Name: Isolatie, verwerking en analyse van Muriene Gingival Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Leer hoe je muizingivacellen isoleert en verwerkt voor flowcytometrie-analyse. Deze methode maakt gedetailleerde studie van celpopulaties en immunologische reacties in orale weefsels mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation (nr. 1418/11) tot AHH en (nr. 1933/12) aan AW, de Duitse Israëlische Stichting voor jonge onderzoekers (GIF Young) naar AHH, en de Dr I . Cabakoff Onderzoek Endowment Fund aan de Hebreeuwse Universiteit Hadassah-School of Dental Medicine aan AHH en AW.

Bereiden op voorhand: <ul><li> PBS + 2% FCS </li><li> PBS + 2% FCS met 2 mg / ml collagenase type II en 1 mg / ml DNAse type I (1 ml per monster) </li><li> Gesteriliseerde chirurgische instrumenten </li><li> 0,5 M EDTA-oplossing </li></ul> 1. Bovenste tandvlees Excisie Techniek <ol><li> Euthanaseren muizen met behulp van goedgekeurde IACUC begeleiding. </li><li> Snijd beide zijden van de mondholte, waaronder de wangen en de onderkaak ramus met een scherp / stomp recht schaar. </li><li> Trek de onderkaak. </li><li> Snijd de zachte en harde weefsels in een denkbeeldige lijn 1 mm achter de derde molaren met standaard een schaar. Richt de schaar loodrecht op het vlak van de palatale bot (Figuur 2A, blauwe lijnen). </li><li> Incise de zachte en harde weefsels 2 mm achter de snijtanden (Figuur 2A, blauwe lijnen). </li><li> Trek de voorste deel van de mond. De neusholte waarneembaar na deze stap. </li><li> Plaats de schaarparallel aan het gehemelte, zet een mes in de neusholte, moet de ander mes incisie in de vestibule. Snijd totdat de achterste incisie (Figuur 2A, groene lijnen). Herhaal deze stap aan beide zijden van de bovenkaak. Aan het einde van de bovenkaak wordt losgemaakt van de rest van de schedel (figuur 2B). </li><li> Verwijder de bovenkaak, snijd het in het midden hechtdraad (figuur 2, zwarte stippellijn) en trim de palatale weefsel van elk hemi-bovenkaak tot aan het alveolaire bot. </li><li> Schil de tandvleesweefsels (zowel hemi-maxillae) uit hun voorste grens met Adson pincet (zonder tanden). </li><li> Leg de uitgesneden gingiva in een plaat met PBS + 2% FCS. </li></ol> 2. Gingivale Processing <ol><li> Plaats de uitgesneden gingiva in een weefselkweek schaal (35 x 10 mm) met 1 ml PBS + 2% FCS, 2 mg / ml collagenase type II en 1 mg / ml DNAse I. Type </li><li> Hak ook het weefsel met een N ° 15 steriel chirurgisch mes. </li><li> Transfer het weefsel van de plaat tot een ml conische reageerbuis 15. </li><li> Was de weefsels / cellen nog op de plaat met 1 ml PBS + 2% FCS en transfer naar dezelfde reageerbuis. </li><li> Incubeer in een shaker incubator gedurende 20 minuten bij 37 ° C, 200 rpm (aanbeveling: Verwarm de incubator). </li><li> Voeg 20 gl 0,5 M EDTA en incubeer gedurende nog 10 min bij 37 ° C, 200 rpm. </li><li> Vul het reageerbuisje tot 12 ml met PBS + 2% FCS en centrifugeer bij 4 ° C, 400 g gedurende 8 min (aanbeveling: pre-chill de centrifuge). </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer cellen met 2 ml PBS + 2% FCS. </li><li> Filter de steekproef met een 70 um cel zeef en stroom besparen door. </li><li> Centrifugeer bij 4 ° C, 320 g gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer cellen met 300 pi PBS + 2% FCS. </li><li> Tel de cellen (ongeveer 5-10 x 10 5 cellen worden verwacht van een bovenkaak). </li></ol> 3. Extracellulaire en intracellulaire AntibodyKleuring voor flowcytometrie-analyse Het wordt aanbevolen om te werken binnen een kap, met lichten uit. Het is cruciaal om de cellen houden in een constante koude omgeving, evenals alle benodigde materialen. <ol><li> Stain cellen tegen extracellulaire moleculen door toevoeging 0,2-0,5 ug van elk geselecteerd antilichaam per 1 x 10 6 cellen in een totaal volume van 100 ul. </li><li> Vortex kort. </li><li> Incubeer de buizen gedurende 15 min in het donker bij 4 ° C. </li><li> Was de cellen met 2 ml PBS + 2% FCS. </li><li> Centrifugeer bij 4 ° C, 320 g gedurende 5 minuten. </li><li> Aspireren supernatant en resuspendeer cellen door het toevoegen, druppelsgewijs, 500 ul koude BD Cytoperm / Cytofix terwijl vortexen. </li><li> Incubeer de buizen gedurende 40 min bij 4 ° C in het donker. </li><li> Vortex kort. </li><li> Was tweemaal de cellen met 1 ml koude BD Perm / Wash Buffer en draaien op 800 xg gedurende 7 minuten bij 4 ° C. </li><li> Aspireren supernatant behalve voor 300 pl. </li><li> Stain cellen intracellulair doortoevoeging van 1 ug van elk geselecteerd antilichaam per 1 x 10 6 cellen in een totaal volume van 100 ul. </li><li> Vortex kort. </li><li> Incubeer gedurende 30 min in het donker bij 4 ° C. </li><li> Was tweemaal de cellen met 1 ml koude BD Perm / Wash Buffer en draaien op 800 xg gedurende 7 minuten bij 4 ° C. </li><li> Aspireren supernatant en resuspendeer cellen door toevoeging van 300 ul koud BD Perm / Wash Buffer. </li><li> Vortex kort. </li><li> Spoel de suspensie tijdens het filteren op FACS buizen. </li><li> Houd de tubes in een donkere en koude omgeving tot analyse. </li></ol>

