Name: Bereiding van acinaire cellen ten behoeve van Calcium Imaging, Cell Injury Metingen en adenovirale infectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Leer de isolatie van primaire muizenpancreas-acinaire cellen voor calcium-imaging en celletselmetingen. Dit protocol omvat collageenase-vertering, filteren en adenovirale infectie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health Grant DK083327 en DK093491 (tot SZH).

1. Voorbereiding Pancreatic Acinaire Cellen voor Calcium Imaging <ol><li> Bereid HEPES incubatiebuffer bevattende 20 mM HEPES, 95 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM MgCl2, 1,3 mM CaCl2, 10 mM glucose, 2 mM glutamine en 1 x minimale Eagle&#39;s medium niet-essentiële aminozuren. Stel de uiteindelijke oplossing op pH 7,4 met NaOH. </li><li> Bereid een BSA incubatiebuffer door toevoeging BSA (1% w / v final) tot 25 ml HEPES incubatiebuffer (hierboven beschreven). </li><li> Bereid een collagenase digestie buffer door het toevoegen van 1,1 mg / ml (200 eenheden / ml) type-4 collagenase en 1 mg / ml sojaboon trypsine remmer 6 ml BSA incubatiebuffer (hierboven beschreven). </li><li> Acid-wash 22x22 mm dekglaasjes door onderdompeling in twee delen HNO3 en enerzijds HCl gedurende 2 uur. Decanteren dan met DI-water en op te slaan in 70% ethanol. </li><li> Euthanaseren een muis door CO 2 stikken. Oriënteer het dier in rugligging, en bereiden de buikoppervlak door cleaning met 70% ethanol. Voer een laparotomie de buikholte bloot. Ontleden de alvleesklier en onmiddellijk in een kleine wegen boot met 6 ml collagenase spijsvertering buffer. </li><li> Ontleden weg elke grote stukken vet of zichtbare bloedvaten, verwijder vervolgens 5 ml collagenase spijsvertering buffer en voeg het terug naar de 15 ml conische buis. </li><li> Met behulp van fijne dissectie schaar gehakt de alvleesklier in de kleine wegen boot met 1 ml collagenase spijsvertering buffer. Hak tot de verkregen oplossing wordt gelijkmatig gedispergeerd. </li><li> Breng het gehakte product in een 125 ml Erlenmeyer kolf plastic en voeg de rest 5 ml collagenase digestie buffer aan de container. Zorg ervoor dat het weefsel wordt volledig ondergedompeld in buffer. </li><li> Plaats de kolf in een 37 ° C waterbad en schud bij 90 rpm gedurende 30 minuten. Tijdens deze korte periode van downtime, bereiden calcium activerende agonisten (bv. caerulein, carbachol) en spoel de 22x22 mm zuur gewassen dekselslips met DI-water. Droog, en dan boven op een vlakke ondergrond omzoomd door laboratorium film. </li><li> Na de 30 min digest is voltooid, de overdracht van de schorsing terug tot de 15 ml conische buis en laat de cellen om zich te vestigen. Voorzichtig pipet uit de collagenase spijsvertering buffer en vervangen met 6 ml BSA incubatiebuffer. Schud de buis met de hand gedurende 10 seconden om de cellen te dispergeren in kleinere clusters. Onmiddellijk na het schudden, verwijder alle grote, drijvend vuil uit de wisselvalligheid media. </li><li> Laat de resterende cellen om zich te vestigen, en wisselen de media met verse BSA incubatie buffer. </li><li> Herhaal stap 1.11 maal, totdat de suspensie slechts uit kleine clusters die alleen fijn zichtbaar voor het blote oog. De cellen moeten lijken op die in figuur 1A (bovenste rij). </li><li> Verwijder de BSA incubatiebuffer en te vervangen door HEPES incubatie buffer. </li><li> Bereid een 750 uM, 100X voorraad van Fluo-4:00 in 10% DMSO. </li><li> Plaats de cellen in de 15 ml conische buis met de celsuspensie en BSA-vrij HEPES incubatiebuffer. Om dit te doen, voeg een geschikt volume (1:100 verdunning) van de voorraad oplossing voor de celsuspensie. Dan plaat 500 ul van deze suspensie op elk 22x22 mm dekglaasje. </li><li> Houd dekglaasjes in het donker bij kamertemperatuur. Neem de eerste Ca 2 + metingen 30 min. na het laden. De kleurstof wordt automatisch uit het medium