Name: Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-22T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Leer multispectrale beeldvorming voor tumorstroma-analyse met fluorescentie-labeling in muismodellen. Deze methode identificeert celtypen en hun interacties in complexe weefsels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn dankbaar voor de discussies, begeleiding en steun van Drs. Michael Andreeff MD, PhD., En Jared Burks PhD. van het MD Anderson flowcytometrie en Cellular Imaging Core Facility. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van het National Cancer Institute (RC1-CA146381, CA-083639, R01NS06994, CA116199 en CA109451 voor FCM. ELS wordt ook ondersteund door het Ministerie van Defensie Leger (BC083397).

Syngenetische Muriene beenmergtransplantatie (BMT), zoals goedgekeurd door institutionele IACUC protocollen (Opmerking: Het succes van dit protocol vereist het gebruik van een gelabeld celtype (s) als de doelstelling voor multispectrale analyse, en de downstream-analyse te vergemakkelijken, kan men elke genetische exploiteren of stabiele cellulaire kenmerken. Wij stellen een cel, weefsel of orgaan te worden kan worden toegepast op een proefdiermodel en dat de transplantatie kan zoveel unieke bestempeld populaties bevatten het onderzoek nodig acht. Bovendien meerdere gemerkte celsystemen , zoals in transgene muizen die multipele afstamming beperkte-fluorescent gelabelde-populaties kunnen worden ontworpen om transplantatie complicaties voor de studie van bepaalde pathologische toestanden te elimineren. <ol><li> Dodelijk bestralen BMT ontvangende muizen met een enkele dosis van 9,5 Gy uur voor reconstitutie met donor beenmerg. (BMT GFP ontvangers moet 6-10 weken oud). </li><li> Bevochtig de muis pels met 70% ethanol voor het knippen en peeling het terug naar de achterste ledematen bloot met steriele chirurgische schaar. Verwijder de hele been inclusief het bekken bij het SI-gewricht. Gooi de voet door te snijden net boven de enkel en vervolgens grondig uit been verwijder alle spieren, ligamenten en overtollige weefsel. Flush merg uit het scheenbeen, fibia en bekkenkam met een 23 G naald met behulp van 2% steriele FBS in PBS (PBS-2). (BMT RFP donoren moeten worden opgeofferd volgens de institutionele normen.) </li><li> Plak en voorzichtig plet de resterende bot in fragmenten met een scalpel en pincet en plaats in 50 ml conische buis met 3 ug / ml collagenase I gedurende 1 uur bij 37 ° C bij 300 rpm. </li><li> Bovenkant van de buis met PBS-2 en het verzamelen van supernatans in een nieuwe buis en combineren met gespoelde cellen. Spin neer 250rpm gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer cellen in PBS-2 en filtreer door 40 nm cel filter. Op dit punt kunnen de cellen voor fluorescen gelabeldt geactiveerde celsortering (FACS) wil men specifieke populaties van de BMT manipuleren. </li><li> Resuspendeer 2 x 10 6 cellen per 100 ul PBS, per muis. Gebruik 29 G naald om systemisch te injecteren in bestraalde GFP ontvangende muizen door de staart of de retro-orbitale ader-schuine-side-up. Injecteer een muis met 100 ul PBS alleen als innesteling controle. Gebruik een warmtelamp aan schepen voor de injectie verwijden en gebruik een staartaderinjectie terughoudendheid bij injectie. Steriel gaas beschikbaar voor lichte druk op de staart na de injectie. </li><li> Drie weken na