Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties
September 22nd, 2013
Complex weefsel massa, van organen tumoren, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire elementen. We opgehelderd de bijdrage van cellulaire fenotypes binnen een weefsel met behulp van multi-gelabelde fluorescerende transgene muizen in combinatie met multiparameter immunofluorescentiekleuring gevolgd door spectrale unmixing naar cel oorsprong evenals karakteristieken van de cel op basis van eiwit expressie ontcijferen.
Het doel van de volgende procedure is om multispectrale ondervraging van multiplex cellulaire samenstellingen of imitatie te gebruiken om de bijdragen van verschillende bewonende populaties van het beenmerg aan de ontwikkeling van het tumorstroma te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst een transgene GFP-gelabelde ontvangermuis te transplanteren met RFP-uitdrukkende beenmergstamcellen. In de tweede stap worden de tumorcellen van belang in dezelfde ontvanger geïnjecteerd en dan na aanplant, wordt de uitgesneden tumor gesneden, in paraffine ingebed en gelabeld met immunofluorescente antilichamen.
Vervolgens wordt een spectraal bibliotheek van alle golflengten die worden gebruikt voor het verkrijgen van beelden van de tumorsecties gemaakt zodra de spectraal bibliotheek voltooid is. De dia's worden in de laatste stap beeldvormend gemaakt, data-analyse wordt uitgevoerd om de identificatie en associatie van de kleuringspatronen van de cellulaire markers van belang mogelijk te maken. Uiteindelijk kunnen nieuwe cellulaire entiteiten of fenotipen worden geïdentificeerd op basis van de multiplexkleuring van extracellulaire en cellulaire markers om de samenstelling van complexe weefsels zoals de tumormicro-omgeving beter te begrijpen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van standaard immunofluorescentietechnieken is dat de multispectrale analyse je in staat stelt om zeven of meer fluoro fours op dezelfde dia te multiplexen, waardoor een veel nauwkeuriger en gedetailleerdere ondervraging van de cellulaire samenstelling van de tumormicro-omgeving of een regeneratief weefsel mogelijk is. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de oorsprong en samenstelling van de tumormicro-omgeving, kan deze worden toegepast op andere systemen zoals regeneratieve geneeskunde, ontwikkelingsbiologie en immuunbiologie. Het demonstreren van deze procedure samen met Dr.Spa is Chris Booth, een onderzoeksassistent in mijn laboratorium Vanwege IU Cook-beperkingen aan deze instelling, zullen we het bespreken, maar geen directe muismanipulaties aan muizen laten zien.
Deze beenmergprocedures en onze tumoraanplanttechnieken zijn te vinden in ons eerdere werk, zoals kid en anderen stamcellen. 2009 om te beginnen na het isoleren van de beenmergcellen uit de spiegelende achterste ledematen, schors de cellen op bij 2 miljoen cellen per 100 microliter PBS per muis. Gebruik een verwarmingslamp om de bloedvaten van een bestraalde ontvanger GFP-muis te verwijden en plaats de muis in een injectiebeperking van de staartader.
Gebruik een 29 gauge naald met de punt naar boven om de celsuspensies systemisch in de staart of retroorbitale ader te injecteren. Gebruik steriele gaas om lichte druk op de staart uit te oefenen na de injectie. Injecteer één muis met 100 microliter PBS alleen als aanplantcontrole op de dag van injectie.
Schors de tumorcellen van belang in PBS bij 1 miljoen cellen per 100 microliter. Nadat u de buik heeft gesteriliseerd met 70% ethanol. Gebruik één hand om de muis vast te houden door de nek en de staart, en houd dan met de andere hand de naald met de punt naar boven en injecteer de tumorcellen in de intraperitoneale holte van de ontvangermuis.
Na 15 tot 30 dagen, euthaniseer de muizen en verwijder de tumor uit hun buik. Bevestig vervolgens de tumoren in 10% formine gedurende 24 uur. Snijd vervolgens het gefixeerde weefsel in vijf tot 10 micrometer plakjes voor verdere kleuringsprocedures.
Na het fixeren van de weefselsecties in paraffine, bak de monsters gedurende een uur op 56 graden Celsius. Was vervolgens de dia's volgens de volgende sequentie Na de laatste ethanolwassing, spoel de dia's twee minuten in water. Doe de kleuringrep met langzame bewegingen 10 keer in en uit het water.
Plaats vervolgens natriumcitraatbuffer in de magnetron om op te warmen. Na het koken van de dia's gedurende 20 minuten in natriumcitraatbuffer, laat de monsters 30 minuten afkoelen in de buffer. Was vervolgens vijf minuten met geïoniseerd water.
Tik vervolgens op de dia om grote druppels water weg te laten rollen, wees voorzichtig om de weefselsectie niet te laten uitdrogen. Gebruik een hydrofobe barrièrepen om de secties rond de tumorsecties te markeren en plaats vervolgens onmiddellijk blokkerende buffer op het monster om te voorkomen dat de weefselsectie uitdroogt. Na een uur, incubeer de dia's met de primaire antilichaam van belang in een vochtige kamerbox op een langzaam roterende shaker bij vier graden overnacht.
De volgende ochtend, was de dia's twee keer in PBST gedurende 10 minuten met zachte schudbewegingen terwijl de secties worden gewassen. Verdun de secundaire antilichamen in een verhouding van één op duizend antilichaam tot blokkerende buffer. Incubeer vervolgens de secties in de geschikte secundaire antilichamen in de vochtige kamerbox bedekt met aluminiumfolie op een langzaam roterende shaker op kamertemperatuur Na twee uur.
