Histologisch monstervoorbereiding voor lichtmicroscopie
Histologie is een term die verwijst naar de studie van de microscopische anatomie van weefsels en cellen. Goede histologische monstervoorbereiding voor lichtmicroscopie is essentieel voor het verkrijgen van kwaliteitsresultaten van weefselmonsters.
Er zijn 3 hoofdstappen die gemeenschappelijk zijn voor bijna alle histologische procedures. Eerst wordt het monster gefixeerd om het weefsel te bewaren en weefseldegradatie te vertragen. Vervolgens wordt het monster ondergedompeld in een materiaal, of inbeddingsmedium, dat vergelijkbare mechanische eigenschappen heeft. Eenmaal ingebed, wordt het monster gesneden, of gesneden, in dunne plakjes met behulp van een precies snijinstrument dat bekend staat als een microtoom. Deze video beschrijft deze algemene stappen en enkele van de concepten die daarmee verband houden.
Weefselfixatie is een cruciale stap die cel- en weefselcomponenten behoudt en hun structuur handhaaft. Na celdood worden natuurlijk voorkomende enzymen vrijgelaten uit cellulaire organellen en beginnen ze de eiwitten in de hele cel en extracellulaire matrix af te breken, waardoor de structuur van de cel wordt vernietigd. Fixatie voorkomt een dergelijke afbraak door de vermogen van deze enzymen om eiwitten te verteren direct te remmen en door de splitsingsplaatsen van het enzym onherkenbaar te maken.
De twee belangrijkste mechanismen van fixatie zijn cross-linking en coaguleren. Cross-linking omvat de vorming van covalente bindingen zowel binnen als tussen eiwitten, waardoor het weefsel stijf wordt en daarom beter bestand is tegen afbraak. Coagulatie wordt veroorzaakt door de uitdroging van eiwitten door het gebruik van alcoholen of aceton, die de tertiaire structuur van eiwitten vervormen, zodat hydrofobe, of watervrezende, regio's het eiwitoppervlak verplaatsen. Coagulatieve fixatie kan inbeddingsmedia, zoals paraffinewas, helpen het weefsel te penetreren.
Een van de meest gebruikte fixatieven is Formaline, dat formaldehyde is opgelost in water. Tijdens fixatie hecht formaldehyde zich aan primaire aminen, zoals die op de zijketens van de aminozuren lysine en glutamine, om een stabiele crosslink genaamd een metheelbrug te vormen. Dit proces is inherent traag en kan tot 1-2 dagen duren.
Voorafgaand aan fixatie moeten enkele overwegingen worden gemaakt. Ten eerste, overweeg de diffusie van het monster. Fixatieven zullen zich met een snelheid verspreiden door weefsels die gerelateerd is aan de diffusiecoëfficiënt voor het fixatief vermenigvuldigd met de vierkantswortel van de tijd. Een fixatief dat 1 uur nodig heeft om 1 mm in het monster te penetreren, zal 25 uur nodig hebben om 5 mm te penetreren. Zodra formaline het centrum van het weefsel heeft bereikt, moet de crosslinkingreactie nog plaatsvinden. Daarom moet de monstergrootte worden beperkt tot 4 mm dikte voor een grondige fixatie in een redelijke hoeveelheid tijd.
Ten tweede, overweeg het volume en de pH van het fixatief. De verhouding fixatief tot monstervolume moet ten minste 40:1 zijn, zodat het reagens niet gemakkelijk over tijd wordt uitgeput. Terwijl sommige fixatieven zijn ontworpen om bij een zure pH te werken, werkt formaline het beste wanneer gebufferd met fosfaat om een neutrale pH te behouden, zodat er geen overtollig zuur wordt geproduceerd, wat artefacten in weefsel veroorzaakt.
