Name: Versnelde Type 1 diabetes inductie in muizen door adoptieve overdracht van diabetogenische CD4 + T cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Leer een snelle methode voor het induceren van type 1 diabetes bij muizen door adoptieve overdracht van diabetogene CD4+ T-cellen. Dit protocol maakt reproduceerbare diabetesontwikkeling binnen twee weken mogelijk voor onderzoek naar pathogenese en therapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Drs. Robert Bonneau en Neil Christensen voor nuttig commentaar. Dit werk werd ondersteund door de Pennsylvania State University College of Medicine fondsen.

1. Isolatie van T-cellen uit milt en lymfeklieren van BDC2.5 Muizen <ol><li> Gebruik 6-weken oude pre-diabetische vrouwelijke BDC2.5 muizen als donoren van diabetogene CD4 + T-cellen. Muizen dienen diabetes-vrij bepaald door urine glucose meting (zie hieronder). </li><li> Euthanaseren elke muis met behulp van CO 2 stikken en verwijder de milt, oksel en brachialis lymfeklieren onder steriele omstandigheden. Om de milt te verwijderen, genieten van de vacht met 70% ethanol, vervolgens gesneden en de huid trekken. De milt is zichtbaar als een donkerrode orgaan aan de linkerzijde van de muis zijn. Voeg een 1-inch incisie in het peritoneum met de kleine schaar en zachtjes greep de milt in het centrum met een paar kleine pincet. Knip voorzichtig het bindweefsel en vastzittend vet zo veel mogelijk en verwijder de milt. </li><li> Verzamel de milt en lymfeklieren in 10 ml Dulbecco&#39;s-gemodificeerd Eagle&#39;s Medium (DMEM) in een 15 ml conische buis op ijs. </li><li> Bereid een enkele celsuspensie met behulp van the einde van een steriele 10 ml spuit zuiger om voorzichtig op de lymfoïde organen bij 70 micrometer cel zeven (een milt per zeef en 4-6 lymfeklieren per zeef) in dezelfde 50 ml conische buis. </li></ol> Tijdens het spoelen elke zeef met 1 ml DMEM maals voor terugwinning van cellen van de zeef te maximaliseren. <ol start="5"><li> Breng de verzamelde cellen van de 50 ml conische buis in een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 300-400 xg gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Om rode bloedcellen te lyseren, gooi het supernatant, resuspendeer de cellen in 5 ml ammonium-chloride-Kalium (ACK) buffer (pH 7,2), en incubeer de ACK-celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 10 ml DMEM aan de ACK-celsuspensie en centrifugeer de buis als hierboven. Was eenmaal de cel pellet in 10 ml DMEM. </li></ol> 2. Fluorescentie-geactiveerde celsortering van diabetogenische CD4 + T-cellen uit muizen BDC2.5 <ol><li> Resuspendeer cellen in 5 ml FACS sbevattende buffer en tel het aantal levensvatbare cellen (met een fasecontrastmicroscoop en een hemocytometer) door trypan blauwe kleurstof uitsluiting. </li><li> Middels FACS buffer, passen de celsuspensie volume tot 5 x 10 7 cellen / ml. Verwijder ~ 1 x 10 6 cellen per kleuring controle (1 geen vlek, 3 enkele vlekken). Stain het monster voor niet-transgene geactiveerde CD4 + T-cellen met anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) en anti-CD62L (PE) monoklonale antilichamen (mAb) in een 15 ml buis. Voer cel kleuring met het mAb concentraties voorgesteld door de fabrikant voor 20-30 min bij 4 ° C in het donker. </li><li> Was het monster en enkele vlek controles met FACS buffer bij&gt; 3x de kleuringsreactie volume. Centrifugeer de buis bij 300-400 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in FACS buffer (1-2 x 10 7 cellen / ml voor het sorteren monster en 300 pl voor enkele vlek controles) en op te slaan op ijs tot de volgende stap. </li><li> Passeren de cel monster door een 35 um celzeefdop tube naar cel klonten te verwijderen. Sorteer de monsters voor CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + cellen op een cel sorter met een getrainde operator. Verzamel de gesorteerde cellen in 3 ml DMEM in een 15 ml buis. Toestaan ​​2,5-3 uur, inclusief voorbereiden, 1,5 x 10 8 cellen (het aantal cellen verkregen van ongeveer 3 donormuizen) sorteren op een soort van 2 x 10 4 totaal events / sec. Verwacht ~ 2,5 x 10 6 non-transgene geactiveerde CD4 + T-cellen per muis na celsortering. </li><li> Noteer het absolute aantal gesorteerde cellen aan het eind van het soort en centrifugeer ze gedurende 7 minuten bij 300-400 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen (2 x 10 6 cellen / ml) in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (Mg 2 + / Ca2 + vrij) voor adoptieve T celoverdracht. </li></ol> 3. Adoptieve overdracht van diabetogene CD4 + T-cellen uit BDC2.5 Muizen <ol><li> Met behulp van een 1 ml spuit en een 18-1 ½ gauge naald, voorzichtig resuspendeer de FACS-gezuiverde CD4 +T-cellen en laadt de 1 ml spuit. Ter voorbereiding voor injectie, vervang dan de 18-1 ½ gauge naald met een 27 ½ gauge naald. </li><li> Expose 6-8 weken oude vrouwelijke NOD.scid ontvangende muizen een warmtelamp totdat ze vertonen poetsgedrag. </li><li> Beperken ontvangende muizen in weerhouder en veeg de staart met 70% (v / v) ethanol op de injectieplaats te desinfecteren. </li><li> Injecteer 1-2 x 10 6 FACS gesorteerde cellen / muis (in maximaal 500 ul PBS) in een van de laterale staart aderen. </li></ol> Forceer de zuiger. Als de naald op de juiste wijze in de ader, zal de injectie plaatsvinden met bijna geen weerstand. 4. Monitoring Ontvanger muizen voor Hyperglykemie en T1D <ol><li> Beginnend vijf dagen na T celoverdracht worden NOD.scid ontvangende muizen dagelijks bekeken op verhoogde urine glucose met reagens strips (Bayer Diastix) volgens de instructies van de fabrikant. Muizen met twee opeenvolgende urine glucosewaarden&gt; 250 mg / dl worden beschouwd diabetes. </li></ol>