verwijderd bij het opstarten van de perfusie, die optreedt na 30 min dye laden. </li></ol> 2. Het meten van calcium in Pancreatic Acinaire Cellen <ol><li> Spoel elke perfusie set-up met DI-water en vullen met een geschikte hoeveelheid buffer of agonist. Prime elke spuit met buffer of agonist om een ​​goede doorstroming te verzekeren. Klem spuiten om een ​​ring te staan ​​ongeveer 1-2 meter boven de microscoop podium. </li><li> Gebruik fijn pincet om zorgvuldig te begrijpen van zijn kant een dekglaasje bevattende celsuspensie. Kantel het dekselslip 45 °, en laat het overtollige buffer weg kan lopen. Plaats het dekglaasje bovenop de rubberen pakking de cellen bovenop het dekglaasje en monteer de kamer (Figuren 2A en 2B). </li><li> Beveilig de perfusie kamer naar het podium en steek de slang die buffer in de eerste inlaat van de kamer (figuur 2C) bevat. Draai de spuit met buffer op en laat de buffer perfuseren over het gehele oppervlak van het dekglaasje. Zodra de buffer de andere kant van de kamer is bereikt, plaatst een vacuümleiding in de vacuüminlaat. Steek geen andere buizen (met agonist, remmers, enz.) in hun juiste positie langs de kamer. </li><li> Visualiseren cellen met behulp van een 200X of 400X, 1,4 numerieke apertuur objectief en een argon laser om de kleurstof Fluo-04:00 wekken bij een golflengte van 488 nm (figuur 1A, bodem). De energie-instellingen van de laser worden aangepast dat de fotomultiplicator (PMT) Wordt niet verzadigd door het uitgezonden licht. Bovendien is de spanning over de PMT moet worden geoptimaliseerd voor een maximale lichtdetectie. </li><li> Long pass emissiesignalen van&gt; 515 nm worden verzameld bij framesnelheden van 2,5 sec / frame visualiseren langzaam oscillerende patronen en 0,2-0,3 sec / frame visualiseren sneller globale calciumgolven (figuren 3 en 4). </li><li> Na beeldvorming is voltooid, sluit u de spuiten en verwijder alle slangen. Demonteer de kamer en herhaal de stappen 2,2-2,4. </li><li> Verzamelen van gegevens als numerieke waarden van fluorescentie-intensiteit in de tijd en transfer naar Afbeelding J (software pakket geboden als freeware door de National Institutes of Health en is te vinden op <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). </li><li> Bekijk real-time beelden van de cel en het identificeren van gebieden van belang (ROI; dwz apicale, basolaterale, kernenergie, enz.) </li><li> Acquire fluorescentie-intensiteiten voor deze ROI en represent als fluorescentie-intensiteit / basislijn fluorescentie-intensiteit (dwz F/F0). </li><li> Genereer traces door het uitzetten van F / F 0 versus tijd. Naast doordrukken worden representatieve beelden gangbare en weergegeven met pseudocolor. </li></ol> 3. Voorbereiding van de Alvleesklier Acinaire Cellen voor mobiele Injury Testen <ol><li> Warm DMEM F-12 media (zonder fenol rood) tot 37 ° C. </li><li> Voeg BSA (0,1% w / v final) en HCl (50 uM final) de DMEM F-12 media. </li><li> Aliquot 50 ml DMEM in een conische buis. </li><li> Bereid een collagenase buffer door het toevoegen van 0,5 mg / ml (12 U / ml) van collagenase type IV tot 10 ml aangevuld DMEM F-12 media. </li><li> Euthanaseren een muis door CO 2 stikken. Oriënteer het dier in rugligging, en bereiden de buikoppervlak door reiniging met 70% ethanol. Voer een laparotomie de buikholte bloot. Ontleden de alvleesklier en onmiddellijk in een kleine weegschuitje containing 6 ml collagenase buffer. </li><li> Gehakt het weefsel met behulp van fijne dissectie schaar voor 3-5 minuten of totdat de verkregen oplossing lijkt gelijkmatig verspreid. </li><li> Breng het gehakt weefsel naar een 125 ml erlenmeyer met 5 ml extra collagenase buffer, vervolgens plaats in een 37 ° C waterbad onder schudden bij 90 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Haal ze uit de shaker, zodat cellen te kort af te wikkelen, en uitwisseling met 5 ml vers collagenase