BMT, verzamel bloed retro-orbitaal en geanalyseerd door flow cytometrie voor de aanwezigheid van GFP circulerende cellen en de afwezigheid van RFP circulerende cellen bevestigen. De controle muis zal zijn gestorven op dit punt. </li></ol> 2. Tumor Engraftment Volgens Institutionele IACUC Guidelines <ol><li> Kweek ID8 ovariale muizen tumorcellen in vitro voorafgaand aan in vivo injectie (1 x 10 6 cellen per muis). Dag van de injectie, trypsinize cellen, wassen met PBS en resuspendeer in PBS bij 1 x 10 6 cellen per 100 ul. </li><li> Injecteren tumorcellen in intaperitoneal holte van de muis, moet de naald schuine-side-up zijn. Steriliseren injectie zicht met 70% ethanol. Injecteren in de linker of rechter kwadrant van de buik (craniale en iets mediaal van de inferieure set van abdominale tepels van de vrouwelijke muis), vermijd het raken van de organen. Bedwingen muis door te grijpen door de nekvel en houdt de staart met de pink of ringvinger. Muizen worden verdoofd met isofluraan voor deze procedure. </li><li> Offer de muizen wanneer tekenen van tumor implantatie, zoals een licht opgeblazen gevoel, zijn duidelijk zichtbaar. Dit zal plaatsvinden gedurende 4-12 weken. </li><li> Accijnzen tumoren van IP holte. Tumoren in de holte zal zien als witte knobbeltjes op en rond het oppervlak van de organen. Met een scalpel, verwijder de tumoren en plaatsen in een buis / potje van 10% formaline gedurende 24 uur fixatie. Histologische preparatie kan worden uitbesteed aan pathologie / histologie kern als reagentia en materialen zijn niet direct beschikbaar voor inbedden in paraffine en voorbereiding glijbaan. Sectie weefsel in 5-8 micrometer plakjes op glasplaatjes voor volgende kleuringen. </li></ol> 3. Multi-parameter immunofluorescentiekleuring <ol><li> Bereid Een kleur controleglaasjes voor elke fluorescente probe gebruikt in het experiment. In dit scenario worden vier kleuren gebruikt. Daarom vier dia&#39;s voor elke individuele kleur, maar ook een glijbaan voor achtergrondgeluid controle en tenslotte een glijbaan voor de volledige combinatie kleuring. (Totaal slides = 6) Alle objectglaasjes worden verwerkt naast elkaar op dezelfde wijze als experimentele variatie te minimaliseren. </li><li> Bak paraffine secties 56 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Was de dia&#39;s 3x 10 min. in xyleen. </li><li> Wassen 2x 5 min. 100% ethanol. </li><li> Was 1x 3 min 95% ethanol </li><li> Was 1x 2 min90% ethanol. </li><li> Was 1x 2 min70% ethanol. </li><li&gt; Wash 1x 2 min. in water. Langzaam dompel de kleuring rek in en uit het water 10x. </li><li> Tijdens de laatste wasbeurt serie, pre-kook natriumcitraatbuffer gedurende 2 minuten (magnetron op hoog). (Kan vervangen tris-EDTA buffer afhankelijk van de antilichamen gebruikte) </li><li> Kook de dia&#39;s voor 20 min in natriumcitraatbuffer (magnetron op 10% vermogen of in een snelkookpan). Als buffer kookt, zet magnetron en laat zitten. </li><li> Verwijderen warmtebron en laat de schuiven rusten 30 min in natriumcitraatbuffer afkoelen. </li><li> De glaasjes spoelen met water gedurende 5 minuten. </li><li> Mark rond tumorsecties met Pap Pen en zet 2% BSA / 1% FBS maleïnezuur blokkerende buffer gedurende 1 uur. De dia&#39;s te bereiden individueel om niet laten uitdrogen tijdens deze stap. </li><li> Bereid primaire antilichamen op optimale verdunning in het blokkeren van