<ol><li>Makino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+of+a+non-obese%2C+diabetic+strain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice.</a> Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).</li>
<li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+etiology%2C+immunology%2C+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).</li>
<li>Delovitch, T. L., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic+mouse+as+a+model+of+autoimmune+diabetes%3A+immune+dysregulation+gets+the+NOD%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD.</a> Immunity. 7, 727-738 (1997).</li>
<li>Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+autoimmune+diabetes+mellitus+with+splenocytes+from+nonobese+diabetic+%28NOD%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice.</a> Diabetes. 35, 855-860 (1986).</li>
<li>Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syngeneic+transfer+of+autoimmune+diabetes+from+diabetic+NOD+mice+to+healthy+neonates.+Requirement+for+both+L3T4%2B+and+Lyt-2%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells.</a> J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).</li>
<li>Haskins, K., McDuffie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+diabetes+in+young+NOD+mice+with+a+CD4%2B+islet-specific+T+cell+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone.</a> Science. 249, 1433-1436 (1990).</li>
<li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid%2Fscid+mice.+Relative+contributions+of+CD4%2B+and+CD8%2B+T-cells+from+diabetic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy-1a+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors.</a> Diabetes. 42, 44-55 (1993).</li>
<li>Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+autoimmune+diabetes+in+the+NOD+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse.</a> Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).</li>
<li>Serreze, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I-mediated+antigen+presentation+and+induction+of+CD8%2B+cytotoxic+T-cell+responses+in+autoimmune+diabetes-prone+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice.</a> Diabetes. 45, 902-908 (1996).</li>
<li>Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+maintenance%2C+and+adoptive+transfer+of+diabetogenic+T-cell+lines%2Fclones+from+the+nonobese+diabetic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse.</a> Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).</li>
<li>Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+cell+apoptosis+in+T+cell-mediated+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).</li>
<li>Amrani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-independent+beta-cell+destruction+by+diabetogenic+CD8%28%2B%29+T+lymphocytes+in+transgenic+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice.</a> J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).</li>
<li>Dobbs, C., Haskins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+T+cell+clone+and+of+T+cells+from+a+TCR+transgenic+mouse%3A+TCR+transgenic+T+cells+specific+for+self-antigen+are+atypical%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical.</a> J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).</li>
<li>Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-lymphocyte+clone+specific+for+pancreatic+islet+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen.</a> Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).</li>
<li>Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+a+diabetogenic+T+cell+from+genesis+through+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis.</a> Cell. 74, 1089-1100 (1993).</li>
<li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromogranin+A+is+an+autoantigen+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes.</a> Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).</li>
<li>Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinpointing+when+T+cell+costimulatory+receptor+CTLA-4+must+be+engaged+to+dampen+diabetogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-dependent+regulatory+circuits+in+immune+inflammation+highlighted+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes.</a> J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+defects+in+innate+and+adaptive+immunologic+function+in+NOD%2FLtSz-scid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice.</a> J. Immunol. 154, 180-191 (1995).</li>
<li>Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autoimmune+diabetes+locus+Idd9+regulates+development+of+type+1+diabetes+by+affecting+the+homing+of+islet-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells.</a> J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).</li>
<li>Verdaguer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+autoimmune+diabetes+in+monoclonal+T+cell+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice.</a> J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).</li>
<li>Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+early+age-related+increase+in+the+frequency+of+CD4%2B+Foxp3%2B+cells+in+BDC2.5NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice.</a> Immunology. 121, 565-576 (2007).</li>
<li>Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic+scid+mouse%3A+model+for+spontaneous+thymomagenesis+associated+with+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).</li>
</ol>

