Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties

Het doel van de volgende procedure is om multispectrale analyse van multiplex cellulaire samenstellingen of nabootsingen te gebruiken om de bijdragen van verschillende in het beenmerg aanwezige populaties aan de ontwikkeling van het tumorstroma te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst een transgene GFP-gelabelde ontvanger-muis te transplanteren met RFP-expresserende beenmergstamcellen. In de tweede stap worden de betreffende tumorcellen in dezelfde ontvanger geïnjecteerd en na transplantatie wordt de uitgesneden tumor gesneden, ingebed in paraffine en gelabeld met immunofluorescerende antilichamen.

Vervolgens wordt er, zodra de spectrale bibliotheek compleet is, een spectrale bibliotheek gemaakt van alle golflengten die zijn gebruikt voor het verkrijgen van beelden van de tumorsneden. In de laatste stap worden de preparaten gefotografeerd en wordt er een data-analyse uitgevoerd om de identificatie en associatie van de kleuringspatronen van de gewenste cellulaire markers mogelijk te maken. Uiteindelijk kunnen nieuwe cellulaire entiteiten of fenotypes worden geïdentificeerd op basis van de multiplex labeling van extracellulaire en cellulaire markers, om de samenstelling van complexe weefsels, zoals de tumoromgeving, beter te begrijpen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van standaard immunofluorescentietechnieken is dat de multispectrale analyse het mogelijk maakt om zeven of meer fluoroforen op dezelfde slide te multiplexen, wat een veel preciezere en gedetailleerdere analyse van de cellulaire samenstelling van de tumoromgeving of een regenererend weefsel mogelijk maakt. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de oorsprong en samenstelling van de tumoromgeving, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals de regeneratieve geneeskunde, ontwikkelingsbiologie en immunobiologie. Samen met Dr. Spa demonstreert Chris Booth, een onderzoeksassistent in mijn laboratorium, deze procedure. Vanwege de IU Cook-restricties aan deze instelling zullen we directe handelingen met muizen bespreken, maar niet tonen.

Deze procedure voor beenmerg en onze technieken voor tumor transplantatie kunnen worden teruggevonden in ons eerdere werk, zoals kid en anderen stem cells. 2009. Begin na het isoleren van de beenmergcellen uit de spiegelende achterpoten door de cellen te resuspenderen in PBS tegen een concentratie van 2 miljoen cellen per 100 µL per muis. Gebruik een warmtelamp om de vaten van een bestraalde ontvanger GFP-muis te dilateren en plaats de muis in een fixatieapparaat voor injectie in de staartvene.

Injecteer de celsuspensies systemisch in de staart- of retro-orbitale vene met een naald van 29 gauge, met de schuinte naar boven. Gebruik steriel gaas om na de injectie lichte druk op de staart uit te oefenen. Injecteer op de dag van de injectie één muis met 100 µL PBS als controle voor de implantatie.

Resuspendeer de gewenste tumorcellen in PBS op een concentratie van 1 miljoen cellen per 100 µL. Steriliseer vervolgens de buikholte met 70% ethanol. Gebruik één hand om de muis bij de nekvel en de staart vast te houden en injecteer met de andere hand, terwijl de naald met de schuine zijde naar boven wordt gehouden, de tumorcellen in de intraperitoneale holte van de ontvangende muis.

Euthanaseer de muizen na 15 tot 30 dagen en exciseer de tumor uit de buikholte. Fixeer de tumoren vervolgens gedurende 24 uur in 10% formine. Snijd het gefixeerde weefsel daarna in plakjes van 5 tot 10 micrometer voor de daaropvolgende kleuringsprocedures.

Nadat de weefselsneden in paraffine zijn gefixeerd, worden de monsters één uur gebakken bij 56 °C. Was vervolgens de coupes volgens de onderstaande volgorde. Spoel de coupes na de laatste ethanolwas twee minuten met water. Hierbij wordt het kleurrek 10 keer langzaam in en uit het water ondergedompeld.

Plaats vervolgens de natriumcitraatbuffer in de magnetron om deze te verhitten. Nadat de objectglazen 20 minuten hebben gekookt in de natriumcitraatbuffer, mogen de monsters 30 minuten afkoelen in de buffer. Was ze daarna nog vijf minuten met geïoniseerd water.

Tik vervolgens tegen het objectglas om eventuele grote waterdruppels te verwijderen, maar wees voorzichtig om te voorkomen dat het weefselcoupe uitdroogt. Gebruik een hydrofobe markerpen om de secties rondom de tumorsecties af te bakenen en breng direct daarna blokkeringsbuffer aan op het monster om uitdroging van de weefselcoupe te voorkomen. Incubeer de objectglazen na een uur overnacht bij vier graden in een vochtkamer op een langzaam roterende schudmachine met het gewenste primaire antilichaam.

Was de volgende ochtend de objectglazen twee keer gedurende 10 minuten in PBST met zachte schudbewegingen tijdens het wassen van de coupes. Verdun de secundaire antilichamen in een verhouding van 1:1000 antilichaam tot blokkeringsbuffer. Incubeer de coupes vervolgens gedurende twee uur in de betreffende secundaire antilichamen in een vochtkamer, afgedekt met aluminiumfolie op een langzaam draaiende shaker bij kamertemperatuur.