De volgende stap in de histologische voorbereiding is inbedding, die het ondersteunen van monsters in media omvat die vergelijkbare mechanische stijfheid heeft als het monster zelf. Het kiezen van de juiste inbeddingsmedium is cruciaal, omdat als het te stijf of te zwak is, er defecten kunnen optreden tijdens het snijden. Verreweg het meest gebruikte medium voor inbedding is paraffinewas.
Voorafgaand aan paraffine-inbedding moeten monsters worden gedehydrateerd door het water in het weefsel te vervangen door ethanol, eerst gevolgd door xylenen en vervolgens opgewarmde paraffinewas. Zodra de was het monster heeft geïnfiltreerd, wordt het zorgvuldig gepositioneerd en omgeven met extra was met behulp van een mal om een blok te vormen. Vervolgens worden monsters aan een weefselcassette bevestigd voor het snijden.
Snijden is het proces van het snijden van dunne plakjes van een monster uit een inbeddingsblok. De secties zijn meestal ongeveer 4-10 µm dik voor gebruik met lichtmicroscopie.
Om secties te snijden, wordt eerst een metaal-, glas- of diamantmes bevestigd op een microtoom. Vervolgens wordt het monster in een monsterhouder geplaatst. Vervolgens wordt het monster naar het snijvlak gebracht en over de mes gesleept om een plakje van de gewenste dikte te creëren. Secties zullen zich ophopen als dunne linten die op glazen plaatjes kunnen worden geplaatst.
Na het snijden worden monsters op dia's geplaatst. Voor paraffine-ingebedde monsters worden plakjes eerst in een opgewarmd waterbad geplaatst en vervolgens uit het water op de dia getild en gedroogd.
Biologisch weefsel heeft heel weinig inherent contrast, dus na histologie worden dia's meestal gekleurd met kleurstoffen of antilichamen die morfologie of specifieke eiwitten benadrukken. De meest voorkomende kleurstof die wordt uitgevoerd, is hematoxyline en eosine, of H&E. Omdat het zo gebruikelijk is, zijn er veel geautomatiseerde machines gemaakt om op reproducieerbare wijze talrijke secties met H&E te kleuren. Hematoxyline kleurt de kernen van cellen blauw en eosine kleurt het cytoplasma roze, waardoor de cellulaire morfologie van weefsels wordt onthuld.
Een nadeel van fixatie is dat de cross-linking van eiwitten het moeilijker kan maken voor het labelen van antilichamen om hun bindingsplaatsen te vinden. In plaats van fixatie te gebruiken om monsters te bewaren, kan snel bevriezen van weefsel, of snap-freezing, worden gebruikt, wat gevolgd wordt door een snijtechniek genaamd cryosectioning.
Weefselmonsters worden ingebed en georiënteerd in een speciaal vriesmedium genaamd OCT, of optimal cutting temperature medium en vervolgens snel bevroren. Net als andere inbeddingsmedia, past OCT de stijfheid van het monster.
Een cryomicrotoom of cryostat
Histologie is de studie van cellen en weefsels, die meestal wordt ondersteund door het gebruik van een lichtmicroscoop. De bereiding van histologische…
Histologie is een term die verwijst naar de studie van de microscopische anatomie van weefsels en cellen. Goede histologische monstervoorbereiding voor lichtmicroscopie is essentieel voor het verkrijgen van kwaliteitsresultaten van weefselmonsters.
Er zijn 3 hoofdstappen die gemeenschappelijk zijn voor bijna alle histologische procedures. Eerst wordt het monster gefixeerd om het weefsel te bewaren en weefseldegradatie te vertragen. Vervolgens wordt het monster ondergedompeld in een materiaal, of inbeddingsmedium, dat vergelijkbare mechanische eigenschappen heeft. Eenmaal ingebed, wordt het monster gesneden, of gesneden, in dunne plakjes met behulp van een precies snijinstrument dat bekend staat als een microtoom. Deze video beschrijft deze algemene stappen en enkele van de concepten die daarmee verband houden.