Alle muizen werden gehuisvest in het Penn State College of Medicine specifieke pathogeen-vrije (SPF)-faciliteit in overeenstemming met de richtlijnen van de Penn State Institutional Animal Care en gebruik Comite. De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

T1D kan worden geïnduceerd in ontvangende muizen met verschillende efficiëntie van adoptieve overdracht van gehele miltcellen of T-cel subsets van diabetische NOD muizen of muizen die transgeen zijn voor TCR afgeleid van diabetogenic T-celklonen. Wij rapporteren hier een reproduceerbare werkwijze voor het induceren T1D in ontvangende muizen binnen twee weken bij 100% incidentie van overdracht FACS-gezuiverde CD62L + BDC2.5 transgene CD4 + T cellen in NOD.scid-muizen. Specifieke voordelen van...

De NOD muis ontwikkelt auto-immune diabetes spontaan en is op grote schaal gebruikt als diermodel voor menselijke T1D 1,2. Pathogenese van type 1 in NOD muizen gekenmerkt door infiltratie, beginnend op 3-4 weken oud, van de pancreatische eilandjes van Langerhans door dendritische cellen en macrofagen, gevolgd door T-en B-cellen. Deze fase van niet-destructieve peri-insulitis leidt tot een langzame, progressieve vernietiging van insuline-producerende pancreatische β cellen, resulterend manifeste diabetes wordt 4-6 maanden 3. Overdracht van splenocyten 4,5, 6,7 of CD4 + CD8 + T-cellen van 8,9 diabetische NOD muizen is aangetoond dat diabetes bemiddelen in immuungecompromitteerde NOD muizen, wat aangeeft dat eilandje-reactieve T-cellen spelen een centrale rol in T1D pathogenese. Afhankelijk van de experimentele omstandigheden, diabetes ontwikkeld in ontvangende muizen langzaam gedurende een aantal weken in deze studies. Ook verschillende T cel klonen, verkregen door tijdrovende en durekweken van diabetogene T-cellen, is gemeld diabetes mediëren enkele weken na overdracht ontvangende muizen 7,10. Met de beschikbaarheid van transgene muizen die TCR afgeleid van CD4-of CD8-diabetogenic beperkte T-celklonen, verschillende laboratoria hebben aangetoond dat vervolgens milt T-cellen van dergelijke muizen konden diabetes dragen aan ontvangers 11-13. Specifiek, BDC2.5 NOD muizen transgeen voor BDC2.5 TCR, die specifiek is voor chromogranine A, een eiwit in pancreatische bètacellen 14-16. Overdracht van in vitro-geactiveerde of niet-geactiveerde geheel of gefractioneerde miltcellen van openlijk diabetes of prediabetes BDC2.5 muizen overgebracht diabetes te neonatale of immunodeficiënte NOD muizen op verschillende efficiëntie 11,17-19. We beschrijven een eenvoudige methode die gezuiverd transgene CD4 + T-cellen maakt gebruik van pre-diabetische BDC2.5 muizen te induceren T1D in de ontvangende muizen op een hoog rendement en consistentie. Grote aantallen naïeve eilandje antigeen-specifieke CD4 + T-cellen geïsoleerd uit deze muizen door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) voor CD4 + CD62L + T cellen die het transgene TCR Vβ4 keten. Gezuiverd transgene T-cellen worden vervolgens overgedragen zonder activering in NOD.scid muizen, die functioneel T en B cellen missen en zijn insulitis-en diabetes-vrij 20. De ontvangende muizen worden gecontroleerd op verhoogde concentraties van urine glucose aangegeven T1D die snel ontwikkelt zich binnen twee weken na T celoverdracht. In tegenstelling tot andere methoden overdragen diabetogenic T-cellen met heterogene specificiteiten ons protocol gebruikt FACS-gesorteerd CD4 + T-cellen die bijna uitsluitend de expressie diabetogenic BDC2.5 TCR. Door hun homogeniteit, slechts kleine aantallen overgedragen T-cellen (~ 1x10 6 cellen / muis) nodig voor een snelle ontwikkeling T1D binnen 2 weken 100% incidentie. Een ander voordeel van ons protocol is dat DOORSTRALI GSIn van ontvangende muizen is niet nodig omdat voor een aantal andere methoden. Een mogelijke beperking van deze methode is dat het niet het onderzoek naar de bijdrage van zowel CD4 en CD8 T-cel subsets of specifieke CD8 T-cellen in diabetes mogelijk. De beschreven protocol handig voor het bestuderen T1D snelle ontwikkeling, gemedieerd door naïeve, mono-specifiek CD4 + T-cellen, alsook therapeutische strategieën voor interventie in homing van eilandjescellen antigeenspecifieke Th cellen het doelwitorgaan worden.

<table><tbody><tr><td>BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(Tcr&alpha;BDC 2.5, Tcr&#946;BDC 2.5)</td><td>JAX</td><td>004460</td><td></td></tr><tr><td>NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J)</td><td>JAX</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Themo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Bayer Diastix</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM2803</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conische buizen</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conische buizen</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Steriele chirurgische pincetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele kleine schaar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele grote schaar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m celstrainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu;m celstrainer kapbuizen</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer</td><td></td><td></td><td>0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O</td></tr><tr><td>BD FACSFlowTM omhulsel vloeistof</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACS kleuring buffer</td><td></td><td></td><td>PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter gesteriliseerd</td></tr><tr><td>Phasecontrastmicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blauw</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (APC) mAb</td><td>Biolegend</td><td>1005616</td><td>clone RM4-5</td></tr><tr><td>Anti-TCR V&#946;4 (FITC) mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>553365</td><td>clone KT4</td></tr><tr><td>Anti-CD62L (PE) mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>553151</td><td>clone MEL-14</td></tr><tr><td>Celsorteerder</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>bijv. BD FACSAria III</td></tr><tr><td>Warmtelamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muis vasthoudapparaat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml spuiten</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>18-1&frac12; gauge naalden (sterieel)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12; gauge naalden (sterieel)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr></tbody></table>

versnelde type 1 diabetes inductie in muizen door adoptieve overdracht van diabetogenische cd4 + t cellen