Was de preparaten twee keer gedurende vijf minuten in PBST onder zacht schudden en bescherm ze tegen licht. Kleur vervolgens alleen het dappy-preparaat en de analysepreparaten gedurende één minuut met DPI, waarbij de preparaten tijdens de incubatie bedekt moeten blijven. Plaats een dekglas over elk monster en verzegel de randen van elk dekglas met nagellak.

Gebruik nu een olie-objectief om een eerste afbeelding van de analysediapreparaat te maken voor de multispectrale beeldvorming, zodat de juiste belichtingstijden voor elk van de spectrale bereiken in de spectrale bibliotheek kunnen worden bepaald. Deze tabel beschrijft bijvoorbeeld voorgestelde protocollen voor de spectrale bibliotheek op basis van het aantal gebruikte fluorescentiekleuren in het experiment. Maak vervolgens een afbeelding van het ongekleurde preparaat als achtergronddia voor de spectrale bibliotheek voor dit experiment.

Maak vervolgens een afbeelding van de ongekleurde slide om het achtergrondbeeld voor de spectrale bibliotheek te verkrijgen. Maak nu van elke controle-slide met een enkele kleuring een afbeelding en sla deze afbeeldingen op onder de naam van het gebruikte secundaire antilichaam voor elke slide. Zodra de bibliotheek compleet is, verzamelt u afbeeldingen van de regio's van belang op de analyseslide om afbeeldingen van het tumorweefsel te analyseren.

Importeer eerst een representatieve selectie van de verkregen nuance-beelden met behulp van de inform-software. Open vervolgens de safe-spectrale bibliotheek zoals aangegeven door het programma. Identificeer daarna de weefselregio's van belang die geanalyseerd moeten worden.

Identificeer individuele cellen op basis van DAPI-kleuring. Het cytoplasma wordt automatisch geïdentificeerd op basis van de vorm van de nucleus. Selecteer nu de gewenste fluorescentie-intensiteitsmeting voor elke fluorescentieparameter en koppel vervolgens de verkregen beelden, zodat de software de gegevens kan verwerken met behulp van het voorgestelde algoritme.

Wanneer de beeldbewerking is voltooid, worden de resulterende bestanden samengevoegd. Vervolgens zijn met deze multispectrale beeldvormingstechniek ter analyse en grafische weergave van tumoren in dit transgene model voor beenmergtransplantatie bij muizen, drie weken na de beenmergtransplantatie, stromale tumorcomponenten van beenmergoorsprong onderscheiden met flowcytometrie. Zes weken na de initiële injectie werden coupes van de niet-gelabelde geïnjecteerde ovariumtumoren geanalyseerd nadat er een spectrale bibliotheek was aangemaakt met enkelkleurige controleslides; beelden van de ovariumtumorcoupe, gekleurd met GFP DPI en twee andere markers, werden geanalyseerd.

Het is mogelijk om meer markers toe te voegen. Hier worden bijvoorbeeld de spectrale bibliotheek en de bijbehorende afbeelding van een tumorsnede met zes markers plus een kernkleuring getoond met behulp van de betreffende software. De weefselgebieden van belang binnen de tumorsnede zijn classificeerbaar, zoals te zien is in de hier getoonde representatieve afbeeldingen.

Bijvoorbeeld: deze afbeelding demonstreert de classificatie van weefselsegmenten, gevolgd door de segmentatie van de cellen. Dit is gebaseerd op de kernkleuring dpi. De kwantificering van de fluorescerende labels kan vervolgens worden gemeten in de kern en het cytoplasma van elke cel en worden geëxporteerd voor verdere analyse.

Het weefsegmentatie-algoritme is in staat om verder weefselsubtypen te identificeren op basis van de weefselarchitectuur en niet uitsluitend op basis van fluorochroomidentificatie, wat een robuuster analytisch instrument biedt om de kleuring in verschillende weefselregio's te classificeren. In deze afbeelding is de computer getraind om vijf subregio's te identificeren op basis van de architecturale patronen binnen het weefsel. De achtergrond wordt gedefinieerd door de lege ruimte.

De hemolytische tumor wordt gekenmerkt door de overvloed aan rode bloedcellen in het weefsel. De tumor wordt gedefinieerd door de dichtbevolkte cellen. Het vet wordt gekenmerkt door de grote symmetrische lege cellulaire compartimenten en de spieren door een gestreept patroon.

Met deze methode kan een dubbel positieve celpopulatie worden geanalyseerd op basis van een bepaalde drempelwaarde voor fluorescentie-intensiteit. Voor GFP-positieve en alfa-glad spieractine-positieve cellen, zoals hier getoond voor aanvullende spectrale detectie van meer dan vier kleuren, raadpleeg aub de gekoppelde documenten met tips en trucs voor het multiplexen van vijf of meer probes. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de kwaliteit van de beelden sterk afhankelijk is van de juiste gebruikte controle-slides voor enkelvoudige kleuren.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals fluorescentie in situ hybridisatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over bijvoorbeeld cellulaire compartimenten en tumormicro-omgevingsweefsel. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van onze mimic-techniek, de multispectrale analyse van multicellularen componenten, en na voltoed hiervan zou u een grondig begrip moeten hebben van hoe meerdere cellulaire targets op één slide kunnen worden geïdentificeerd. U leert hoe u deze cellulaire targets uniek kunt tellen en krijgt een goed begrip van de evolutie van het tumorstroma, regeneratief weefsel of het weefsel waarin u geïnteresseerd bent.