buffer. Dan Incubeer nog eens 35 min in een 37 ° C waterbad onder schudden bij 90 rpm. </li><li> Krachtig resuspendeer de digest met een transfer pipet totdat de suspensie er homogeen zonder duidelijke celklonten. Dan zachtjes pipet de celsuspensie door middel van een pre-natte nylon in een erlenmeyer. </li><li> Krachtig pipet nog 3 ml vers DMEM F-12 media (met collagenase) door het gaas, om erdoor eventuele resterende cellen. </li><li> Voeg nog een 6-10 ml DMEM F-12 media en eenllow de cellen om zich te vestigen voor 2-3 minuten. Herhaal deze stap twee keer, en verwijder het supernatant na de laatste wasbeurt. </li><li> Voeg vers DMEM F-12 media, resuspendeer de cellen, en de plaat 500 pi celsuspensie in elk putje van een 48-well weefselkweek platen. De cellen moeten lijken op die afgebeeld in figuur 1B. </li><li> Laat de plaat te zitten in een 37 ° C waterbad bij 90 rpm gedurende 5 min voor het toevoegen van agonisten. </li><li> Stimuleren van de cellen met verschillende agonisten voor 2-4 uur. </li><li> Kantel de plaat in een hoek, zodat de cellen om zich te vestigen en voorzichtig pipet uit een hoeveelheid van de media (meestal 100 pl) en flits bevriezen in vloeibare stikstof. </li><li> Flits bevriezen de resterende celsuspensie. Flash Koud essentieel LDH metingen. Als alternatief monsters op ijs worden bewaard indien zij op dezelfde dag worden getest of opgeslagen in -20 ° C voor lange termijn opslag. </li></ol> 4. Meten lactaatdehydrogenase Lekkage <ol><li&gt; Meet lactaat dehydrogenase (LDH) lekkage in de eerste plaats het gebruik van de reagentia en instructies geleverd in de Promega CytoTox 96 Non-Radioactive cytotoxiciteitstest kit (zie Tabel van specifieke reagentia en materialen). </li><li> Los het LDH substraat (dat is verschaft in de kit) met 12 ml assaybuffer (ook). </li><li> Ontdooi ingevroren celsuspensie en media monsters in een waterbad bij kamertemperatuur. </li><li> Plaat 50 ul van elk monster media in een 96-well plaat. </li><li> Aan de celsuspensie, voeg de nodige volume 10X lysis buffer zodat de uiteindelijke concentratie 1X. Vortex kort en incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten. </li><li> Centrifugeer gelyseerde monsters bij 250 xg gedurende 4 minuten tot pellet celresten. </li><li> Voor cellysaten plate 50 ui van een 1:10 verdunning in elk putje van een 96 putjesplaat. </li><li> Voeg 50 ul van gereconstitueerde substraat aan elk putje, incubeer de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Stop de reactie doortoevoegen van 50 pi van de stopoplossing (verschaft in de kit) aan elk putje. </li><li> Meet absorptie bij 490 nm. </li><li> Gebruik de volgende formules om% LDH lekkage te berekenen. De optische dichtheden hieronder worden gecorrigeerd door het aftrekken van een blanco OD lezen van een goed met alleen PBS, substraat, en stop oplossing. </li></ol> LDH in media = (Media OD492) x (media verdunningsfactor) x (vol. van media) * Aangezien het meestal niet nodig om media monsters te verdunnen, zal de verdunningsfactor vaakst equal1. Totale LDH = ((Lysate OD 490) x (lysate verdunningsfactor) x (vol. in cel suspensie)) + ((Media OD 490) x (verdunningsfactor) x (vol. van media gealiquoteerd voor bemonstering)) <img alt="Vergelijking 1" fo:src="/files/ftp_upload/50391/50391eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50391/50391eq1.jpg" /> 5. Infecteren Pancreatic Acinaire Cellen met Adenovirus <ol><li> Bereidenacinaire cellen zoals beschreven in paragraaf 3. </li><li> Na stap 3.12, voeg 10 7 infectieuze eenheden (IFUs) van adenovirus aan de celsuspensie en incubeer 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Gelijkmatig plaat 2 ml celsuspensie in een 6-wells plaat. </li><li> Voor de meeste expressie constructen, moeten cellen adequaat worden besmet binnen 18 uur, en voor sommige luciferaseconstructies, net binnen 6 uur. </li></ol>

