Histologische monstervoorbereiding voor lichtmicroscopie

Histologie is een term die verwijst naar de studie van de microscopische anatomie van weefsels en cellen. Een correcte histologische monstervoorbereiding voor lichtmicroscopie is essentieel voor het verkrijgen van kwalitatieve resultaten uit weefselmonsters.

Er zijn 3 hoofdstappen die gebruikelijk zijn voor bijna alle histologische procedures. Ten eerste wordt het monster gefixeerd om het weefsel te preserveren en weefseldegradatie te vertragen. Vervolgens wordt het monster ondergedompeld in een materiaal, of inbeddingsmedium, dat vergelijkbare mechanische eigenschappen heeft als het monster zelf. Eenmaal ingebed wordt het monster gesneden in dunne plakjes met behulp van een precisie-snijinstrument, bekend als een microtoom. Deze video beschrijft deze algemene stappen en enkele van de hiermee samenhangende concepten.

Weefselfixatie is een cruciale stap die cel- en weefselcomponenten behoudt en hun structuur in stand houdt. Na de celdood komennatuurlijk voorkomende enzymen vrij uit cellulaire organellen en beginnen zij de eiwitten in de hele cel en de extracellulaire matrix af te breken, waardoor de structuur van de cel wordt vernietigd. Fixatie voorkomt dergelijke degradatie door het vermogen van deze enzymen om eiwitten te verteren direct te remmen en door de enzymatische splitsingsplaatsen onherkenbaar te maken.

De twee belangrijkste mechanismen van fixatie zijn cross-linking (crosslinking) en coagulatie. Cross-linking houdt in dat er covalente bindingen worden gevormd, zowel binnen eiwitten als tussen hen, waardoor het weefsel verstijft en daardoor resistent wordt tegen degradatie. Coagulatie wordt veroorzaakt door de dehydratatie van eiwitten door het gebruik van alcoholen of aceton, waardoor de tertiaire structuur van het eiwit vervormt, zodat hydrofobe, of watervrezende, regio's naar het eiwitoppervlak bewegen. Coagulatieve fixatie kan helpen bij het penetreren van weefsel door inbeddingsmedia, zoals paraffine.

Een van de meest gebruikte fixatieven is formaline, wat formaldehyde is opgelost in water. Tijdens de fixatie bindt formaldehyde zich aan primaire amines, zoals die worden aangetroffen in de zijketens van de aminozuren lysine en glutamine, om een stabiele cross-link te vormen die een methyleenbrug wordt genoemd. Dit proces is van nature traag en kan tot 1-2 dagen duren.

Voorafgaand aan de fixatie moeten enkele overwegingen worden gemaakt. Ten eerste moet de diffusiviteit van het monster worden overwogen. Fixatieven diffunderen door weefsels over een afstand tegen een snelheid die gerelateerd is aan de diffusiecoëfficiënt van het fixatiev vermenigvuldigd met de wortel van de tijd. Een fixatief dat 1 uur nodig heeft om 1 mm in het monster te penetreren, zal 25 uur nodig hebben om 5 mm te penetreren. Zodra de formaline het centrum van het weefsel heeft bereikt, moet de crosslinking-reactie nog steeds plaatsvinden. Daarom moet de monstergrootte worden beperkt tot 4 mm dikte voor een grondige fixatie binnen een redelijke tijd.

Ten tweede moeten het volume en de pH van het fixatief worden overwogen. De verhouding tussen het volume fixatief en het monstervolume moet ten minste 40:1 zijn, zodat het reagens niet gemakkelijk in de loop van de tijd wordt uitgeput. Hoewel sommige fixatieven zijn ontworpen om bij een zure pH te werken, werkt formaline het beste wanneer het met fosfaat is gebufferd om een neutrale pH te handhaven, zodat er geen overtollig zuur wordt geproduceerd, wat artefacten in het weefsel veroorzaakt.

De volgende stap in de histologische preparatie is het inbedden, waarbij de monsters worden ondersteund in media die een vergelijkbare mechanische stijfheid hebben als het monster zelf. De keuze voor het juiste inbeddingsmedium is cruciaal, omdat er bij het snijden defecten kunnen optreden als het medium te stijf of te zwak is. Met afstand is paraffinewas het meest gebruikte medium voor het inbedden.

