Isolatie, verwerking en analyse van Muriene Gingival Cells

Het algemene doel van deze procedure is om het mirin-gingiva nauwkeurig te isoleren en te verwerken voor verdere flowcytometrie-analyse. Dit wordt bereikt door eerst het gingiva op zorgvuldige wijze chirurgisch te isoleren. Vervolgens wordt het uitgesneden weefsel verwerkt om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen.

Vervolgens wordt de extracellulaire en intracellulaire kleuring met antilichamen uitgevoerd. Tot slot wordt het monster geanalyseerd via flowcytometrie. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die via flowcytometrische analyse verschillende celpopulaties in het tandvlees en cellulaire veranderingen in het weefsel tonen na blootstelling aan een immunologische prikkel.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals in de OC-chemie of bij mono-fluorescentie, is dat het een snelle en eenvoudige methode is om een groot aantal cellen te analyseren, wat gelijktijdige analyse van meerdere variabelen mogelijk maakt, evenals het sorteren van verschillende celtypen voor verdere experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de immunologie, zoals de manier waarop micro-organismen de gingivale homeostase beïnvloeden en hoe dit verband houdt met ontsteking-geïnduceerd botverlies in een experimenteel model van parodontitis. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we ons begonnen te richten op de rol van de RI-cellen tijdens parodontitis. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de GVA-acceleratietechniek moeilijk aan te leren is vanwege de kleine omvang en de relatief lastige toegang tot de MU one J gva.

Begin met het voorbereiden van de mediumoplossingen en de gesteriliseerde chirurgische instrumenten volgens het tekstprotocol. Nadat een muis is geëuthanaseerd, volgens de goedgekeurde methoden van de commissie voor dierproeven van uw instelling, gebruikt u scherpe, stompe rechte scharen om beide zijden van de mondholte open te knippen, inclusief de wangen en de ramus van de onderkaak, en trek de onderkaak naar beneden door de scharen loodrecht op het vlak van het gehemeltebot te richten. Snijd de weke en harde weefsels door in een denkbeeldige lijn, één millimeter achter de derde molaren.

Maak vervolgens een incisie in het zachte en harde weefsel, twee millimeter achter de snijtanden. Trek daarna het voorste gedeelte van de mond naar beneden om de neusholte bloot te leggen, waarbij de schaar parallel aan het gehemelte wordt gehouden. Plaats één bloedstelper in de neusholte en gebruik de andere om een incisie bij het vestibulum te maken, snijdend richting de posterieure incisie.

Herhaal de incisie aan de andere zijde van de maxilla om deze los te maken van de schedel. Snijd deze vervolgens in het midden door en trim het palatinale weefsel van elke hemi-maxilla om het alveolaire bot bloot te leggen met behulp van scharen en pincetten. Pel het gingivale weefsel van de anterieure rand en plaats dit in een plaat met PBS en 2% foetaal kalfsserum of FCS; om het tandvlees verder te verwerken, wordt het overgebracht naar een kweekschaal met één milliliter PBS, twee milligram per milliliter collagenase type twee en één milligram per milliliter DNase.

Snijd het weefsel in met een steriel chirurgisch mesje nr. 15. Hak het weefsel goed fijn voordat het naar een conische reageerbuis van 15 milliliter wordt overgebracht. Was eventuele resterende weefselcellen van de plaat met één milliliter P-B-S-F-C-S en breng dit over naar de buis.

Incubeer het weefsel in een voorverwarmde schudincubator bij 37 °C en 200 RPM gedurende 20 minuten. Voeg vervolgens 20 µL 0,5 M EDTA toe en incubeer nogmaals 10 minuten. Voeg daarna PBS-FBS toe tot een volume van 12 mL en centrifugeer het monster bij 4 °C, 400 ×g gedurende acht minuten.