<ol><li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cells+down-regulate+inflammation-driven+alveolar+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).</li>
<li>Listgarten, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).</li>
<li>Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causation+and+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontol%22%5BJournal%5D)">Causation and pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontol. 25, 8-20 (2000).</li>
<li>Jotwani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+dendritic+cells+infiltrate+the+T+cell-rich+region+of+oral+mucosa+in+chronic+periodontitis%3A+in+situ%2C+in+vivo%2C+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies.</a> J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).</li>
<li>Graves, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+antagonists+inhibit+the+progression+of+inflammatory+cell+infiltration+toward+alveolar+bone+in+experimental+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis.</a> J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).</li>
<li>Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+chemokine+%28MCP-1%2C+MIP-1alpha%2C+MIP-1beta%2C+IP-10%2C+RANTES%29-positive+cells+and+chemokine+receptor+%28CCR5%2C+CXCR3%29-positive+cells+in+inflamed+human+gingival+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues.</a> Cytokine. 20, 70-77 (2002).</li>
<li>Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cell+dynamics+in+human+gingiva+during+experimentally+induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Buccale%22%5BJournal%5D)">Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation.</a> J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).</li>
<li>Cochran, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+bone+loss+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and bone loss in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).</li>
<li>Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response%3A+the+key+to+bone+resorption+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).</li>
<li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Maxilla gingivale weefsel van een enkele muis voldoende voor het analyseren van subpopulaties van T-en B-lymfocyten, evenals hun vermogen om extracellulaire en intracellulaire moleculen uitdrukken zoals we eerder beschreven 1. Niettemin, als zeldzame celpopulaties zijn van belang (bijvoorbeeld DC&#39;s), is het raadzaam om zwembad weefsels 2-3 muizen. Of: bij voorkeur is het mogelijk om zowel de schil en palatale tandvleesweefsels en vervolgens Snijd de gingiva (een modificatie van stap 1.8-1.9). Ook moet wor...