<ol><li>Toescu, E. C., Lawrie, A. M., Petersen, O. H., Gallacher, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+distribution+of+agonist-evoked+cytoplasmic+Ca2%2B+signals+in+exocrine+acinar+cells+analysed+by+digital+image+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal distribution of agonist-evoked cytoplasmic Ca2+ signals in exocrine acinar cells analysed by digital image microscopy.</a> Embo J. 11, 1623-1629 (1992).</li>
<li>Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromolar+and+submicromolar+Ca2%2B+spikes+regulating+distinct+cellular+functions+in+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Micromolar and submicromolar Ca2+ spikes regulating distinct cellular functions in pancreatic acinar cells.</a> Embo J. 16, 242-251 (1997).</li>
<li>Husain, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ryanodine+receptor+mediates+early+zymogen+activation+in+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The ryanodine receptor mediates early zymogen activation in pancreatitis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14386-14391 (2005).</li>
<li>Raraty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+enzyme+activation+and+vacuole+formation+in+the+apical+granular+region+of+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent enzyme activation and vacuole formation in the apical granular region of pancreatic acinar cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13126-13131 (2000).</li>
<li>Orabi, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+mitigates+caerulein-induced+pancreatitis+in+vivo+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dantrolene mitigates caerulein-induced pancreatitis in vivo in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299, G196-G204 (2009).</li>
<li>Shah, A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease+Activation+during+in+vivo+Pancreatitis+is+Dependent+upon+Calcineurin+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protease Activation during in vivo Pancreatitis is Dependent upon Calcineurin Activation.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2009).</li>
<li>Muili, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+and+genetic+inhibition+of+calcineurin+protects+against+carbachol-induced+pathologic+zymogen+activation+and+acinar+cell+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic and genetic inhibition of calcineurin protects against carbachol-induced pathologic zymogen activation and acinar cell injury.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).</li>
<li>Orabi, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+carbachol-induced+protease+activation+and+accelerates+Ca2%2B+waves+in+isolated+rat+pancreatic+acini%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances carbachol-induced protease activation and accelerates Ca2+ waves in isolated rat pancreatic acini.</a> J. Biol. Chem. 286, 14090-14097 (2011).</li>
<li>Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O'Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Ca2%2B+wave+propagation+in+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 267, 18118-18121 (1992).</li>
<li>Reed, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+extracellular+pH+induces+damage+in+the+pancreatic+acinar+cell+by+enhancing+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Low extracellular pH induces damage in the pancreatic acinar cell by enhancing calcium signaling.</a> J. Biol. Chem. 286, 1919-1926 (2011).</li>
<li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).</li>
<li>Van Acker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+progression+locus-2+is+a+critical+regulator+of+pancreatic+and+lung+inflammation+during+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor progression locus-2 is a critical regulator of pancreatic and lung inflammation during acute pancreatitis.</a> J. Biol. Chem. 282, 22140-22149 (2007).</li>
<li>Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+multiple+forms+of+Ca%282%2B%29+spikes+by+inositol+trisphosphate+in+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of multiple forms of Ca(2+) spikes by inositol trisphosphate in pancreatic acinar cells.</a> J. Cell Biol. 146, 405-413 (1999).</li>
<li>Leite, M. F., Burgstahler, A. D., Nathanson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+waves+require+sequential+activation+of+inositol+trisphosphate+receptors+and+ryanodine+receptors+in+pancreatic+acini%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Ca2+ waves require sequential activation of inositol trisphosphate receptors and ryanodine receptors in pancreatic acini.</a> Gastroenterology. 122, 415-427 (2002).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46, 143-151 (2008).</li>
<li>Schild, D., Jung, A., Schultens, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+calcium+entry+through+calcium+channels+in+olfactory+receptor+neurones+using+a+laser+scanning+microscope+and+the+calcium+indicator+dyes+Fluo-3+and+Fura-Red%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red.</a> Cell Calcium. 15, 341-348 (1994).</li>
<li>Saluja, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretagogue-induced+digestive+enzyme+activation+and+cell+injury+in+rat+pancreatic+acini%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Secretagogue-induced digestive enzyme activation and cell injury in rat pancreatic acini.</a> Am. J. Physiol. 276, 835-842 (1999).</li>
<li>Husain, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors+contribute+to+bile+acid-induced+pathological+calcium+signaling+and+pancreatitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors contribute to bile acid-induced pathological calcium signaling and pancreatitis in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).</li>
<li>Gurda, G. T., Guo, L., Lee, S. H., Molkentin, J. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholecystokinin+activates+pancreatic+calcineurin-NFAT+signaling+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cholecystokinin activates pancreatic calcineurin-NFAT signaling in vitro and in vivo.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 198-206 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De celisolatie methode en de daaropvolgende analyses afgeschilderd hier vertegenwoordigen krachtige instrumenten om de fysiologische en pathofysiologische kenmerken van de exocriene pancreas bestuderen. Werkwijze voor het isoleren gedispergeerde acinaire cellen werd eerst beschreven door Amsterdam en Jamieson in 1972 11. De methoden die hier gepresenteerd zijn op basis van meer recente isolatie methoden beschreven door Van Acker en collega&#39;s 12. Hoewel deze technieken zijn zeer reproduceerbaar ...