buffer. (Als de antilichamen gebruikte zijn verschillende soorten (of IgG-keten variant ex: IgG1 vs IgG2a van dezelfde soort) die kunnen worden gebruikt in combinatie bij alsIngle incubatietijd. Als antilichaamspecies overlappen, dan incubaties worden sequentieel uitgevoerd om antilichaam kruisreactie minimaliseren.) </li><li> Op dit punt, laat twee dia&#39;s met alleen het blokkeren van buffer. Deze twee dia&#39;s zullen dienen als ongekleurd controle en vlek controle nucleaire. De andere enkele kleur controles zullen worden geïncubeerd met individuele primaire antilichamen. Alleen de analyse dia zal een combinatie van primaire antilichamen hebben. </li><li> Incubeer dia&#39;s met primair antilichaam in een vocht kamerdoos op langzaam roterende schudder bij 4 ° gedurende de nacht (~ 16-20 uur) (Opmerking: bij het ​​werken met 4 fluoroforen, sequentiële kleuring of directe conjugatie kan nodig zijn om antilichamen kruisreactie minimaliseren . Onder deze omstandigheden 1,16-1,21 stappen herhalen tot alle antilichamen worden toegepast op de dia.) </li><li> Was de dia&#39;s voor 10 min in PBST (2x) voorzichtig op shaker </li><li> Terwijl wassen gaat, bereiden Alexafluor 488, 594 en 647 secundaire antilichamen voor een uiteindelijke verdunningvan 1:1000 in het blokkeren van buffer. (Zorg ervoor dat deze antilichamen en verdunningen bewaard bij 4 ° C en in het donker te allen tijde fluorescentie in batches en tijd behouden.) </li><li> Op de enkele kleur controleglaasjes, plaatst enkele Alexafluor verdunningen die overeenkomen met de soort van het primaire antilichaam gebruikt. Alle secundaire antilichamen zullen op de analyse dia worden geplaatst. De ongekleurde en de nucleaire gekleurd controleglaasjes zal met blokkerende buffer gedurende deze stap blijven. </li><li> Incubeer in een vocht kamerdoos (afgedekt met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen) op langzame roterende schudder bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. </li><li> Was de dia&#39;s voor 5 min in PBST (2x) voorzichtig op shaker. Dek af met aluminiumfolie om te beschermen tegen licht. </li><li> Voeg DAPI (1:10.000) gedurende 1 min om de zuivere DAPI glijbaan en de analyse schuif. Dek af met aluminiumfolie om te beschermen tegen licht. De andere dia&#39;s kunnen achterblijven die in de was containers. </li><li> Was de twee DAPI geïncubeerddia&#39;s in een aparte container voor de eerste 5 min wassen als de andere dia&#39;s niet verontreinigen met DAPI vlek. Voor de tweede 5 min wassen, kan de dia&#39;s worden gecombineerd in PBST (alle wasbeurten moeten worden uitgevoerd op een shaker). Dek af met aluminiumfolie om te beschermen tegen licht. </li><li> Kort dipslides in water voordat kap-slippen (1,5 dikte met waterige montage media om fluorescentie te behouden) </li><li> Laten drogen 3 uur in het donker bij kamertemperatuur. </li><li> Dicht de randen van het dekglas met nagelverharder. (Geen nagellak niet als de aceton het fluorescente signaal kan blussen). </li><li> Analyseer objectglaasjes onmiddellijk of bewaar bij 4 ° C voor toekomstige analyse. </li></ol> 4. Multispectrale <ol><li> Verzamel multispectrale beelden met behulp van een Nuance EX camera (met daarin een vloeibare kristallen afstembare filter) op een Olympus X-63 rechtopstaande microscoop met Nuance-software voor het verzamelen van gegevens. </li><li> Verzamel beelden