Gingiva het zachte weefsel rond de cervicale gedeelte van de tanden en de alveolaire werkwijze omvat (figuur 1). De gingiva is een soort kauw slijmvlies dat verder kan worden gescheiden in mucosale epitheel en bindweefsel (ook bekend als submucosa of lamina propria). De anatomische structuur van het tandvlees en de aangrenzende tanden laat bacteriën om plaque (biofilm) die voortdurend uitdaagt het lokale immuunsysteem verblijven en te ontwikkelen. Daardoor ontstekingsreactie ontstaat in de gingiva, die onder bepaalde omstandigheden wordt destructief - een voorwaarde genoemd parodontitis 2. In principe kan plaque-geïnduceerde parodontale aandoeningen worden verdeeld in gingivitis en periodontitis. Gingivitis is een reversibele aandoening lokale ontstekingsreactie die wordt beperkt tot de gingiva. Parodontitis, anderzijds, is een onomkeerbaar vernietigingsproces waarbij het bevestigingsinstrument (alveolaire bot, periodontaleligament, cement en tandvlees) wordt vernietigd 3. De gingiva werd voorgesteld om zowel als effector en inductieve locaties serveren tijdens parodontale aandoeningen 4. Menselijke studies hebben gesuggereerd dat in reactie op tandplaque, immune effector cellen en moleculen dynamisch geïnfiltreerd of vertrek van het tandvlees 5-7. Deze activiteit bleek een belangrijke rol spelen bij parodontitis 8,9. Overwegende dat de gegevens die zijn gegenereerd door deze studies leverden waardevolle informatie met betrekking tot dit pathologisch proces, het werken met menselijke weefsels bezitten belangrijke ethische, technische en experimentele beperkingen. De ontwikkeling van experimentele modellen toegestaan ​​oorzaak-gevolg experimenten via het gebruik van transgene muizen en in vivo interventies 10. Daardoor kennis over de bij parodontitis mechanismen aanzienlijk gedurende de laatste twee decennia. Toch, vanwege de complexiteit van parodontitis, iseen lopende discussie over de aard van de lokale immuunrespons faciliteren weefseldestructie. Er is ook een gebrek aan inzicht in de functie van de centrale immuuncellen in de gingiva tijdens parodontale ziekten. Het is dus essentieel om pathologische inflammatoire gebeurtenissen in het doelweefsel van de ziekte, de gingiva bestuderen.

<table><tbody><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>CLS-2</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E6758-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum </td><td>Biological Industries</td><td>04-121-1</td><td>Heat Inactivated</td></tr><tr><td>Vacuum-Driven Filter</td><td>Jet Biofil</td><td>FPE-204-500</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 70 &mu;m</td><td>SPL Lifesciences</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish 35×10 mm</td><td>NUNC</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c antibody</td><td>Biolegend</td><td>117305</td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45.2 antibody</td><td>Biolegend</td><td>109819</td><td>Clone 104</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD4 antibody</td><td>Biolegend</td><td>100413</td><td>Clone GK1.5</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8a antibody</td><td>Biolegend</td><td>100733</td><td>Clone 53-6.7</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 antibody</td><td>Biolegend</td><td>100214</td><td>Clone 17A2</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody</td><td>Biolegend</td><td>118219</td><td>Clone G8.8</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody</td><td>Imgenex</td><td>DDX0362D</td><td>Clone 929F3.01</td></tr><tr><td>Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody</td><td>Biolegend</td><td>115010</td><td>Clone 39-10-8</td></tr><tr><td>LSR II Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v 7.6.5</td><td>Tree Star</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie, verwerking en analyse van muriene gingival cells

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

We hebben een techniek nauwkeurig isoleren en te verwerken murine gingivale weefsel voor flowcytometrie en moleculaire studies ontwikkeld. Het tandvlees is een unieke en belangrijke weefsels te immuun mechanismen te bestuderen omdat het betrokken is bij gastheer immuunreactie tegen orale biofilm die parodontale aandoeningen kunnen veroorzaken. Bovendien maakt het mogelijk de nabijheid van het tandvlees te alveolaire botweefsel ook het bestuderen botremodellering onder inflammatoire aandoeningen. Onze methode levert grote hoeveelheid afweercellen dat de analyse van zelfs zeldzame celpopulaties zoals Langerhans cellen en regulatoire T-cellen mogelijk maakt zoals we aangetoond eerder 1. Gebruikmakend muizen plaatselijke immune responsen betrokken alveolair botverlies bij periodontale ziekten te bestuderen is voordelig vanwege de beschikbaarheid van verschillende immunologische en experimentele instrumenten. Omdat echter de kleine omvang en de relatief lastig toegang tot de murine gingiva, vele studies vermeden onderzoek this kritische weefsel. De methode in dit werk beschreven kon tandvlees analyse, die hopelijk zal toenemen onze understatement op de mondelinge immuunsysteem en de rol daarvan bij parodontale aandoeningen te vergemakkelijken.