Dynamische veranderingen in cytosolische calcium zijn nodig voor zowel de fysiologische en pathologische acinar cel gebeurtenissen. Deze uiteenlopende effecten van calcium wordt gedacht dat het gevolg zijn van verschillende ruimtelijke en temporele patronen van calcium signalering 1. Bijvoorbeeld, enzym en secretie vloeistof uit de acinaire cel verbonden calcium pieken van een beperkt gebied van het apicale pool waar afscheiding plaatsvindt 2. In tegenstelling, is een wereldwijde calcium golf gevolgd door intense niet-oscillerende calcium signalen geassocieerd met vroege pathologische gebeurtenissen die leiden tot acute pancreatitis 3,4. Deze omvatten intra-acinar protease activering, verminderde enzym secretie, en acinar celschade. Ons laboratorium gebruikt geïsoleerde pancreatische acini deze eerste pathologische gebeurtenissen die leiden tot ziekte zowel in vivo en in vitro onderzoeken 5-7. De methoden die hier gedetailleerd beschrijven isolatie van primaire acinaire cellen voor het meten van cytosolic calciumgehalte en celschade. Werkwijze voor adenovirale infectie van deze cellen is ook voorzien.

<table><tbody><tr><td>Mice</td><td>NCI</td><td>N/A</td><td>Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Fischer</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>J.T. Baker</td><td>1916-01</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G-8540</td><td></td></tr><tr><td>1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>EM</td><td>SX0593</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Worthington</td><td>4188</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Dioxide</td><td>Matheson Gas</td><td>124-38-9</td><td></td></tr><tr><td>125 ml Erlenmeyer plastic flask</td><td>Crystalgen</td><td>26-0005</td><td></td></tr><tr><td>Dissection kit</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>LabChem</td><td>LC222102</td><td></td></tr><tr><td>P1000, P100, P10 pipettes</td><td>Gilson</td><td>FA10005P</td><td></td></tr><tr><td>Weighing boat</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS1420A</td><td></td></tr><tr><td>Plastic transfer pipettes</td><td>USA Scientific</td><td>1020-2500</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml micro-centrifuge tube</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>0.65 ml micro-centrifuge tube</td><td>VWR</td><td>20170-293</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm glass coverslips</td><td>Fisher</td><td>032811-9</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>Fischer</td><td>A483-212</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fischer</td><td>A142-212</td><td></td></tr><tr><td>Deionized water</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 mm coverslips</td><td>Fischer</td><td>021510-9</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory film</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Luer lock</td><td>Becton Dickinson</td><td>932777</td><td></td></tr><tr><td>60 ml syringe</td><td>BD Bioscience</td><td>DG567805</td><td></td></tr><tr><td>23 &#190; gauge needle</td><td>BD Bioscience</td><td>9328270</td><td></td></tr><tr><td>PE50 tubing</td><td>Clay Adam</td><td>PE50-427411</td><td></td></tr><tr><td>Flat head screwdriver </td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12, no Phenol Red</td><td>Gibco</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>30.5 gauge needle</td><td>BD Bioscience</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>5 CC syringe</td><td>BD Bioscience</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Erlenmeyer flask</td><td>Fischer</td><td>FB50025</td><td></td></tr><tr><td>Nylon mesh filter </td><td>Nitex</td><td>03-150/38</td><td>150 um pore size</td></tr><tr><td>48 well tissue culture plate</td><td>Costar</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>96 well tissue culture plate </td><td>Costar</td><td>3795</td><td></td></tr><tr><td>6 well tissue culture plate</td><td>Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td>Matheson Gas</td><td>7727-37-9</td><td> </td></tr><tr><td>Cytotoxicity assay kit</td><td>Promega</td><td>G1782</td><td> </td></tr><tr><td>Adeno-GFP</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gift from J. Williams</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Ring stand with clamps</td><td>United Scientific</td><td>SET462</td><td></td></tr><tr><td>Perifusion chamber</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University</td></tr><tr><td>Vacuum line</td><td>Manostat</td><td>72-100-000</td><td></td></tr><tr><td>Water bath with shaker</td><td>Precision Scientific</td><td>51220076</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy H1 plate reader</td><td>BioTek</td><td>11-120-534</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture hood</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture Incubator</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr></tbody></table>