Was de dia's twee keer in PBST gedurende vijf minuten met zachte schudbewegingen en bescherm deze tegen licht. Kleur vervolgens de dappy-slechts dia en de analysedia's met DPI gedurende één minuut, waarbij de dia's tijdens de incubatie bedekt blijven. Plaats een dekglas over elk monster, verzegel de randen van elk dekglas met nagelhardner.
Nu om de multispectrale beeldvorming uit te voeren, gebruik een olieobjectief om een eerste beeld van de analysedia te maken om de juiste belichtingstijden voor elk van de spectrale bereiken in de spectrale bibliotheek te verkrijgen. Bijvoorbeeld, dit tabeloverzicht suggereerde spectrale bibliotheekprotocollen op basis van het aantal verdiepingen dat in het experiment wordt gebruikt. Beeld vervolgens de ongeverfde dia voor de achtergronddia in de spectrale bibliotheek voor dit experiment af.
Volgende afbeelding, beeld de ongeverfde dia af om de achtergrondafbeelding voor de spectrale bibliotheek te verkrijgen. Beeld nu elke controle enkele verdiepingsgekleurde dia af en sla de afbeeldingen op onder de naam van het secundaire antilichaam dat voor elke dia wordt gebruikt. Zodra de verdachte bibliotheek voltooid is, verzamel afbeeldingen van de gebieden van belang op de analysedia om afbeeldingen van de tumorweefsels te analyseren.
Importeer eerst een representatieve selectie van de verkregen nuanceafbeeldingen met behulp van
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt de cellulaire bijdragen aan de ontwikkeling van tumorstroma door middel van multi-spectrale ondervraging van multiplex cellulaire samenstellingen. Door transgene muizen en immunofluorescente kleuring te gebruiken, richt het onderzoek zich op het identificeren van nieuwe cellulaire fenotipen binnen complexe weefselomgevingen.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Oncologie
Achtergrond
- Complexe weefsels bestaan uit verschillende cellulaire elementen.
- Het begrijpen van cellulaire fenotipen is cruciaal voor onderzoek naar de tumoromgeving.
- Multi-spectrale beeldvormingstechnieken verbeteren cellulaire analyse.
- Transgene modellen vergemakkelijken de studie van specifieke celpopulaties.
Doel van het onderzoek
- Om de bijdragen van in het beenmerg aanwezige populaties aan het tumorstroma te bepalen.
- Om nieuwe cellulaire entiteiten te identificeren op basis van multiplex labeling.
- Om het begrip van de complexe weefselsamenstelling te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Transplantatie van transgene GFP gelabelde muizen met RFP expresserende beenmergstamcellen.
- Injectie van tumorcellen in ontvangermuizen na implantatie.
- Immunofluorescente kleuring van verwijderde tumorsecties.
- Creatie van een spectrale bibliotheek voor beeldanalyse.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van cellulaire markers geassocieerd met tumorstroma.
- Nieuwe cellulaire fenotipen ontdekt door middel van multiplex labeling.
- Verbeterd begrip van de samenstelling van de tumoromgeving.
- Succesvolle toepassing van multi-spectrale beeldvormingstechnieken.
Conclusies
- De studie biedt inzichten in de cellulaire dynamica van tumorstroma.
- Multi-spectrale technieken zijn effectief voor het analyseren van complexe weefsels.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om therapeutische doelwitten te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative multispectral analysis of fluorescent tissue transplants enables precise deconvolution of cellular origins and phenotypes within complex tissue environments, such as the tumor microenvironment. This approach enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking by allowing multiplexed, quantitative assessment of cell lineage contributions and interactions. The method supports critical inflection points in discovery and translational research pipelines by providing robust, reproducible cellular composition data for portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of cellular contributions to tissue development and disease models.
- Supports functional target validation by distinguishing cell lineages and their roles in tumor stroma formation.
- Facilitates mechanistic de-risking through multiplexed identification of novel cellular phenotypes.
- Improves predictive confidence for advancing targets with complex cellular interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed tissue systems for downstream screening workflows.
- Standardizes quantitative readouts of cell origin and marker expression across multiple fluorophores.
- Enables reproducible, high-content analysis for compound evaluation in disease-relevant systems.
- Supports scalability and platform reuse by accommodating seven or more markers per slide.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by tracing bone marrow-derived and stromal cell contributions in vivo.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal tracking of cellular dynamics.
- De-risks translational advancement by quantifying cell-type specific responses within the tumor microenvironment.
- Supports biomarker alignment through multiplexed immunohistochemistry and spectral unmixing.
Pipeline & Workflow Integration
This multispectral methodology integrates from early discovery through preclinical research, bridging hypothesis testing, target validation, and translational continuity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of cell lineage contributions and tissue architecture.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs for assay standardization and reproducibility.
- Analytics: Provides high-content, statistically robust measurements of cellular markers and tissue segmentation.
- Translational Research: Enables tracking of cell fate and interactions in disease-relevant in vivo models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for multiplexed tissue analysis across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in complex tissue systems.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of multiplexed tissue analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust cellular composition data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multispectral imaging, immunofluorescence, and spectral unmixing software.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and computational analysis infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of controls and spectral libraries.
- Adaptable to various tissue and disease models with appropriate marker selection.
- Image quality and quantitative accuracy depend on optimal control slide preparation and spectral calibration.