Weefselfixatie is een cruciale stap die cel- en weefselcomponenten behoudt en hun structuur handhaaft. Na celdood worden natuurlijk voorkomende enzymen vrijgelaten uit cellulaire organellen en beginnen ze de eiwitten in de hele cel en extracellulaire matrix af te breken, waardoor de structuur van de cel wordt vernietigd. Fixatie voorkomt een dergelijke afbraak door de vermogen van deze enzymen om eiwitten te verteren direct te remmen en door de splitsingsplaatsen van het enzym onherkenbaar te maken.
De twee belangrijkste mechanismen van fixatie zijn cross-linking en coaguleren. Cross-linking omvat de vorming van covalente bindingen zowel binnen als tussen eiwitten, waardoor het weefsel stijf wordt en daarom beter bestand is tegen afbraak. Coagulatie wordt veroorzaakt door de uitdroging van eiwitten door het gebruik van alcoholen of aceton, die de tertiaire structuur van eiwitten vervormen, zodat hydrofobe, of watervrezende, regio's het eiwitoppervlak verplaatsen. Coagulatieve fixatie kan inbeddingsmedia, zoals paraffinewas, helpen het weefsel te penetreren.
Een van de meest gebruikte fixatieven is Formaline, dat formaldehyde is opgelost in water. Tijdens fixatie hecht formaldehyde zich aan primaire aminen, zoals die op de zijketens van de aminozuren lysine en glutamine, om een stabiele crosslink genaamd een metheelbrug te vormen. Dit proces is inherent traag en kan tot 1-2 dagen duren.
Voorafgaand aan fixatie moeten enkele overwegingen worden gemaakt. Ten eerste, overweeg de diffusie van het monster. Fixatieven zullen zich met een snelheid verspreiden door weefsels die gerelateerd is aan de diffusiecoëfficiënt voor het fixatief vermenigvuldigd met de vierkantswortel van de tijd. Een fixatief dat 1 uur nodig heeft om 1 mm in het monster te penetreren, zal 25 uur nodig hebben om 5 mm te penetreren. Zodra formaline het centrum van het weefsel heeft bereikt, moet de crosslinkingreactie nog plaatsvinden. Daarom moet de monstergrootte worden beperkt tot 4 mm dikte voor een grondige fixatie in een redelijke hoeveelheid tijd.
Ten tweede, overweeg het volume en de pH van het fixatief. De verhouding fixatief tot monstervolume moet ten minste 40:1 zijn, zodat het reagens niet gemakkelijk over tijd wordt uitgeput. Terwijl sommige fixatieven zijn ontworpen om bij een zure pH te werken, werkt formaline het beste wanneer gebufferd met fosfaat om een neutrale pH te behouden, zodat er geen overtollig zuur wordt geproduceerd, wat artefacten in weefsel veroorzaakt.
De volgende stap in de histologische voorbereiding is inbedding, die het ondersteunen van monsters in media omvat die vergelijkbare mechanische stijfheid heeft als het monster zelf. Het kiezen van de juiste inbeddingsmedium is cruciaal, omdat als het te stijf of te zwak is, er defecten kunnen optreden tijdens het snijden. Verreweg het meest gebruikte medium voor inbedding is paraffinewas.
Voorafgaand aan paraffine-inbedding moeten monsters worden gedehydrateerd door het water in het weefsel te vervangen door ethanol, eerst gevolgd door xylenen en vervolgens opgewarmde paraffinewas. Zodra de was het monster heeft geïnfiltreerd, wordt het zorgvuldig gepositioneerd en omgeven met extra was met behulp van een mal om een blok te vormen. Vervolgens worden monsters aan een weefselcassette bevestigd voor het snijden.
Snijden is het proces van het snijden van dunne plakjes van een monster uit een inbeddingsblok. De secties zijn meestal ongeveer 4-10 µm dik voor gebruik met lichtmicroscopie.
