te wassen.

Gebruik vervolgens de P 20 pipette om ten minste 13 eyelets over te brengen naar individuele microcentrifugebuisjes die één milliliter vers gegasde Krebs-Ringer bicarbonaatbuffer bevatten, waarbij de consistentie van de eyelet-grootte tussen de buisjes behouden blijft. Na incubatie van de monsters bij 37 °C en 5%CO2 gedurende 45 minuten, worden de centrifugebuisjes afgedicht, kortstondig gevortext en gecentrifugeerd in een tafelcentrifuge bij kamertemperatuur tot 7.000 à 7.500 Gs. Indien insuline of een andere metaboliet een gewenste downstream-applicatie is, gebruik dan een P 1000 pipette om een aliquot van het medium in een microcentrifugebuisje te verzamelen. Als het stimulatiemedium niet wordt verzameld, kan dit worden weggegooid.

Gebruik een P 1000 pipette om het grootste deel van de Krebs uit elke microcentrifugeebuis te verwijderen, waarbij ongeveer 10 tot 15 µL Krebs op het oogpellet achterblijft. Gebruik vervolgens een P 20 pipette om het gedeelte dat het dichtst bij het pellet ligt te verwijderen. Wanneer er uiteindelijk minder dan 10 tot 15 µL Krebs op het oog is achtergebleven, worden de oogpellets snel ingevroren in vloeibare stikstof.

Bewaar vervolgens de snel ingevroren pellets bij -80 °C totdat het cyclisch AMP wordt gemeten. Meestal correleert de impact van een middel op de productie van cyclisch AMP direct met de impact op de insulinesecretie. In dit experiment werden geïsoleerde eilandjes van wildtype- of gen-knockout-muizen gestimuleerd met 11,1 millimol glucose en intracellulair cyclisch.

De cAMP-productie werd gemeten en genormaliseerd naar het totale cellulaire eiwit. Uitgescheiden insuline werd gemeten met een standaard insuline-ELISA en eveneens genormaliseerd naar het totale cellulaire eiwit. Zoals verwacht correleerde de verandering in de cyclische AMP-productie direct met de toename van de glucosegestimuleerde insulinesecretie.

Na het bekijken van deze video moet u in staat zijn om oogjes van gezonde muizen te isoleren, te kweken en de spiegels van cyclisch a en p te meten.