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

De nonobese diabetische (NOD) muis ontwikkelt spontaan auto-immune diabetes na 12 weken oud en is de meest uitgebreid bestudeerde diermodel voor menselijke type 1 diabetes (T1D). Celoverdracht studies in bestraalde ontvanger muizen hebben aangetoond dat T-cellen zijn cruciaal bij T1D pathogenese in dit model. We beschrijven hier een eenvoudige methode om snel induceren T1D door adoptieve overdracht van gezuiverde primaire CD4 + T-cellen van pre-diabetische NOD muizen transgeen voor het eilandje T cel receptor (TCR) BDC2.5 in NOD.scid ontvangende muizen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat isolatie en adoptieve overdracht van diabetogene T-cellen kan worden voltooid binnen dezelfde dag, wordt bestraling van de ontvangers niet vereist, en een hoge incidentie van type 1 wordt opgewekt binnen 2 weken na de T-cel-overdracht. Aldus kan studies pathogenese en therapeutische interventies bij T1D plaatsvinden bij een hogere snelheid dan bij werkwijzen die berusten op heterogene T cel populaties of klonenafgeleid van diabetische NOD muizen.

Onze resultaten tonen aan de isolatie van transgene BDC2.5 cellen die CD62L, wat essentieel is voor T-cellen naar huis om secundaire lymfoïde organen, zoals lymfklieren. Onze bevindingen tonen verder de krachtige mogelijkheden van deze monospecifieke T-cel populatie snel overbrengen en efficiënt T1D tot NOD.scid ontvangende muizen. Isolatie van diabetogenic CD4 + T-cellen uit muizen BDC2.5 wordt getoond in figuur 2. Ongeveer 5 x 10 7 cellen uit gepoold milt en lym...

Wij een reproduceerbare werkwijze voor type 1 diabetes (T1D) bij de muis binnen twee weken adoptieve overdracht van eilandjescellen antigeen-specifieke primaire CD4 + T-cellen.

Versnelde Type 1 diabetes inductie in muizen door adoptieve overdracht van diabetogenische CD4 + T cellen