Voorbeelden van flowcytometrie analyse van gingivale cellen worden gepresenteerd. Gingivale cellen samengevoegd uit 2 muizen werden uitgevoerd in een LSR II flowcytometer en geanalyseerd met behulp van FlowJo software. Figuur 3A aangetoond dat de verdeling van de gingivale cellen uit naïeve muizen in een zijwaartse verstrooiing (SSC) versus voorwaartse verstrooiing (FSC) plot. Gating strategie te bepalen (i) lymfocyten (ii) monocyten / dendritische cellen en (iii) granulocyten aangegeven. Ter vergelijki...

Deze studie beschrijft een efficiënte techniek voor het isoleren en verwerken tandvleesweefsels van de muis mondholte om een-celkweek produceren. De resulterende cellen kunnen verder worden gebruikt voor flowcytometrie-analyse en moleculaire studies.

Isolatie, verwerking en analyse van Muriene Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Het algemene doel van deze procedure is om het mirin-gingiva nauwkeurig te isoleren en te verwerken voor verdere flowcytometrie-analyse. Dit wordt bereikt door eerst het gingiva op zorgvuldige wijze chirurgisch te isoleren. Vervolgens wordt het uitgesneden weefsel verwerkt om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen.Vervolgens wordt de extracellulaire en intracellulaire kleuring met antilichamen uitgevoerd. Tot slot wordt het monster geanalyseerd via flowcytometrie. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die via flowcytometrische analyse verschillende celpopulaties in het tandvlees en cellulaire veranderingen in het weefsel tonen na blootstelling aan een immunologische prikkel.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals in de OC-chemie of bij mono-fluorescentie, is dat het een snelle en eenvoudige methode is om een groot aantal cellen te analyseren, wat gelijktijdige analyse van meerdere variabelen mogelijk maakt, evenals het sorteren van verschillende celtypen voor verdere experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de immunologie, zoals de manier waarop micro-organismen de gingivale homeostase beïnvloeden en hoe dit verband houdt met ontsteking-geïnduceerd botverlies in een experimenteel model van parodontitis. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we ons begonnen te richten op de rol van de RI-cellen tijdens parodontitis. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de GVA-acceleratietechniek moeilijk aan te leren is vanwege de kleine omvang en de relatief lastige toegang tot de MU one J gva.Begin met het voorbereiden van de mediumoplossingen en de gesteriliseerde chirurgische instrumenten volgens het tekstprotocol. Nadat een muis is geëuthanaseerd, volgens de goedgekeurde methoden van de commissie voor dierproeven van uw instelling, gebruikt u scherpe, stompe rechte scharen om beide zijden van de mondholte open te knippen, inclusief de wangen en de ramus van de onderkaak, en trek de onderkaak naar beneden door de scharen loodrecht op het vlak van het gehemeltebot te richten. Snijd de weke en harde weefsels door in een denkbeeldige lijn, één millimeter achter de derde molaren.Maak vervolgens een incisie in het zachte en harde weefsel, twee millimeter achter de snijtanden. Trek daarna het voorste gedeelte van de mond naar beneden om de neusholte bloot te leggen, waarbij de schaar parallel aan het gehemelte wordt gehouden. Plaats één bloedstelper in de neusholte en gebruik de andere om een incisie bij het vestibulum te maken, snijdend richting de posterieure incisie.Herhaal de incisie aan de andere zijde van de maxilla om deze los te maken van de schedel. Snijd deze vervolgens in het midden door en trim het palatinale weefsel van elke hemi-maxilla om het alveolaire bot bloot te leggen met behulp van scharen en pincetten. Pel het gingivale weefsel van de anterieure rand en plaats dit in een plaat met PBS en 2% foetaal kalfsserum of FCS; om het tandvlees verder te verwerken, wordt het overgebracht naar een kweekschaal met één milliliter PBS, twee milligram per milliliter collagenase type twee en één milligram per milliliter DNase.Snijd het weefsel in met een steriel chirurgisch mesje nr. 15. Hak het weefsel goed fijn voordat het naar een conische reageerbuis van 15 milliliter wordt overgebracht. Was eventuele