met behulp van een olie-doelstelling om de resolutie te verhogen. </li><li> Initial set-up bestaat uit het instellen van de spectrale bereik voor elk fluorofoor in gebruik. <ol class="lalpha"><li> Voor 4 kleuren: <ol class="lroman"><li> DAPI: 420-480nm </li><li> AF488: 490-580nm </li><li> AF594: 590-640nm </li><li> AF647: 650-720nm </li></ol></li></ol></li><li> Neem een ​​eerste beeld van de analyse dia de juiste belichtingstijden verkrijgen voor elk van de spectrale bereiken. </li><li> Code &quot;spectrale library&quot; die de software gebruikt om de signaal-ruisverhouding van de fluoroforen van elkaar en achtergrondsignaal identificeren en te scheiden. (Opmerking: Elke fluorchroom moet zijn eigen enkele kleur controle dia hebben om een spectrale bibliotheek met de juiste golflengte bochten monteren om een goede analyse van de dataset Voorbeeld zorgen: 3 fluorophores = 4 controleglaasjes; 5 fluorophores = 6 controleglaasjes.). <ol><li> Afbeelding eerst de ongekleurde dia. Deze slide zal binnen de spectrale librar worden aangewezeny als achtergrond.&gt; </li><li> Afbeelding de DAPI-only schuiven tweede. Deze schuif wordt gebruikt om de DAPI gekleurde kernen met &quot;draw&quot; tool duiden en wordt opgeslagen binnen de spectrale bibliotheek en DAPI.&gt; </li><li> Afbeelding de enige AF488-schuiven derde. Deze schuif wordt gebruikt om de AF488-gekleurde gebieden duiden met &quot;draw&quot; gereedschap en wordt opgeslagen binnen de spectrale bibliotheek en AF488.&gt; </li><li> Afbeelding de enige AF594-vierde schuiven. Deze schuif wordt gebruikt om de AF594-gekleurde gebieden duiden met &quot;draw&quot; gereedschap en wordt opgeslagen binnen de spectrale bibliotheek en AF594.&gt; </li><li> Afbeelding de enige AF647 vijfde schuiven. Deze schuif wordt gebruikt om de AF647-gekleurde gebieden duiden met &quot;draw&quot; gereedschap en wordt opgeslagen binnen de spectrale bibliotheek en AF647.&gt; </li><li> Na het verzamelen van elke individuele spectrale component,sla de spectrale bibliotheek en het protocol.&gt; </li></ol></li><li> Zodra de spectrale bibliotheek is voltooid, vinden gebieden van belang op de analyse dia op de microscoop en verzamel / afbeeldingen opslaan.&gt; </li></ol> 5. Kwantitatieve analyse van multispectrale beelden <ol><li> Importeer een representatief assortiment van verworven Nuance beelden met behulp InForm Software. </li><li> Open het opgeslagen spectrale bibliotheek zoals aangegeven door het programma </li><li> Identificeer weefselgebieden plaats te analyseren. (Bijv. Tumorweefsel versus vetweefsel). </li><li> Identificeer individuele cellen op basis DAPI-kleuring. Cytoplasma automatisch bepaald gebaseerd op de vorm van de kern. </li><li> Kies de fluorescentie-intensiteit uitlezing van de keuze voor elke fluorescerende parameter (bv. gemiddelde, standaarddeviatie) </li><li> Batch de verkregen beelden en laat de software proces met behulp van de voorgestelde algoritme. </li><li> Wanneer de beeldverwerking is voltooid, samenvoegende resultaatbestanden. </li><li> Open de resultaten in Excel (of andere analytische softwarepakket) en teken twee fluorescente intensiteiten tegen elkaar XY-as. Elke fluorescentie-intensiteit wordt gegeven per cel. De dubbele positieve cellen zal verschijnen in het kwadrant rechtsboven. De gebruiker moet de basislijn fluorescerende intensiteiten definiëren. </li></ol>

