Name: Bepaling van Microbiële extracellulaire enzymactiviteit in Waters, bodem en sedimenten behulp High Throughput Microplaat Testen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: Leer microbiële extracellulaire enzymactiviteit bepalen in water, bodem en sedimenten met behulp van high-throughput microplaat testen. Deze methode versnelt onderzoek naar organisch materiaal verwerking.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Financiering voor aspecten van dit werk werd geleverd door verschillende bronnen, waaronder het Amerikaanse ministerie van Landbouw Specifieke samenwerkingsovereenkomst 58-6408-1-595 en de National Science Foundation (award 1.049.911).

Colorimetrische analyse van extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten 1. Voorbereiding van de ondergrond en Buffer oplossingen voor Colorimetric Analyses enzymactiviteit <ol><li> Bereid 50 mM acetaatbuffer (pH 5,0-5,5) door mengen van 50 ml 0,1 M azijnzuur (2,87 ml ijsazijn op in 500 ml water), 150 ml 0,1 M natriumacetaat en 200 ml gedestilleerd H2O Breng de pH op 5,0-5,5 met 0,1 M azijnzuur indien nodig. </li><li> Bereid een oplossing van 1 M natriumhydroxide (NaOH) in gedestilleerd H2O </li><li> Bereid p-NP verbonden substraatoplossingen in 50 mM acetaatbuffer. Voor het analyseren fosfatase bereiden 5 mM p NP-fosfaat in 50 mM acetaatbuffer, om assay β-glucosidase bereiden 5 mM p NP-β-glucopyranoside, om assay NAGase bereiden 2 mM pNP-β-N-acetylglucosaminide. Bereid alle substraatoplossingen in steriele 15 ml of 50 ml centrifugebuizen. Oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 2-3 weken. </li></ol> 2. Bepaling van een standaard te converteren Absorbance p NP Concentratie <ol><li> Bereid standaardoplossingen van p-nitrofenol in 50 mM acetaatbuffer. Concentraties te variëren ,025-1 mM. </li><li> Overdracht drie replicaten van 100 pi van elke concentratie namelijk 96-well microplaat. Voeg 10 gl 1 M NaOH en 190 gl gedestilleerd H2O aan elk putje. </li><li> Record absorptie bij 410 nm met behulp van een microplaat lezer. </li><li> Vermenigvuldig concentraties in de standaard curve van 0,3 tot umol p NP per 300 ul reactie volume krijgen. Maak een bocht van de absorptie tegen de umol p NP. De helling van de kromme dient als omzettingsfactor (C) die absorptie hebben betrekking op pmol p NP elke enzymreactie. </li></ol> 3. Het uitvoeren van de Enzyme Assay <ol><li> Voor bodem, stelt een suspensie van elk monster worden bepaald in een steriele 15 ml centrifugebuis op concentratie van ongeveer 1 g / ml -1 met 50 mM acetaatbuffer. Voor sedimenten, voeg genoeg acetaat buffer aan de suspensie gemakkelijk pipettable maken. Het juiste volume suspensie nodig zullen variëren afhankelijk van het aantal enzymen getest, maar ten minste 5 ml aanbevolen. Vortex elk slurry totdat alle groepjes van bodem of sediment hebben verspreid en noteer het uiteindelijke volume. </li><li> Opnieuw vortex elk suspensie onmiddellijk pipet 150 pi in elk van zes putjes op 96-well deepwell blok (figuur 1). Het is belangrijk vortex grondig en regelmatig om vuildeeltjes in suspensie te houden. Laat minstens twee putjes per blok leeg te dienen als een substraat controle. Opmerking: clip eind pipetuiteinden met een schaar voorafgaand aan pipetteren als bodem slurries neiging om tips verstoppen. Bereid een 96-wells blok voor elk enzym te worden getest. </li><li> Verdeel ongeveer 5 ml acetaatbuffer een pipet reservoir en gebruik een 8-kanaals pipet 150 ul van de buffer aan de last twee putjes