Om secties te snijden, wordt eerst een metaal-, glas- of diamantmes bevestigd op een microtoom. Vervolgens wordt het monster in een monsterhouder geplaatst. Vervolgens wordt het monster naar het snijvlak gebracht en over de mes gesleept om een plakje van de gewenste dikte te creëren. Secties zullen zich ophopen als dunne linten die op glazen plaatjes kunnen worden geplaatst.
Na het snijden worden monsters op dia's geplaatst. Voor paraffine-ingebedde monsters worden plakjes eerst in een opgewarmd waterbad geplaatst en vervolgens uit het water op de dia getild en gedroogd.
Biologisch weefsel heeft heel weinig inherent contrast, dus na histologie worden dia's meestal gekleurd met kleurstoffen of antilichamen die morfologie of specifieke eiwitten benadrukken. De meest voorkomende kleurstof die wordt uitgevoerd, is hematoxyline en eosine, of H&E. Omdat het zo gebruikelijk is, zijn er veel geautomatiseerde machines gemaakt om op reproducieerbare wijze talrijke secties met H&E te kleuren. Hematoxyline kleurt de kernen van cellen blauw en eosine kleurt het cytoplasma roze, waardoor de cellulaire morfologie van weefsels wordt onthuld.
Een nadeel van fixatie is dat de cross-linking van eiwitten het moeilijker kan maken voor het labelen van antilichamen om hun bindingsplaatsen te vinden. In plaats van fixatie te gebruiken om monsters te bewaren, kan snel bevriezen van weefsel, of snap-freezing, worden gebruikt, wat gevolgd wordt door een snijtechniek genaamd cryosectioning.
Weefselmonsters worden ingebed en georiënteerd in een speciaal vriesmedium genaamd OCT, of optimal cutting temperature medium en vervolgens snel bevroren. Net als andere inbeddingsmedia, past OCT de stijfheid van het monster.
Een cryomicrotoom of cryostat
Histologie is een term die verwijst naar de studie van de microscopische anatomie van weefsels en cellen. Goede histologische monstervoorbereiding voor lichtmicroscopie is essentieel voor het verkrijgen van kwaliteitsresultaten van weefselmonsters.
Er zijn 3 hoofdstappen die gemeenschappelijk zijn voor bijna alle histologische procedures. Eerst wordt het monster gefixeerd om het weefsel te bewaren en weefseldegradatie te vertragen. Vervolgens wordt het monster ondergedompeld in een materiaal, of inbeddingsmedium, dat vergelijkbare mechanische eigenschappen heeft. Eenmaal ingebed, wordt het monster gesneden, of gesneden, in dunne plakjes met behulp van een precies snijinstrument dat bekend staat als een microtoom. Deze video beschrijft deze algemene stappen en enkele van de concepten die daarmee verband houden.
Weefselfixatie is een cruciale stap die cel- en weefselcomponenten behoudt en hun structuur handhaaft. Na celdood worden natuurlijk voorkomende enzymen vrijgelaten uit cellulaire organellen en beginnen ze de eiwitten in de hele cel en extracellulaire matrix af te breken, waardoor de structuur van de cel wordt vernietigd. Fixatie voorkomt een dergelijke afbraak door de vermogen van deze enzymen om eiwitten te verteren direct te remmen en door de splitsingsplaatsen van het enzym onherkenbaar te maken.
De twee belangrijkste mechanismen van fixatie zijn cross-linking en coaguleren. Cross-linking omvat de vorming van covalente bindingen zowel binnen als tussen eiwitten, waardoor het weefsel stijf wordt en daarom beter bestand is tegen afbraak. Coagulatie wordt veroorzaakt door de uitdroging van eiwitten door het gebruik van alcoholen of aceton, die de tertiaire structuur van eiwitten vervormen, zodat hydrofobe, of watervrezende, regio's het eiwitoppervlak verplaatsen. Coagulatieve fixatie kan inbeddingsmedia, zoals paraffinewas, helpen het weefsel te penetreren.