resterende weefselcellen van de plaat met één milliliter P-B-S-F-C-S en breng dit over naar de buis.Incubeer het weefsel in een voorverwarmde schudincubator bij 37 °C en 200 RPM gedurende 20 minuten. Voeg vervolgens 20 µL 0,5 M EDTA toe en incubeer nogmaals 10 minuten. Voeg daarna PBS-FBS toe tot een volume van 12 mL en centrifugeer het monster bij 4 °C, 400 ×g gedurende acht minuten.Nadat het supernatant is verwijderd, worden de cellen gesuspendeerd in twee milliliters PBS-FCS. Filtreer het monster door een cellenzeef van 70 micron en centrifugeer het filtraat bij vier degrees Celsius en 320 ×g gedurende vijf minuten. Resuspendeer de cellen in 300 microliters PBS-FCS.Tel ten slotte de cellen in een totaalvolume van 100 µL, terwijl u werkt onder een zu%)kast bij een lage temperatuur en met gedoofde lichten; voeg 0,2 tot 0,5 µg van elke geselecteerde antistof toe per 1 × 10⁶ cellen en vortex kort. Na incubatie van de monsters gedurende 15 minuten in het donker bij 4 °C, voegt u 2 mL PBS-FBS toe en centrifugeert u 5 minuten bij 320 ×g en 4 °C. Om de cellen te fixeren, aspireert u het supernatant en resuspendeert u deze vervolgens door onder vortexen druppelsgewijs 500 µL koude BD CytoPerms toe te voegen.Voor de cyto-effecten worden de buisjes 40 minuten bij 4 °C in het donker geïncubeerd, gevolgd door vortexen. Voeg vervolgens kort één ml BD perm wash-buffer toe en centrifugeer 7 minuten bij 800 ×g bij 4 °C. Aspireer na herhaling van de wasstap alle vloeistof, behalve 300 µL van de wasbuffer.Om de cellen vervolgens intracellulair te kleuren in een totaalvolume van 100 µL, voegt u per 1 × 10⁶ cellen één µg van elk geselecteerd antilichaam toe. Vortex kort en incubeer 30 minuten in het donker. Nadat de cellen tweemaal zoals voorheen zijn gewassen en al het supernatant is verwijderd, resuspendeert u de cellen in 300 µL verse koude BD perm wash buffer.Filter na een kortstondig vortexen de suspensie in fax-buisjes. Bewaar de buisjes op ijs of in de koelkast in het donker tot de fax-analyse wordt uitgevoerd. Gingivale cellen gepoold van twee naïeve muizen.De metingen werden uitgevoerd in een LSR two flowcytometer en geanalyseerd met FlowJo-software. De hier getoonde side scatter- en forward scatter-plots illustreren de celdistributie. De gating-strategie voor de identificatie van lymfocyten, monocyten, dendritische cellen en granulocyten is ter vergelijking aangegeven.Deze figuur toont een FACS-plot die gingivale cellen illustreert, gezuiverd uit P. gingivalis-geïnfecteerde muizen 21 dagen na orale toediening in een model van experimentele parodontitis. Een toename in de verschillende immuuncelpopulaties kan eenvoudig worden gedetecteerd in de geïnfecteerde muizen in vergelijking met de hier getoonde naïeve muizen. Immuuncellen in het bewerkte tandvlees worden geïdentificeerd door selectie (gating) op cellen die de hematopoëtische marker CD 45 tot expressie brengen.Deze cellen werden verder gesegregeerd in CD3-positieve T-cellen, zoals weergegeven in deze figuur. Neutrofielen werden eveneens geïdentificeerd op basis van de expressie van de Ly6G- en CD11b-moleculen. Tot slot werden Langersthanscellen en een epitheliale subset van dendritische cellen geïdentificeerd door gating op MHC-klasse II-positieve CD11c-positieve cellen en expressie van EPAM en RIN CD207. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in drie en een halve tot vijf uur worden voltooid, mits deze procedure correct wordt uitgevoerd.Andere methoden, zoals real-time PCR, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals genexpressie in individuele cellen na de ontwikkeling. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de immunologie om de lokale respons in de G GVA tegen elke vorm van schade binnen het parodontale onderzoek te verkennen. Deze techniek stelde ons in staat om de rol van immuun- en niet-immuuncellen van de G GVA in de pathogenese van experimentele periodontitis te verduidelijken.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u urine-GVA's kunt isoleren en verwerken om een single-cell suspensie te verkrijgen, die vervolgens zal worden onderworpen aan een extra- en intracellulaire vir-kleuring voor analyse via flowcytometrie.