Voorafgaand aan het inbedden in paraffine moeten de monsters worden gedehydrateerd door het water in het weefsel eerst te vervangen door ethanol, gevolgd door xylenen en ten slotte door warme paraffinewas. Zodra de was het monster is binnengedrongen, wordt het zorgvuldig gepositioneerd en met behulp van een mal omringd door extra was om een blok te vormen. Vervolgens worden de monsters bevestigd aan een weefselcassette voor het snijden.

Het snijden (sectioneren) is het proces waarbij dunne plakjes van een monster uit een inbeddingsblok worden gesneden. De coupes hebben gewoonlijk een dikte van 4-10 µm voor gebruik met lichtmicroscopie.

Om coupes te snijden, wordt eerst een metalen, glazen of diamanten mes op een microtoom bevestigd. Het monster wordt vervolgens in een monsterhouder geplaatst. Daarna wordt het monster naar het snijvlak bewogen en over het mes getrokken om een plakje van de gewenste dikte te creëren. De coupes hopen zich op als dunne linten, die op glazen objectglazen kunnen worden geplaatst.

Na het snijden worden de monsters op objectglazen geplaatst. Bij met paraffine ingebedde monsters worden de coupes eerst in een verwarmd waterbad geplaatst, waarna ze uit het water op het objectglas worden getild en mogen drogen.

Biologisch weefsel heeft zeer weinig inherent contrast, waardoor coupes na histologische preparatie meestal worden gekleurd met kleurstoffen of antilichamen die de morfologie of specifieke eiwitten accentueren. De meest gebruikte kleuring is hematoxyline en eosine, oftewel H&E. Omdat deze zo gebruikelijk is, zijn er veel geautomatiseerde apparaten ontwikkeld om talrijke coupes reproduceerbaar met H&E te kleuren. Hematoxyline kleurt de celkernen blauw en eosine kleurt het cytoplasma roze, waardoor de cellulaire morfologie van weefsels zichtbaar wordt.

Een nadeel van fixatie is dat de cross-linking van eiwitten het voor labelende antilichamen moeilijker kan maken om hun bindingsplaatsen te vinden. In plaats van fixatie te gebruiken om monsters te preserveren, kan snel invriezen van weefsel, of snap freezing, worden toegepast, gevolgd door een coupesnijtechniek genaamd cryosectioning.

Weefselmonsters worden ingebed en georiënteerd in een speciaal vriesmedium genaamd OCT, of optimal cutting temperature medium, en vervolgens snel ingevroren. Net als andere inbeddingsmedia stemt OCT af op de rigiditeit van het monster.

Een cryomicrotoom of cryostaat wordt gebruikt om bevroren coupes te snijden; dit instrument handhaaft een interne temperatuur van -20°C om het snijmes en de monsters koel te houden. In tegenstelling tot paraffine-ingebedde coupes kunnen bevroren coupes direct na het snijden op een positief geladen glazen objectglas worden overgebracht.

Een andere manier om fixatie te vermijden is via agar-inbedding, waarbij monsters worden bedekt met vers bereide vloeibare agarose. Terwijl de agarose afkoelt, wordt het weefsel op zijn plaats gefixeerd en kan overtollige agarose worden weggesneden.

Vibrotomen, een ander alternatief voor het microtoom, hebben een mes dat vibreert en over het in agarose ingebedde monster beweegt. Vibrotomen worden gebruikt om dikke coupes in de orde van 50-1000 µm te maken van in agarose ingebedde monsters.

Monsters worden doorgaans uit de agarose verwijderd vóór het kleuren, en vervolgens op een objectglas geplaatst, omringd door een substantie zoals vacuümvet dat voorkomt dat het dekglas het monster platdrukt. Deze worden bij voorkeur bekeken met confocale microscopie om beelden met een hoge resolutie van elke dikke coupe te verkrijgen.

U heeft zojuist de video van JoVE bekeken over histologische monstervoorbereiding voor lichtmicroscopie.

U begrijpt nu de stappen die nodig zijn bij de monstervoorbereiding om van een stuk weefsel tot een kleurbare coupe te komen. Bedankt voor het kijken!