bereiding van acinaire cellen ten behoeve van calcium imaging, cell injury metingen en adenovirale infectie

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Het acinaire cel het belangrijkste parenchymale cel van de exocriene pancreas en speelt een grote rol bij de secretie van pancreasenzymen in de ductus pancreaticus. Het is ook de plaats voor de initiatie van pancreatitis. Hier beschrijven we hoe acinar cellen worden geïsoleerd uit hele pancreas weefsel en intracellulair calcium signalen worden gemeten. Verder beschrijven we de technieken van deze cellen transfecteren met adenovirale constructen, en vervolgens het meten van de lekkage van lactaat dehydrogenase, een marker van celschade, in omstandigheden die acinar celbeschadiging in vitro te induceren. Deze technieken zorgen voor een krachtig hulpmiddel te karakteriseren acinar cel fysiologie en pathologie.

Een voorbeeld van acinaire cel calcium metingen in respons op fysiologische stimuli wordt verschaft in Figuur 3. Acinaire cellen werden beladen met de calcium kleurstof Fluo-4 en geperfuseerd met acetylcholine analoge carbachol (CCh, 1 uM)) 8. Cellen gereageerd in de vorm van een calcium-golf die initieert in het apicale gebied en propageert aan de basolaterale regio 3,9. Vertegenwoordiger traces weergegeven in figuur 3B tonen de typische piek-plateau patroon vaak ...

We beschrijven een reproduceerbare werkwijze voor het bereiden muizen acinaire cellen van een muis voor het onderzoek van acinaire cel calcium signalen en celbeschadiging met fysiologisch en pathologisch relevant stimuli. Werkwijze voor adenovirale infectie van deze cellen is ook voorzien.

Bereiding van acinaire cellen ten behoeve van Calcium Imaging, Cell Injury Metingen en adenovirale infectie

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Het algemene doel van deze procedure is om primaire cellen te isoleren en te infecteren om cytosolische calciumgehaltes en celbeschadiging te meten. Dit wordt bereikt door eerst pancreasweefsel van een muis te isoleren en het weefsel fijn te hakken in collagenasebuffer. In de tweede stap wordt het fijngehakte weefsel kortstondig geïncubeerd in collagenasebuffer bij 37 °C.Vervolgens worden de cellen gefiltreerd en daarna geresuspendeerd in kweekmedium. In de laatste stap worden de cellen geplaat voor celbeschadiging, calciummetingen of adenovirale infectie.Uiteindelijk kunnen LDH-lekkage, subcellulaire calcium fluorescentie en adenovirale fluorescentie worden gemeten om respectievelijk veranderingen in celtoxiciteit, calciumgehaltes en de efficiëntie van adenovirale infectie te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een gevoelige methode biedt om ASIN of celcytotoxiciteit en calciumsignalen te meten.Bovendien maakt het een betrouwbare infectie van pancreaskleiercellen met adenovirus mogelijk. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van acute pancreatitis, omdat het een snelle en grondige screening mogelijk maakt van potentiële bio

preparation-pancreatic-acinar-cells-for-purpose-calcium-imaging-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes the technique of imaging islet cells in real-time, to study the changes in cytosolic calcium concentration in the minor subpopulations of the pancreatic islet cells. Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells. This can provide an insight into the cross talk between the blood glucose and the islet secretory output.