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Het algemene doel van deze procedure is om snel type 1 diabetes op te wekken bij muizen door diabetogene T-cellen van transgene muizen over te dragen naar muizen die endogene t- en b-cellen missen. Begin met het oogsten van de milt en lymfeklieren van de donormuizen en het zuiveren van de CD4-positieve T-cellen. Breng vervolgens de gezuiverde donor-T-cellen adoptief over naar non-skid recipientmuizen.Monitor vervolgens de recipientmuizen op de ontwikkeling van diabetes type 1. Uiteindelijk kan dit protocol worden gebruikt om de pathogenese van diabetes te bestuderen en om therapeutische interventies te onderzoeken in vergelijking met andere methoden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek, waarbij BDC 2.5 CD4-positieve T-cellen in non-skid recipienten worden overgebracht, is de snelle en reproduceerbare ontwikkeling van diabetes type 1.Gebruik voor donoren van de diabetogene CD4+ T-cellen zes weken oude pre-diabetische vrouwelijke BDC 2.5-muizen waarvan via urineglucosemeting is vastgesteld dat ze diabetesvrij zijn. Om de milt en lymfeklieren te verwijderen, wordt de vacht gedrenkt met 70% ethanol; snijd vervolgens de huid open en trek deze terug totdat de spieren van de voorpoten zichtbaar zijn. Nabij de basis van de voorpoten moeten aan weerszijden twee lymfeklieren zichtbaar zijn. Pak elke lymfeklier voorzichtig vast met een kleine pincet en verwijder deze door het bindweefsel weg te snijden.Maak vervolgens met de kleine schaar een incisie van één inch in het peritoneum. Pak nu voorzichtig de milt in het midden vast. Trim zorgvuldig het bindweefsel en het aanhechtende vet weg.Verwijder vervolgens de milt en plaats de milten en lymfeklieren in 10 milliliters DMEM op ijs. Druk de lymfoïde organen voorzichtig met de uiteinde van een steriele zuiger van een 10 milliliter spuit door een cellenzeef van 70 micrometer, om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen.Spoel elke zeef meerdere keren met één milliliter DMEM om het herstel van cellen te maximaliseren. Draag de verzamelde cellen vervolgens over naar een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer deze gedurende zeven minuten bij 400 Gs. Resuspendeer het celpellet bij kamertemperatuur in drie milliliter CK-buffer.Incubeer het geheel nu vijf minuten bij kamertemperatuur. Om de rode bloedcellen te lyseren, voegt u nu 12 milliliter DMEM toe en pellet u de cellen door centrifugatie. Was de celpellet één keer in 10 milliliter DMEM.Vervolgens suspenderen we de cellen in vijf milliliter fact-kleuringsbuffer en gebruiken we een fasecontrastmicroscoop en een hemocytometer om het aantal levensvatbare cellen te tellen. Neem nu ongeveer 1 × 10⁶ cellen per kleuringscontrole. Kleur de cellen daarnaast met muis monoklonale antilichamen om te sorteren op niet-geactiveerde transgene CD4-positieve T-cellen.Incubeer al deze monsters gedurende 30 minuten in het donker bij 4 °C. Was