<ol><li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+the+tumor+microenvironment%3A+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563(2012).</li>
<li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+%28MSCs%29+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li>
<li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li>
<li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992(2009).</li>
<li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+neighbors+and+distant+invaders%3A+Tumor-associated+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li>
<li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+angiogenesis%3A+molecular+pathways+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li>
<li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li>
<li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+research+and+technique%22%5BJournal%5D)">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li>
<li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13(2008).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li>
<li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied%22%5BJournal%5D)">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li>
</ol>

FCM, CMB, en ELS er geen conflicten en niets te onthullen.

Hierin beschrijven we de toepassing van multispectrale we beschrijven als MIMicc-multispectrale ondervraging gemultiplexte cellulaire samenstellingen, het beenmerg afgeleide stromale bestanddelen van de tumor micro-analyse, maar deze methode en concept kan worden toegepast op het ontcijferen andere cellulaire elementen die een complexe samenstellen weefsels zoals waargenomen tijdens wondgenezing reacties of tijdens een regeneratief weefsel. In deze experimenten gebruiken we transgene muizen fluorescent onderscheiden bee...

Inzicht in de ontwikkeling en reparatie weefsel is belangrijk om het ophelderen van de deelnemende cellulaire componenten bij wondgenezing, 2,3 regeneratieve geneeskunde, ontwikkelingsbiologie en de tumor biologie. Onder omstandigheden van de reparatie, talrijke celtypen infiltreren de omringende micro-omgeving om te helpen bij vascularisatie, ECM afzetting, proliferatie en herstructurering weefsel. Cellulaire factoren en fenotypes worden geïdentificeerd op basis van multiparameter, multiplex markers die de lokalisatie kan identificeren, differentiatie status en interactie cellulaire componenten binnen de onderzochte micro. Hierin beschrijven we de ontwikkeling van tumoren als een prototypisch voorbeeld van deze multicolor-meercellige transplantatie model gevolgd door multispectrale beeldvorming en spectrale ontmenging methodologie. Tumorprogressie is een proces van meerdere stappen dat wordt gekenmerkt door een aantal verworven mogelijkheden die verbeterde proliferatie, een onderntiapoptotic, invasieve en angiogene eigenschappen. 4 Tumor ontwikkeling wordt vergemakkelijkt door niet-neoplastische cellen die worden gerekruteerd in de omgeving groeifactoren, structurele matrices, vasculaire netwerken en immuunmodulatie bieden. 1,5,6 Dit microhabitat bestaat uit cellen afkomstig van lokaal, naburige weefsels zoals vet en bloedvaten en verre bronnen zoals beenmerg afgeleide cellen 1. De mate van niet-neoplastische cel opname hangt af van de vraag van de tumor, die vaak overeenkomt met de fase / graad van de tumor. De rol van het tumor ondersteunende micro begrijpen, moet men de oorsprong en de differentiatie potentieel van de niet-neoplastische cel populaties begrijpen. Dit protocol is ontworpen om te helpen bij de interpretatie van tumorprogressie door visualisatie van zowel het beenmerg afgeleide cellulaire componenten en de lokale weefsel derived cellen. Gebruik te maken van fluorescerende reporter-gen uitdrukken transgene muizen, we getransplanteerd GFP (groen-fluorescerend eiwit) beenmerg in een dodelijk bestraald RFP (rood-fluorescerend eiwit) muis. Na succesvolle beenmerg aanslaan, is een syngene tumorcellijn orthotopically geïnjecteerd en mogen inenten voor 4-8 weken. De resulterende tumor wordt uitgesneden uit de muis en verwerkt voor immunofluorescentie (IF) kleuring om de stromale componenten te visualiseren. Multiplexing IF markers is een veelgebruikte techniek die aanzienlijke optimalisatie 7-9 omvat, maar met een multispectrale / unmixing platform verbetert de mogelijkheid van fluorescente merker combinaties die spectrale overlap hebben. Hierin presenteren we een techniek die we noemen MIMicc-multispectrale ondervraging gemultiplexte cellulaire samenstellingen om vlekken en analyseren maximaal acht merkers binnen een tumor gedeelte op een dia om de cellulaire oorsprong, celdifferentiatie st analyserenAtus en cel-cel interacties van onderdelen binnen de tumor micro-omgeving. Deze vereenvoudigde voorbeeld heeft het potentieel worden opgevoerd om vijf, zes of meer markeringen behulp antilichamen of intracellulair-promoter gedreven fluorescerende expressie. Tabel 1 geeft potentiële fluorescent antilichaam kleuring combinatie met geschikte soorten in aanmerking genomen te analyseren.