Imaging Calcium Dynamics in Pancreatic Cells: A Technique to Study Real-time Changes in Cytosolic Calcium Concentration in Pancreatic Islet

This video describes the technique used for isolating pancreatic acinar cells--exocrine cells--containing a variety of digestive enzymes. Primary acinar cells are useful in the ex vivo study of acinar-to-ductal metaplasia (ADM)--an early event in developing pancreatic cancer.

Primary Acinar Cell Isolation: A Method to Isolate Acinar Cells from Mouse Pancreas

This video describes the technique of differentiating pancreatic acinar cells to ductal cells in ex vivo 3D culture. This helps to understand the mechanisms regulating the acinar-to-ductal metaplasia (ADM), a key process in the early development of pancreatic cancer.

Acinar-to-Ductal Metaplasia Induction: A Method to Study Acinar Cell to Ductal Cell Differentiation in 3D Ex Vivo Culture

In deze publicatie beschrijven we een snelle en gemakkelijke werkwijze voor het isoleren en kweken van primaire acinaire cellen van de pancreas muizen. Deze methode vormt een waardevolle benadering van de fysiologie van verse primaire normale / getransformeerde exocriene pancreas cellen te bestuderen.

Isolatie en Cultuur van de Muis Primaire Pancreatic Acinaire Cells

Geïsoleerde pancreas acini behouden hun in vivo morfologie en activiteit en bieden krachtige mogelijkheden voor het monitoren en manipuleren secretie. Dit werk toont hoe acini kan worden geïsoleerd uit de muis alvleesklier en hoe hun secretoire capaciteit kan worden beoordeeld.

Het beoordelen van de Secretory Capaciteit van Pancreatic acinuscellen

Primaire acinaire cel isolatie, eiwit expressie of activiteit modulatie, cultuur en stroomafwaarts toepassingen zijn heel nuttig in de ex vivo studie van acinaire-naar-ductaal metaplasie (ADM), een vroege evenement in de ontwikkeling van alvleesklierkanker.

Nabootsen en manipuleren van de alvleesklier acinaire-naar-ductaal metaplasie in 3-dimensionale celcultuur

Hier presenteren we een protocol voorbeeld vorming en kwantificeren van de calcium dynamica in heterogene celpopulaties, zoals de eiland cellen van de alvleesklier. Fluorescerende verslaggevers worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het eilandje, die vervolgens wordt geïmmobiliseerd en imaged, en per-cel analyse van de dynamiek van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgevoerd.

Imaging calcium dynamica in subpopulaties van muizen pancreatic eilandje cellen

We presenteren de bereiding van acute pancreasweefselplakken en hun gebruik in confocale laserscanmicroscopie om calciumdynamica gelijktijdig te bestuderen in een groot aantal levende cellen, gedurende lange tijdsperioden en met een hoge spatiotemporale resolutie.

Confocale laserscanning microscopie van calciumdynamiek in acute pancreasweefselplakken van muizen

In vivo beeldvorming met hoge resolutie van de alvleesklier werd vergemakkelijkt met het pancreas intravital imaging venster.

Gestabiliseerde longitudinale in vivo cellulaire visualisatie van de alvleesklier in een murien model met een pancreas intravital imaging venster

Intraperitoneale toediening van geneesmiddelen is een veilige en effectieve niet-invasieve benadering voor het induceren van pancreasletsel. Deze studie vergeleek vijf verschillende intraperitoneale injectieprotocollen bij muizen om verschillende gradaties van pancreasletsel te induceren en stelde een model van ernstig pancreasletsel vast om de pathologische veranderingen en behandelingsstrategieën voor ernstige acute pancreatitis (SAP) te onderzoeken.

Het voorbereiden van een muizenmodel van ernstige acute pancreatitis via een combinatie van caeruleïne en lipopolysaccharide intraperitoneale injectie

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de muizenalvleesklier te extraheren, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de pathogenese van Acute Pancreatitis-geïnduceerde Diabetes.

Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

Leer de isolatie van primaire muizenpancreas-acinaire cellen voor calcium-imaging en celletselmetingen. Dit protocol omvat collageenase-vertering, filteren en adenovirale infectie.

Bereiding van acinaire cellen ten behoeve van Calcium Imaging, Cell Injury Metingen en adenovirale infectie

Meer video's verkennen