de cellen vervolgens drie keer met een volume FACS-buffer gelijk aan het kleuringsvolume en resuspendeer de cellen in FACS-buffer tot 1 tot 2 × 10⁷ cellen per mL voor het sorteermonster en 300 µL voor de enkelvoudige kleuringscontroles. Haal het cellenmonster daarna door een 35 µm cell strainer cap tube.Om celklonten te verwijderen, laat de monsters door een getrainde operator verwerken met een cel sorter. Houd rekening met ongeveer drie uur, inclusief opstarttijd, om ongeveer 1,5 × 10⁸ transgene naïeve CD4-positieve T-cellen te sorteren. U kunt ongeveer 2,5 × 10⁶ cellen per muis verwachten en de sorteersnelheid zal ongeveer 2 × 10⁴ events per seconde zijn op een instrument zoals de BD FACSAria. Verzamel de gesorteerde cellen in 3 mL DMEM.Noteer het absolute aantal gesorteerde cellen en centrifugeer deze zeven minuten lang. Bij 400 Gs suspenderen we de celpellets in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing voor de adoptieve T-celtransfer. Resuspendeer de via FACS gezuiverde CD4-positieve T-cellen voorzichtig met een injectiespuit van één milliliter en een naald van 18 gauge.Vul de spuit van 1 mL en bevestig ter voorbereiding op de injectie een naald van 27,5 gauge aan de spuit. Fixeer de recipienten van de knot-skid muizen en veeg hun staart af met 70% ethanol om de injectieplaats te desinfecteren. Injecteer vervolgens 1 × 10⁶ gezuiverde CD4-positieve T-cellen per muis in een van de laterale staartvenen.Zorg er bij het uitvoeren van de staartveninjecties voor dat u de zuiger niet forceert. Als de naald daadwerkelijk in de vene zit, moet de injectie met bijna geen weerstand verlopen. Begin vijf dagen na de T-celtransfer met het dagelijks monitoren van de NOD skid-recipientmuizen op de ontwikkeling van diabetes type 1.Meet de glucose in de urine met reagensstrips volgens de instructies van de fabrikant. Let op dat muizen met twee opeenvolgende urineglucosewaarden van meer dan 250 mg/dL als diabetisch worden beschouwd. In een typisch experiment levert elke BDC 2.5 donormuis ongeveer 2,5 × 10⁶ naïeve transgene CD4-positieve T-cellen op na cel sortering. Na adoptieve transfer van diabetogene CD4-positieve T-cellen werden de muizen gemonitord op urineglucoseconcentraties.De adoptieve overdracht van kleine hoeveelheden cellen van BDC 2.5 donor-muizen induceerde tegen dag 11 type 1 diabetes bij alle non-skid ontvangers. Wanneer deze techniek correct wordt uitgevoerd, kan het proces van orgaanwinning tot T-celoverdracht in ongeveer acht uur worden voltooid.

accelerated-type-1-diabetes-induction-mice-adoptive-transfer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Ons protocol is ontwikkeld om zuiver en eenvoudig eilandjes of cellen te leveren onder de nier capsule van muizen. Cellen zijn geconcentreerd in pellets in de finale slangen worden gebruikt voor het transplanteren van de cellen onder de nier capsule. Het gemak van deze techniek vermindert de belasting van de cellen en de muis.

