Introductie tot de Spectrofotometer

De spectrophotometer is een alomgebruikt instrument in biologisch, chemisch, klinisch en milieuonderzoek.

Spectrofotometrie is de kwantitatieve meting van de mate waarin een chemische stof licht absorbeert door met behulp van een spectrophotometer een lichtstraal door het monster te sturen.

Door de intensiteit van het gedetecteerde licht te meten, kan deze methode worden gebruikt om de concentratie van de opgeloste stof in het monster te bepalen.

De lichtbundel die naar het monster wordt uitgestraald, bestaat uit een stroom fotonen.

Wanneer fotonen moleculen in het monster tegenkomen, kunnen deze moleculen er een aantal absorberen, waardoor het aantal fotonen in de lichtbundel afneemt en de intensiteit van het gedetecteerde signaal wordt verlaagd.

Transmissie is het fractie deel van het licht dat door het monster gaat en wordt gedefinieerd als de intensiteit van het licht dat door het monster gaat gedeeld door de intensiteit van het invallende licht. Absorbantie is de inverse logaritme van de transmissie en is de grootheid die uw spectrofotometer zal meten.

Op basis van de absorbantie kan de concentratie van de monsteroplossing worden bepaald met behulp van de wet van Beer-Lambert, die stelt dat er een lineair verband bestaat tussen de absorbantie en de concentratie van een monster. Volgens de wet van Beer-Lambert is de absorbantie het product van de extinctiecoëfficiënt, een maat voor hoe sterk een opgeloste stof licht absorbeert bij een bepaalde golflengte, de afstand die het licht door het monster aflegt, ofwel de weglengte, en de concentratie van de opgeloste stof. Vaak is het doel van absorbantiemetingen het bepalen van de concentratie van een monster.

Elke spectrofotometer bevat een lichtbron, een collimator, wat een lens of focusserend apparaat is dat een intense rechte lichtstraal uitzendt, een monochromator om de lichtstraal te scheiden in zijn componentgolflengten en een golflengteselectieapparaat, of spleet, voor het selecteren van de gewenste golflengte. De golflengten van het licht die worden gebruikt in de spectrofotometers die in deze video worden besproken, vallen binnen het ultraviolette en het zichtbare bereik. De spectrofotometer bevat daarnaast een vorm van monsterhouder, een foto-elektrische detector, die de hoeveelheid geabsorbeerde fotonen detecteert, en een scherm om de output van de detector weer te geven.

Nieuwere spectrofotometers zijn direct gekoppeld aan een computer, waarmee de experimentele parameters kunnen worden geregeld en de resultaten worden weergegeven.

Neem bij het uitvoeren van spectrofotometrie de juiste voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, afhankelijk van het type biologische of chemische oplossingen waarmee u werkt.

Schakel het apparaat in en laat de lampen en de elektronica opwarmen voordat u het UV-zichtbare spectrum van een monster meet.

Bereid een blanco voor van dezelfde oplossing maar zonder de analyt, met dezelfde pH en een vergelijkbare ionsterkte; dit is een noodzakelijke stap omdat de cuvet en het oplosmiddel licht kunnen verstrooien.

Traditionele monsterhouders van spectrofotometers zijn ontworpen voor plastic en kwarts cuvetten. Pipetteer de blanco-oplossing in de cuvet.

Veeg vingerafdrukken en morsingen van de buitenkant van de cuvet, plaats de cuvet correct in de monsterhouder en sluit de deur van het cuvethoudercompartiment.

Vergeet nooit de deur te sluiten, aangezien de UV-straling die door een open spectrofotometer wordt uitgezonden, de ogen en de huid kan beschadigen.

Stel de gewenste golflengte of het golflengtebereik in dat door het monster moet worden doorgelaten, afhankelijk van de optimale golflengte van het licht die de analyt absorbeert. Nul vervolgens het instrument door een meting van het blanco uit te voeren, waarmee de achtergrond van uw monsterbuffer wordt afgetrokken.

Afhankelijk van het type spectrofotometrisch experiment dat u uitvoert, kan het nodig zijn om voorafgaand aan de monstermeting een standaardcurve op te stellen, waarmee uiteindelijk de concentratie van de analyt in uw monster kan worden bepaald.

Laat het monster de juiste temperatuur bereiken en meng het voorzichtig, zodat er geen luchtbellen ontstaan. Het monster kan vervolgens direct in de cuvet in het instrument worden toegevoegd, waarna de meting kan worden uitgevoerd.

Voer na de absorbentiemeting van uw monster de juiste berekening voor uw experiment uit; bijvoorbeeld de bepaling van de concentratie of de snelheid van de enzymactiviteit.

De spectrofotometer wordt dagelijks gebruikt in veel biologische onderzoekslaboratoria.

Een veelvoorkomende toepassing van de spectrofotometer is de meting van de celdichtheid. De meting van de celdichtheid is nuttig bij het genereren van logaritmische groeicurves voor bacteriën, waaruit het optimale tijdstip voor inductie van recombinant eiwit kan worden bepaald.

De spectrofotometer kan ook worden gebruikt om chemische reactiesnelheden te meten. In dit voorbeeld wordt absorptie gebruikt om een enzymatische reactie te monitoren door de verdwijning van een reactie-intermediair bij 452 nm over een bepaalde tijd. De snelheid van deze enzymatische stap kan worden berekend door de gegevens te fitten aan de juiste vergelijking.

Onlangs heeft de introductie van micro-volume spectrofotometers de noodzaak voor monsterhouders weggenomen. Dergelijke spectrofotometers maken gebruik van oppervlaktespanning om het monster vast te houden.

Micro-volume spectrofotometers zijn optimaal voor het meten van de kwaliteit en concentratie van kostbare monsters met een beperkt volume, zoals biomoleculen, waaronder eiwitten en nucleïnezuren.

De absorptie van een eiwit bij 280 nm hangt af van de hoeveelheid aromatische zijketens in tryptofaan, tyrosine en fenylalanine, evenals het bestaan van cysteïne-cysteïne disulfidebindingen.

De eiwitconcentratie kan worden bepaald op basis van de absorptie bij 280 nm en de extinctiecoëfficiënt, die gebaseerd is op de aminozuursamenstelling.

Zowel DNA als RNA hebben een absorptiemaximum bij 260 nm, waarmee hun concentratie kan worden bepaald. De zuiverheid van het nucleïnezuur kan ook worden beoordeeld aan de hand van de ratio van absorptiewaarden bij specifieke golflengten.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over de spectrofotometer bekeken.

In deze video hebben we enkele basisprincipes herhaald, waaronder concepten van spectrofotometrie en de componenten van de spectrofotometer. We hebben ook stapsgewijs de bediening van de spectrofotometer gedemonstreerd en het gebruik ervan in biologisch onderzoek besproken. Bedankt voor het kijken.