isolation-processing-and-analysis-of-murine-gingival-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een geoptimaliseerde protocol voor de isolatie van stamcellen van de muis speekselklier wordt beschreven. De methode maakt gebruik van enzymatische en mechanische spijsvertering, en laat de isolatie van salispheres met cellen met kenmerken van stamcellen.

Isolatie van Mouse speekselklier Stem Cells

This video demonstrates the isolation procedure of the gingival immune cell network from a mouse model. The enzymatic digestion releases the gingival tissue from the attached teeth and bone, which is further mechanically digested, releasing immune cells from the gingiva. The isolated cells are ready for immunological experiments.

Isolation of Gingival Immune Cell Network from Murine Teeth Blocks

We hebben een techniek ontwikkeld voor de isolatie, karakterisatie fenotypische en functionele analyse van immuuncellen van muizen gingiva vastgesteld.

Isolatie, karakterisering en functionele onderzoek van het tandvlees Immune Cell Network

Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.

Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

Inspanningen om microglial functie in detail te begrijpen hebben belemmerd door het ontbreken van microglial cultuur modellen die de eigenschappen van volwassen in vivo microglia recapituleren. Dit protocol beschrijft een aanpak van het isolement en cultuur ontworpen om robuust voortbestaan van zeer vertakte volwassen rat microglia voorwaarden gedefinieerd-medium.

Isolatie en cultuur van knaagdier Microglia ter bevordering van een dynamische vertakt morfologie in serumvrij Medium

Dit protocol beschrijft de voorbijgaande genetische manipulatie van tandheelkundige stamcellen gewonnen uit de menselijke tandheelkundige follikel. De toegepaste niet-virale wijziging strategie kan een basis voor de verbetering van de cel van de stam van de therapeutische producten geworden.

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

De traanklier (LG) heeft twee soorten cellen uitdrukken α-Smooth spier actine (αSMA): Myo cellen (MECs) en pericyten. MECs zijn van ectodermale oorsprong, gevonden in vele klier weefsels, terwijl pericyten zijn vasculaire gladde spiercellen van endodermal oorsprong. Dit protocol isoleert MECs en pericyten van muizen LGs.

Isolatie van Myo cellen van volwassen muizen traan en submandibulaire klieren

Hier presenteren we een protocol voor in vitro isolatie van meerdere gliacelpopulaties van een muis CNS. Deze methode maakt de segregatie van regionale microglia, oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten mogelijk om de fenotypen van elk in verschillende cultuursystemen te bestuderen.

Dissectie en isolatie van Murine Glia uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel

Hier presenteren we een aangepaste methode voor de isolatie en kweek van menselijke gingivale epitheelcellen door de Rock-remmer, Y-27632, toe te voegen aan de traditionele methode. Deze methode is eenvoudiger, minder tijdrovend, verbetert de eigenschappen van stamcellen en produceert grotere aantallen epitheelcellen met een hoog potentieel, zowel voor het laboratorium als voor klinische toepassingen.

Isolatie en cultuur van primaire menselijke gingivale epitheelcellen met behulp van Y-27632

Het huidige protocol presenteert een snelle, efficiënte en zachte methode voor het isoleren van enkele cellen die geschikt zijn voor eencellige RNA-seq-analyse van een continu groeiende muizensnijtand, muizenkies en menselijke tanden.

Snelle isolatie van afzonderlijke cellen van muizen en menselijke tanden

Leer hoe je muizingivacellen isoleert en verwerkt voor flowcytometrie-analyse. Deze methode maakt gedetailleerde studie van celpopulaties en immunologische reacties in orale weefsels mogelijk.

Isolatie, verwerking en analyse van Muriene Gingival Cells

Meer video's verkennen