Transplantatie van pancreaseilandjes Into the Kidney Capsule van diabetische muizen

We beschrijven de lever neo-eilandje formatie in STZ (streptozotocine)-geïnduceerde diabetische muizen door genoverdracht van Neurogenin3 (Ngn3) en betacelluline (BTC) met behulp van helper-afhankelijke adenovirale vector (HDAd) en de omkering van hyperglycemie. Onze methode wordt voordelen van helper-afhankelijke adenovirale vectoren met hun zeer efficiënt in vivo transductie en langdurige genexpressie.

Neo-Islet Vorming in de lever van muizen met diabetes door Helper-afhankelijke adenovirale vector-gemedieerde genoverdracht

This video demonstrates an imaging-based method to visualize transplanted luciferase-expressing beta cells into a non-obese diabetic immunodeficient mouse. The introduction of splenocytes from a diabetic mouse leads to progressive beta cell destruction, visually confirmed by declining luminescence after substrate introduction.

Imaging Transgenic Beta-Cells in an Immunodeficient Mouse Challenged with Diabetic Splenocytes

Hier presenteren we een protocol om colonontsteking bij muizen te induceren door adoptieve overdracht van syngeneïsche CD4+CD45RBhigh T-cellen naar ontvangers zonder T- en B-cellen. Klinische en histopathologische kenmerken bootsen inflammatoire darmziekten bij mensen na. Deze methode maakt de studie van de initiatie van colonontsteking en de progressie van de ziekte mogelijk.

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, en de uitbreiding ervan in vitro, met als doel het opleveren van een hoog aantal functionele T-cellen voor gebruik in vitro en in vivo.

Zeer efficiënte generatie van antigeen-specifieke cytotoxische T-cellen voor de functionele test in een auto-immune diabetes model

In dit protocol wordt een darmmicrobiota-antigeenspecifiek T-cel adoptief transfer colitismodel beschreven. CD4+ T-cellen worden geïsoleerd uit CBir1 TCR transgene muizen. Deze zijn specifiek voor een immunodominant darmmicrobiota-antigeen CBir1 flagellin, dat wordt overgedragen in ontvangende Rag1-/- muizen, wat leidt tot darmontsteking.

Inductie van darmontsteking door adoptieve overdracht van CBir1 TCR transgene CD4 + T-cellen naar immunodeficiënte muizen

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en minimaal invasieve methode voor het transplanteren en afbeelden van NIT-1-cellen in niet-obese diabetische (NOD) -ernstige gecombineerde immunodeficiënte muizen die worden uitgedaagd met splenocyten gezuiverd van spontaan diabetische NOD-muizen.

Bioluminescente monitoring van transplantaatoverleving in een adoptief transfermodel van auto-immuundiabetes bij muizen

Wij bieden een minimaal invasief protocol voor de intramusculaire transplantatie van pancreasstamceleilandjes afkomstig van menselijke stamklieren in immunodeficiënte muizen voor in vivo implantatie en downstream analyse.

Intramusculaire transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide alvleesklierendocriene cellen bij muizen

Cytotoxiciteit assays op natural killer cellen lytische reacties maatregel om de HIV-geïnfecteerde cellen wordt beperkt door de zuiverheid van de doelcellen. Tonen we hier de isolatie van een sterk gezuiverde populatie van HIV-1 geïnfecteerde primaire T-cel ontploffing door gebruik te maken van het vermogen van HIV-1 s tot down-moduleren CD4.

Bereiding en het gebruik van HIV-1 geïnfecteerde primaire CD4 + T-cellen als doelcellen in Natural Killer Cell Cytotoxische Assays

Sommige muizenstammen in staat zijn om de inductie van experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) te weerstaan ​​met myeline basisch eiwit. Hier beschreven is een eenvoudige immunisatieprotocol dat het niet-reageren omkeert en induceert verlammende ziekte in een aantal typische EAE resistent muis vlekken.

Het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) Resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en Antigene Challenge

Leer een snelle methode voor het induceren van type 1 diabetes bij muizen door adoptieve overdracht van diabetogene CD4+ T-cellen. Dit protocol maakt reproduceerbare diabetesontwikkeling binnen twee weken mogelijk voor onderzoek naar pathogenese en therapie.

Versnelde Type 1 diabetes inductie in muizen door adoptieve overdracht van diabetogenische CD4 + T cellen

Meer video's verkennen