Nadat het supernatant is verwijderd, worden de cellen gesuspendeerd in twee milliliters PBS-FCS. Filtreer het monster door een cellenzeef van 70 micron en centrifugeer het filtraat bij vier degrees Celsius en 320 ×g gedurende vijf minuten. Resuspendeer de cellen in 300 microliters PBS-FCS.

Tel ten slotte de cellen in een totaalvolume van 100 µL, terwijl u werkt onder een zu%)kast bij een lage temperatuur en met gedoofde lichten; voeg 0,2 tot 0,5 µg van elke geselecteerde antistof toe per 1 × 10⁶ cellen en vortex kort. Na incubatie van de monsters gedurende 15 minuten in het donker bij 4 °C, voegt u 2 mL PBS-FBS toe en centrifugeert u 5 minuten bij 320 ×g en 4 °C. Om de cellen te fixeren, aspireert u het supernatant en resuspendeert u deze vervolgens door onder vortexen druppelsgewijs 500 µL koude BD CytoPerms toe te voegen.

Voor de cyto-effecten worden de buisjes 40 minuten bij 4 °C in het donker geïncubeerd, gevolgd door vortexen. Voeg vervolgens kort één ml BD perm wash-buffer toe en centrifugeer 7 minuten bij 800 ×g bij 4 °C. Aspireer na herhaling van de wasstap alle vloeistof, behalve 300 µL van de wasbuffer.

Om de cellen vervolgens intracellulair te kleuren in een totaalvolume van 100 µL, voegt u per 1 × 10⁶ cellen één µg van elk geselecteerd antilichaam toe. Vortex kort en incubeer 30 minuten in het donker. Nadat de cellen tweemaal zoals voorheen zijn gewassen en al het supernatant is verwijderd, resuspendeert u de cellen in 300 µL verse koude BD perm wash buffer.

Filter na een kortstondig vortexen de suspensie in fax-buisjes. Bewaar de buisjes op ijs of in de koelkast in het donker tot de fax-analyse wordt uitgevoerd. Gingivale cellen gepoold van twee naïeve muizen.

De metingen werden uitgevoerd in een LSR two flowcytometer en geanalyseerd met FlowJo-software. De hier getoonde side scatter- en forward scatter-plots illustreren de celdistributie. De gating-strategie voor de identificatie van lymfocyten, monocyten, dendritische cellen en granulocyten is ter vergelijking aangegeven.

Deze figuur toont een FACS-plot die gingivale cellen illustreert, gezuiverd uit P. gingivalis-geïnfecteerde muizen 21 dagen na orale toediening in een model van experimentele parodontitis. Een toename in de verschillende immuuncelpopulaties kan eenvoudig worden gedetecteerd in de geïnfecteerde muizen in vergelijking met de hier getoonde naïeve muizen. Immuuncellen in het bewerkte tandvlees worden geïdentificeerd door selectie (gating) op cellen die de hematopoëtische marker CD 45 tot expressie brengen.

Deze cellen werden verder gesegregeerd in CD3-positieve T-cellen, zoals weergegeven in deze figuur. Neutrofielen werden eveneens geïdentificeerd op basis van de expressie van de Ly6G- en CD11b-moleculen. Tot slot werden Langersthanscellen en een epitheliale subset van dendritische cellen geïdentificeerd door gating op MHC-klasse II-positieve CD11c-positieve cellen en expressie van EPAM en RIN CD207. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in drie en een halve tot vijf uur worden voltooid, mits deze procedure correct wordt uitgevoerd.

Andere methoden, zoals real-time PCR, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals genexpressie in individuele cellen na de ontwikkeling. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de immunologie om de lokale respons in de G GVA tegen elke vorm van schade binnen het parodontale onderzoek te verkennen. Deze techniek stelde ons in staat om de rol van immuun- en niet-immuuncellen van de G GVA in de pathogenese van experimentele periodontitis te verduidelijken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u urine-GVA's kunt isoleren en verwerken om een single-cell suspensie te verkrijgen, die vervolgens zal worden onderworpen aan een extra- en intracellulaire vir-kleuring voor analyse via flowcytometrie.