<table><tbody><tr><td>.2 &mu;m filter</td><td>Fisher</td><td>09-740-35A</td><td></td></tr><tr><td>10 ml lure lock </td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>25 G needle</td><td>Cardinal</td><td>BF305122</td><td></td></tr><tr><td>40nm filter</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tube</td><td>Fisher</td><td>1495949A</td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 488-ms1</td><td>invitrogen</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 594-Rb</td><td>invitrogen</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 647-ch</td><td>Invitrogen</td><td>A21449</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>Corning</td><td>2940-243</td><td></td></tr><tr><td>CRI-Nuance</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dapi</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>CellGro</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Dharmacon</td><td>4004-DV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>GFP-ms1</td><td>Abcam</td><td>ab38689</td><td></td></tr><tr><td>Insulin needle</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Acros</td><td>100-16-7</td><td></td></tr><tr><td>Moisture chamber box</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Nail hardener</td><td>Sally Hansen</td><td>2103</td><td></td></tr><tr><td>Pap pen</td><td>Abcam</td><td>Ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep L Glut</td><td>invitrogen</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Steril PBS</td><td>invitrogen</td><td>14040-182</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>invitrogen</td><td>252000-56</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4"> Blocking Buffer <table fo:keep-together.within-page="always" border="1"> <tbody> <tr> <td>maleic acid</td> <td>14.51 g </td> </tr> <tr> <td>NaCl</td> <td>10.95 g</td> </tr> <tr> <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td> <td>9+g</td> </tr> <tr> <td>Gedestilleerd water</td> <td>250 ml</td> </tr> </tbody> </table> *Voeg 0,2% Tween-20 toe aan 1x oplossing voor blocking buffer met 2%BSA/2%FBS. Roer en filter. Antigeen ophaling buffers: <table fo:keep-together.within-page="always" border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0,05% Tween 20, pH 9,0)</td> </tr> <tr> <td>Tris Base</td> <td>1,21 g</td> </tr> <tr> <td>EDTA</td> <td>0,37 g</td> </tr> <tr> <td>Gedestilleerd water</td> <td>1000 ml (100 ml om 10x te maken, 50 ml om 20x te maken)</td> </tr> <tr> <td>Tween 20</td> <td>0,5 ml</td> </tr> </tbody> </table> *Bewaar bij RT gedurende 3 maanden of bij 4 &deg; C voor langer <table fo:keep-together.within-page="always" border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2">Natrium Citraat Buffer (10 mM Natrium Citraat, 0,05% Tween 20, pH 6,0)</td> </tr> <tr> <td>Tri-natriumcitraat (dihydraat)</td><td>2,94 g</td></tr><tr><td>Gedestilleerd water</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>HCl (pas pH aan tot 6,0)</td><td>1N</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>0,5 ml</td></tr></tbody></table>

kwantitatieve multispectral analyse na fluorescent tissue transplantatie voor visualisatie van de cel origins, types en interacties