Een van de meest gebruikte fixatieven is Formaline, dat formaldehyde is opgelost in water. Tijdens fixatie hecht formaldehyde zich aan primaire aminen, zoals die op de zijketens van de aminozuren lysine en glutamine, om een stabiele crosslink genaamd een metheelbrug te vormen. Dit proces is inherent traag en kan tot 1-2 dagen duren.
Voorafgaand aan fixatie moeten enkele overwegingen worden gemaakt. Ten eerste, overweeg de diffusie van het monster. Fixatieven zullen zich met een snelheid verspreiden door weefsels die gerelateerd is aan de diffusiecoëfficiënt voor het fixatief vermenigvuldigd met de vierkantswortel van de tijd. Een fixatief dat 1 uur nodig heeft om 1 mm in het monster te penetreren, zal 25 uur nodig hebben om 5 mm te penetreren. Zodra formaline het centrum van het weefsel heeft bereikt, moet de crosslinkingreactie nog plaatsvinden. Daarom moet de monstergrootte worden beperkt tot 4 mm dikte voor een grondige fixatie in een redelijke hoeveelheid tijd.
Ten tweede, overweeg het volume en de pH van het fixatief. De verhouding fixatief tot monstervolume moet ten minste 40:1 zijn, zodat het reagens niet gemakkelijk over tijd wordt uitgeput. Terwijl sommige fixatieven zijn ontworpen om bij een zure pH te werken, werkt formaline het beste wanneer gebufferd met fosfaat om een neutrale pH te behouden, zodat er geen overtollig zuur wordt geproduceerd, wat artefacten in weefsel veroorzaakt.
De volgende stap in de histologische voorbereiding is inbedding, die het ondersteunen van monsters in media omvat die vergelijkbare mechanische stijfheid heeft als het monster zelf. Het kiezen van de juiste inbeddingsmedium is cruciaal, omdat als het te stijf of te zwak is, er defecten kunnen optreden tijdens het snijden. Verreweg het meest gebruikte medium voor inbedding is paraffinewas.
Voorafgaand aan paraffine-inbedding moeten monsters worden gedehydrateerd door het water in het weefsel te vervangen door ethanol, eerst gevolgd door xylenen en vervolgens opgewarmde paraffinewas. Zodra de was het monster heeft geïnfiltreerd, wordt het zorgvuldig gepositioneerd en omgeven met extra was met behulp van een mal om een blok te vormen. Vervolgens worden monsters aan een weefselcassette bevestigd voor het snijden.
Snijden is het proces van het snijden van dunne plakjes van een monster uit een inbeddingsblok. De secties zijn meestal ongeveer 4-10 µm dik voor gebruik met lichtmicroscopie.
Om secties te snijden, wordt eerst een metaal-, glas- of diamantmes bevestigd op een microtoom. Vervolgens wordt het monster in een monsterhouder geplaatst. Vervolgens wordt het monster naar het snijvlak gebracht en over de mes gesleept om een plakje van de gewenste dikte te creëren. Secties zullen zich ophopen als dunne linten die op glazen plaatjes kunnen worden geplaatst.
Na het snijden worden monsters op dia's geplaatst. Voor paraffine-ingebedde monsters worden plakjes eerst in een opgewarmd waterbad geplaatst en vervolgens uit het water op de dia getild en gedroogd.
Biologisch weefsel heeft heel weinig inherent contrast, dus na histologie worden dia's meestal gekleurd met kleurstoffen of antilichamen die morfologie of specifieke eiwitten benadrukken. De meest voorkomende kleurstof die wordt uitgevoerd, is hematoxyline en eosine, of H&E. Omdat het zo gebruikelijk is, zijn er veel geautomatiseerde machines gemaakt om op reproducieerbare wijze talrijke secties met H&E te kleuren. Hematoxyline kleurt de kernen van cellen blauw en eosine kleurt het cytoplasma roze, waardoor de cellulaire morfologie van weefsels wordt onthuld.
