Versnelde Type 1 diabetes inductie in muizen door adoptieve overdracht van diabetogenische CD4 + T cellen

Het algemene doel van deze procedure is om snel type één diabetes te induceren bij muizen door diabetogeen T-cellen van transgene muizen over te dragen naar muizen, die endogeen t en b-cellen missen. Begin met het verzamelen van de milten en lymfeklieren van de donormuizen en het zuiveren van de CD vier positieve T-cellen. Breng vervolgens adoptief de gezuiverde donor T-cellen over in ontvangende muizen zonder skid.

Bewaak vervolgens de ontvangende muizen op de ontwikkeling van type één diabetes. Uiteindelijk kan dit protocol worden gebruikt om de pathogenese van diabetes te bestuderen en om therapeutische interventies te onderzoeken in vergelijking met andere methoden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek van het overdragen van BDC 2.5, CD vier positieve T-cellen naar ontvangers zonder skid is de snelle en reproduceerbare ontwikkeling van type één diabetes.

Voor donoren van de diabetogeen CD vier positieve T-cellen gebruik zes weken oude pre-diabetische vrouwelijke BDC 2.5 muizen die diabetesvrij zijn bepaald door urine glucose meting. Om de milt en lymfeklieren te verwijderen, week het haar met 70% ethanol, snijd vervolgens de huid, trek de huid terug totdat de spieren van de voorpoten zichtbaar zijn. Nabij de basis van de voorpoten zouden twee lymfeklieren aan elke kant zichtbaar moeten zijn. Grijp voorzichtig elke lymfeklieren met kleine pincetten en verwijder deze door het bindweefsel te trimmen.

Maak vervolgens een snede van één inch in het peritoneum met behulp van de kleine schaar. Grijp nu voorzichtig de milt in het midden. Trim voorzichtig het bindweefsel en het aangehechte vet weg.

Verwijder vervolgens de milt, leg de milten en lymfeklieren in 10 milliliters DMEM op ijs. Druk de lymfeorganen voorzichtig door een celzeef van 70 micrometer met het uiteinde van een steriele 10 milliliter spuitpomp. Om een enkele cel suspensie te verkrijgen.

Spoel elke zeef meerdere keren met één milliliter DMEM om de herstel van cellen te maximaliseren. Breng vervolgens de verzamelde cellen over in een 15 milliliter conische buis en centrifugeer gedurende zeven minuten bij 400 Gs. Bij kamertemperatuur, re-suspendeer het cel pellet in drie milliliter CK-buffer.

Incubeer nu elke kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Om de rode bloedcellen te lye, voeg nu 12 milliliters DMEM toe en pellet de cellen door centrifugatie. Was het cel pellet eenmaal in 10 milliliter DMEM.

Vervolgens suspenderen we de cellen in vijf milliliters fact staining buffer en gebruiken we een fasecontrastmicroscoop en hemo cytometer om het aantal levensvatbare cellen te tellen. Verwijder nu ongeveer een keer 10 van de zes cellen per kleuringscontrole. Bepaal ook de cellen met muis monoclonale antilichamen om voor niet-geactiveerde transgene CD vier positieve T-cellen te sorteren.

Incubeer al die monsters bij vier graden Celsius in het donker gedurende 30 minuten. Was nu de cellen met drie keer het kleurvolume van fax-buffer en re-suspendeer de cellen in fax-buffer één tot twee keer 10 tot de zevende cellen per milliliter voor sorteermonster en 300 microliters voor enkele kleurcontroles. Breng vervolgens het cel monster door een 35 micrometer cel zeef cap tube.

Om celklompjes te verwijderen, verwerk de monsters voor een cel sorter met een getrainde operator. Geef ongeveer drie uur, inclusief opzettijd om ongeveer 1,5 keer 10 tot de achtste totaal transgene naïeve CD vier positieve T-cellen te sorteren. U kunt ongeveer 2,5 keer 10 van de zes cellen per muis verwachten en de sorteer snelheid zal ongeveer twee keer 10 tot de vierde gebeurtenissen per seconde zijn op een instrument zoals de BD Fox Aria. Verzamel de gesorteerd cellen in drie milliliter DMEM.

Noteer het absolute aantal gesorteerd cellen en centrifugeer ze gedurende zeven minuten. Bij 400 Gs, we suspenderen de cel pellets in steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing voor de adoptieve T-cel overdracht. Gebruik een een milliliter spuit in een 18 gauge naald om voorzichtig de fax gezuiverde CD vier positieve T-cellen te re-suspenderen.

Laad de een milliliter spuit vervolgens voorbereiding voor injectie, bevestig een 27 punt halve gauge naald aan de spuit. Beperk de skid ontvangende muizen en veeg hun staart af met 70% ethanol om de injectieplaats te desinfecteren. Injecteer vervolgens een keer 10de van de zes gezuiverde CD vier positieve T-cellen per muis in een van de laterale staar aderen.

Zorg ervoor dat u bij het injecteren in uw staar aderen de plunjer niet dwingt. Als de naald zich daadwerkelijk in de ader bevindt, zou uw injectie moeten plaatsvinden met bijna geen weerstand. Begin vijf dagen na de T-cel overdracht. Bewaak de skid ontvangende muizen dagelijks op de ontwikkeling van type één diabetes.

Meet de urine glucose met behulp van reagens strips volgens de instructies van de fabrikant. Merk op dat muizen met twee opeenvolgende urine glucose metingen van meer dan 250 milligram per deciliter als diabetisch worden beschouwd. In een typisch experiment, levert elke BDC 2.5 donor muis ongeveer twee en een half keer 10 van de zes naïeve transgene CD vier positieve T-cellen na cel sortering. Na adoptieve overdracht van diabetogeen CD vier positieve T-cellen, werden de muizen bewaakt op urine glucose concentraties.

De adoptieve overdracht van kleine aantallen cellen van BDC 2.5 donor muizen induceerde type één diabetes bij alle ontvangende muizen zonder skid tegen dag 11. Wanneer goed uitgevoerd, kan deze techniek in ongeveer acht uur worden gedaan van orgaanoogst tot T-cel overdracht.