Versnelde Type 1 diabetes inductie in muizen door adoptieve overdracht van diabetogenische CD4 + T cellen

Het algemene doel van deze procedure is om snel type 1 diabetes op te wekken bij muizen door diabetogene T-cellen van transgene muizen over te dragen naar muizen die endogene t- en b-cellen missen. Begin met het oogsten van de milt en lymfeklieren van de donormuizen en het zuiveren van de CD4-positieve T-cellen. Breng vervolgens de gezuiverde donor-T-cellen adoptief over naar non-skid recipientmuizen.

Monitor vervolgens de recipientmuizen op de ontwikkeling van diabetes type 1. Uiteindelijk kan dit protocol worden gebruikt om de pathogenese van diabetes te bestuderen en om therapeutische interventies te onderzoeken in vergelijking met andere methoden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek, waarbij BDC 2.5 CD4-positieve T-cellen in non-skid recipienten worden overgebracht, is de snelle en reproduceerbare ontwikkeling van diabetes type 1.

Gebruik voor donoren van de diabetogene CD4+ T-cellen zes weken oude pre-diabetische vrouwelijke BDC 2.5-muizen waarvan via urineglucosemeting is vastgesteld dat ze diabetesvrij zijn. Om de milt en lymfeklieren te verwijderen, wordt de vacht gedrenkt met 70% ethanol; snijd vervolgens de huid open en trek deze terug totdat de spieren van de voorpoten zichtbaar zijn. Nabij de basis van de voorpoten moeten aan weerszijden twee lymfeklieren zichtbaar zijn. Pak elke lymfeklier voorzichtig vast met een kleine pincet en verwijder deze door het bindweefsel weg te snijden.

Maak vervolgens met de kleine schaar een incisie van één inch in het peritoneum. Pak nu voorzichtig de milt in het midden vast. Trim zorgvuldig het bindweefsel en het aanhechtende vet weg.

Verwijder vervolgens de milt en plaats de milten en lymfeklieren in 10 milliliters DMEM op ijs. Druk de lymfoïde organen voorzichtig met de uiteinde van een steriele zuiger van een 10 milliliter spuit door een cellenzeef van 70 micrometer, om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen.

Spoel elke zeef meerdere keren met één milliliter DMEM om het herstel van cellen te maximaliseren. Draag de verzamelde cellen vervolgens over naar een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer deze gedurende zeven minuten bij 400 Gs. Resuspendeer het celpellet bij kamertemperatuur in drie milliliter CK-buffer.

Incubeer het geheel nu vijf minuten bij kamertemperatuur. Om de rode bloedcellen te lyseren, voegt u nu 12 milliliter DMEM toe en pellet u de cellen door centrifugatie. Was de celpellet één keer in 10 milliliter DMEM.

Vervolgens suspenderen we de cellen in vijf milliliter fact-kleuringsbuffer en gebruiken we een fasecontrastmicroscoop en een hemocytometer om het aantal levensvatbare cellen te tellen. Neem nu ongeveer 1 × 10⁶ cellen per kleuringscontrole. Kleur de cellen daarnaast met muis monoklonale antilichamen om te sorteren op niet-geactiveerde transgene CD4-positieve T-cellen.

Incubeer al deze monsters gedurende 30 minuten in het donker bij 4 °C. Was de cellen vervolgens drie keer met een volume FACS-buffer gelijk aan het kleuringsvolume en resuspendeer de cellen in FACS-buffer tot 1 tot 2 × 10⁷ cellen per mL voor het sorteermonster en 300 µL voor de enkelvoudige kleuringscontroles. Haal het cellenmonster daarna door een 35 µm cell strainer cap tube.

Om celklonten te verwijderen, laat de monsters door een getrainde operator verwerken met een cel sorter. Houd rekening met ongeveer drie uur, inclusief opstarttijd, om ongeveer 1,5 × 10⁸ transgene naïeve CD4-positieve T-cellen te sorteren. U kunt ongeveer 2,5 × 10⁶ cellen per muis verwachten en de sorteersnelheid zal ongeveer 2 × 10⁴ events per seconde zijn op een instrument zoals de BD FACSAria. Verzamel de gesorteerde cellen in 3 mL DMEM.

Noteer het absolute aantal gesorteerde cellen en centrifugeer deze zeven minuten lang. Bij 400 Gs suspenderen we de celpellets in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing voor de adoptieve T-celtransfer. Resuspendeer de via FACS gezuiverde CD4-positieve T-cellen voorzichtig met een injectiespuit van één milliliter en een naald van 18 gauge.

Vul de spuit van 1 mL en bevestig ter voorbereiding op de injectie een naald van 27,5 gauge aan de spuit. Fixeer de recipienten van de knot-skid muizen en veeg hun staart af met 70% ethanol om de injectieplaats te desinfecteren. Injecteer vervolgens 1 × 10⁶ gezuiverde CD4-positieve T-cellen per muis in een van de laterale staartvenen.

Zorg er bij het uitvoeren van de staartveninjecties voor dat u de zuiger niet forceert. Als de naald daadwerkelijk in de vene zit, moet de injectie met bijna geen weerstand verlopen. Begin vijf dagen na de T-celtransfer met het dagelijks monitoren van de NOD skid-recipientmuizen op de ontwikkeling van diabetes type 1.

Meet de glucose in de urine met reagensstrips volgens de instructies van de fabrikant. Let op dat muizen met twee opeenvolgende urineglucosewaarden van meer dan 250 mg/dL als diabetisch worden beschouwd. In een typisch experiment levert elke BDC 2.5 donormuis ongeveer 2,5 × 10⁶ naïeve transgene CD4-positieve T-cellen op na cel sortering. Na adoptieve transfer van diabetogene CD4-positieve T-cellen werden de muizen gemonitord op urineglucoseconcentraties.

De adoptieve overdracht van kleine hoeveelheden cellen van BDC 2.5 donor-muizen induceerde tegen dag 11 type 1 diabetes bij alle non-skid ontvangers. Wanneer deze techniek correct wordt uitgevoerd, kan het proces van orgaanwinning tot T-celoverdracht in ongeveer acht uur worden voltooid.