Een nadeel van fixatie is dat de cross-linking van eiwitten het moeilijker kan maken voor het labelen van antilichamen om hun bindingsplaatsen te vinden. In plaats van fixatie te gebruiken om monsters te bewaren, kan snel bevriezen van weefsel, of snap-freezing, worden gebruikt, wat gevolgd wordt door een snijtechniek genaamd cryosectioning.
Weefselmonsters worden ingebed en georiënteerd in een speciaal vriesmedium genaamd OCT, of optimal cutting temperature medium en vervolgens snel bevroren. Net als andere inbeddingsmedia, past OCT de stijfheid van het monster.
Een cryomicrotoom of cryostat
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is tissue fixation necessary in histological sample preparation?
Tissue fixation preserves cell and tissue structure by preventing degradation caused by naturally occurring enzymes released after cell death. Fixation inhibits enzyme activity and makes protein cleavage sites unrecognizable. The two main mechanisms are cross-linking, which forms covalent bonds to stiffen tissue, and coagulation, which dehydrates proteins using alcohols or acetone to deform their structure.
Q2: What are the two main mechanisms of tissue fixation?
Cross-linking involves covalent bond formation within and between proteins, causing tissue to stiffen and resist degradation. Coagulation dehydrates proteins through alcohols or acetone, deforming their tertiary structure so hydrophobic regions move to the protein surface. Coagulative fixation helps embedding media like paraffin wax penetrate tissue more effectively.
Q3: How does formalin work as a fixative in tissue preparation?
Formalin, formaldehyde dissolved in water, attaches to primary amines on amino acid side chains like lysine and glutamine, forming stable crosslinks called methylene bridges. This cross-linking process is inherently slow, requiring 1-2 days for completion. Formalin works best when buffered with phosphate to maintain neutral pH and prevent tissue artifacts.
Q4: What factors should be considered before tissue fixation begins?
Consider sample diffusivity: fixatives penetrate tissue at rates related to diffusion coefficient and time, so samples should be limited to 4 mm thickness for thorough fixation. Also consider fixative volume and pH. The fixative-to-sample ratio should be at least 40:1 to prevent reagent depletion. Formalin should be buffered with phosphate to maintain neutral pH and avoid tissue artifacts.
Q5: What is the purpose of embedding media in histological preparation?
Embedding media supports specimens with mechanical rigidity similar to the tissue itself. Paraffin wax is the most common embedding medium. Choosing appropriate embedding media is critical because media that is too stiff or too weak causes sectioning defects. Prior to paraffin embedding, samples must be dehydrated by replacing water with ethanol, then xylenes, and finally warmed paraffin wax.
Q6: How does cryosectioning differ from traditional paraffin-embedded sectioning?
Cryosectioning avoids fixation by rapidly freezing tissue in OCT (optimal cutting temperature) medium, then sectioning with a cryomicrotome maintained at -20°C. Unlike paraffin sections that require water bath treatment, frozen sections are directly lifted onto positively charged glass slides immediately after sectioning. This method preserves protein structure better for antibody labeling since cross-linking does not occur.
Q7: What are alternative embedding methods to paraffin wax?
Agar embedding covers samples with freshly prepared liquid agarose that locks tissue in place as it cools. Vibrotomes with vibrating blades cut thick sections of 50-1000 µm from agarose-embedded samples. Samples are typically removed from agarose before staining and mounted on slides with vacuum grease. Thick agarose sections are best viewed using light microscopy principle instrumentation and applications for high-resolution imaging.
Hoofdstukken in deze video
0:00
Overview
1:05
Fixation of Tissue Samples
4:19
Embedding and Sectioning
6:12
Applications
9:01
Summary