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Met de wens om de bijdragen van verschillende cellulaire elementen voor de ontwikkeling van een complex weefsel begrijpen, zoals de vele celtypen die aan regenererend weefsel, tumorvorming of vasculogenese, ontwierpen we een veelkleurig cellulaire transplantatie model van tumorontwikkeling in die celpopulaties afkomstig uit verschillende fluorescentie gekleurde rapporteergen muizen worden getransplanteerd, geënt of geïnjecteerd in en rond een ontwikkelende tumor. De gekleurde cellen worden vervolgens gerekruteerd en opgenomen in de tumor stroma. Om beenmerg afgeleide tumor stromale cellen kwantitatief te beoordelen, we getransplanteerde GFP tot expressie transgene hele beenmerg in dodelijk bestraalde RFP uiten muizen zoals goedgekeurd door IACUC. 0ovarian tumoren die orthotopically werden geïnjecteerd in de getransplanteerde muizen uitgesneden 6-8 weken na implantatie en beenmerg marker vertrek (GFP) alsook antilichaam markers tumor geassocieerde detecteren geanalyseerdstroma behulp van multispectrale beeldvormende technieken. Vervolgens hebben we aangepast een methodiek we MIMicc-Multispectral Ondervraging van Multiplexed cellulaire composities noemen, met behulp van multispectrale unmixing van fluoroprobes kwantitatief beoordelen welke gelabelde cel kwam waaruit beginnen populaties (gebaseerd op originele reporter gen labels), en ons vermogen om te scheiden, 4, 5 , 6 of meer spectra per dia toeneemt, hebben we extra immunohistochemie verband met cellijnen of differentiatie om de precisie te verhogen toegevoegd. Gebruik te maken van software om co-gelokaliseerde multiplex-fluorescerende signalen, tumor stromale populaties kunnen worden getraceerd, geïnventariseerd en gekarakteriseerd op basis van marker vlekken op te sporen. 1

Met behulp van een multispectrale beeldvormende techniek om tumoren geënt in onze transgene BMT muismodel analyseren, kunnen we stromale tumor componenten die van beenmerg herkomst te onderscheiden. De aanvankelijke BMT werd drie weken na transplantatie door flowcytometrie (figuur 1) bevestigd. Orthotopically ingespoten ongelabelde ovariële tumoren na BMT innesteling bevestigingen werden uitgesneden en formaline gefixeerde 6 weken na de eerste tumor injectie. Paraffine ingebedde tumor secties werden cou...

Complex weefsel massa, van organen tumoren, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire elementen. We opgehelderd de bijdrage van cellulaire fenotypes binnen een weefsel met behulp van multi-gelabelde fluorescerende transgene muizen in combinatie met multiparameter immunofluorescentiekleuring gevolgd door spectrale unmixing naar cel oorsprong evenals karakteristieken van de cel op basis van eiwit expressie ontcijferen.

Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Het doel van de volgende procedure is om multispectrale analyse van multiplex cellulaire samenstellingen of nabootsingen te gebruiken om de bijdragen van verschillende in het beenmerg aanwezige populaties aan de ontwikkeling van het tumorstroma te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst een transgene GFP-gelabelde ontvanger-muis te transplanteren met RFP-expresserende beenmergstamcellen. In de tweede stap worden de betreffende tumorcellen in dezelfde ontvanger geïnjecteerd en na transplantatie wordt de uitgesneden tumor gesneden, ingebed in paraffine en gelabeld met immunofluorescerende antilichamen.Vervolgens wordt er, zodra de spectrale bibliotheek compleet is, een spectrale bibliotheek gemaakt van alle golflengten die zijn gebruikt voor het verkrijgen van beelden van de tumorsneden. In de laatste stap worden de preparaten gefotografeerd en wordt er een data-analyse uitgevoerd om de identificatie en associatie van de kleuringspatronen van de gewenste cellulaire markers mogelijk te maken. Uiteindelijk kunnen nieuwe cellulaire entiteiten of fenotypes worden geïdentificeerd op basis van de multiplex labeling van extracellulaire en cellulaire markers, om de samenstelling van complexe w

quantitative-multispectral-analysis-following-fluorescent-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Tracking Dynamica van Muscle innesteling in kleine dieren door In Vivo TL-Imaging

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

De belangrijkste aderente celtypen die zijn afgeleid van menselijk spierweefsel zijn myogene cellen en fibroblasten. Hier worden celpopulaties verrijkt met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering op basis van het CD56-antigeen. Daaropvolgende immunolabeling met specifieke antilichamen en het gebruik van beeldanalysetechnieken maakt kwantificering van cytoplasmatische en nucleaire kenmerken in individuele cellen mogelijk.

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

We beschrijven een protocol voor hybride beeldvorming, dat fluorescentie-gemedieerde tomografie (FMT) combineert met micro-computertomografie (µCT). Na fusie en reconstructie voeren we interactieve orgaansegmentatie uit om kwantitatieve metingen van de fluorescentieverdeling te extraheren.

Hybride μCT-FMT beeldvorming en beeldanalyse

Immunohistochemmie is een krachtige laboratoriumtechniek voor het evalueren van eiwitlokalisatie en -expressie in weefsels. Huidige semi-automatische methoden voor kwantificering introduceren subjectiviteit en leiden vaak tot onherhaalbare resultaten. Hier beschrijven we methoden voor multiplexte immunohistochemmie en objectieve kwantificering van eiwitexpressie en co-lokalisatie met behulp van multispectrale beeldvorming.

Kwantificering van eiwitexpressie en Co-localisatie behulp multiplexverzending Immuno-histochemische kleuring en multispectrale

De assemblage en het gebruik van een multimodaal microendoscoop wordt beschreven, die oppervlakkige weefseldatagegevens kan co-registreren met fysiologische weefselparameters, waaronder hemoglobineconcentratie, melanineconcentratie en zuurstofverzadiging. Deze techniek kan nuttig zijn voor het evalueren van weefselstructuur en perfusie, en kan worden geoptimaliseerd voor individuele behoeften van de onderzoeker.

Multimodale beeldvorming en spectroscopie Fiber-bundel microendoscopy Platform voor niet-invasieve,<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Analyse

Bestuderen van tumor communicatie kan identificeren prognostische of voorspellende biomarkers voor klinische respons op immunotherapie. Hier wordt gepresenteerd, is een innovatieve methode op basis van in situ fluorescentie multispectrale imaging te analyseren en automatisch verschillende subpopulaties van CD8 tellen+ T cellen. Deze reproduceerbaar zijn en betrouwbare techniek is geschikt voor grote cohort analyses.

Multiplexed immunofluorescentie analyse en kwantificering van Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cellen

Dit artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie ter voorbereiding van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME)-array voor high-throughput manipulatie van fysische en chemische cues nabootsen in vivo cellulaire microenvironments en aan het identificeren van de optimale cellulaire omgeving voor menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) met eencellige profilering.

Fabricage van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie Array

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

De hier beschreven intravitale beeldvormingsmethode maakt gebruik van collageen tweede harmonische generatie en endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H om een niet-invasieve tumormicro-omgeving te segmenteren in tumor-, stromale en vasculaire compartimenten voor diepgaande analyse van 4D intravitale beelden.

Een labelvrije segmentatiebenadering voor intravitale beeldvorming van de micro-omgeving van borsttumoren

Spectral Iterative Bleaching Extend Multiplexity (IBEX) bouwt voort op de basis IBEX-techniek door heparineblokkering toe te voegen om niet-specifieke binding te minimaliseren en gebruik te maken van spectrale detectie met computationele ontmenging om autofluorescentie te onderdrukken. Deze aanpak versnelt de beeldacquisitie en vermindert tegelijkertijd achtergrondbronnen, waardoor robuuste multi-ronde, high-parameter ruimtelijke proteomische analyses mogelijk zijn.

High-plex beeldvorming met behulp van spectrale confocale microscopie om niet-specifieke weefselfluorescentie te minimaliseren

Leer multispectrale beeldvorming voor tumorstroma-analyse met fluorescentie-labeling in muismodellen. Deze methode identificeert celtypen en hun interacties in complexe weefsels.

Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties (Video) | JoVE Journal

Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties

Meer video's verkennen