van elk monster (deze zullen monsterbuffer controles) en de twee substraat controleputjes (figuur 1) </li><li> Giet ongeveer 10 ml van de geschikte p NP-substraatoplossing in een pipet reservoir en gebruik een 8-kanaals pipet 150 pi van de substraatoplossing aan de eerste vier putjes van elk monster en de twee substraat controleputjes (figuur 1). Noteer de tijd de reactie begint zodra de substraatoplossing toegevoegd. </li><li> Incubeer de platen bij kamertemperatuur (22 ° C) gedurende 0,5-4 uur. Exact incubatietijd is afhankelijk activiteit in monsters en het enzym worden bepaald. Voor de meeste bodems en sedimenten, fosfatase en β-glucosidase vereisen incubatie tijden van 0,5-1,5 uur, terwijl NAGase en andere enzymen vereisen incubatie tijd van&gt; 2 uur. </li><li> Terwijl assays zijn incubatie bereiden duidelijke 96-putjes te absorptie lezen. Bereid een microplaat voor elke deepwell blok (dwz voor iedere enzyme getest). Pipet 10 ul 1 M NaOH en 190 pi gedestilleerd water in elk putje van de microtiterplaat. Opmerking: NaOH vertraagt ​​de enzymatische reactie en verhoogt de pH die de kleur van de p NP vrijkomt tijdens de reactie verhoogt. </li><li> Na incubatie gecentrifugeerd 96 putjes blocks 2,000-5,000 g gedurende 5 min aan bodemdeeltjes pellet. </li><li> Gebruik een multichannel pipet 100 pi trekken uit elk putje, let daarbij goed op de korrel te vermijden, en overbrengen naar de bijbehorende goed op voorbereid duidelijke 96-putsmicroplaat. </li><li> Zet de microplaatlezer en het opzetten van de nodige software. Record absorptie bij 410 nm. Indien de absorptie van een bepaalde put boven de lineaire detectiegrens van de plaatlezer, die goed verdund 1:01 met water en opnieuw meten. Als absorptie nog te hoog is, moet de test worden herhaald met een kortere incubatietijd. </li></ol> 4. Bepaling van de droge massa van de monsters <ol><li> Pipetteer 1 ml van elk sampl<html> e slurrie in een vooraf gewogen aluminium pan. </li><li> Droog in een 75 ° C droogoven voor 48 uur en weeg. Trek het gewicht van de pan van deze waarde naar het drooggewicht van grond of sediment te vinden in 1 ml van de suspensie. Vermenigvuldigen met een factor 0,15 tot het drooggewicht van het monster te bepalen in de 150 pi aan elk putje toegevoegd in de enzymbepaling. </li></ol> 5. Berekening van de enzymactiviteit per drooggewicht van grond of sediment <ol><li> Bereken eindextinctie van elk monster door het aftrekken van de steekproef controle absorptie van het monster test absorptie. Als substraat controles hebben hoge absorptie (ongeveer&gt; 0.060) aftrekken dan zijn die ook. </li><li> Bereken enzymactiviteit in mmol hr -1 g droge massa -1 uit de vergelijking: </li></ol> Enzymactiviteit = Final absorptie / (C x incubatietijd x monster drogestofgehalte) Fluorescerende Analyse van extracellulaire enzymactiviteit in natuurlijke wateren TLE &quot;&gt; 1. Voorbereiding van de ondergrond, Standard, en Buffer oplossingen voor Fluorometrische Analyses enzymactiviteit <ol><li> Bereid 200 uM oplossingen MUB-gekoppelde substraten (bijv. 4-MUB-β-glucopyranoside, 4-MUB-fosfaat, 4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide) door oplossen van het substraat in geschikte steriele (geautoclaveerd) gedestilleerd H 2 O in steriele 15 ml of 50 ml centrifuge buizen. Wikkel buizen in aluminiumfolie om het licht uit te sluiten en op te slaan in de koelkast voor gebruik. Ondergronden moet stabiel zijn gedurende tenminste 1 week indien opgeslagen op deze manier. </li><li> Bereid een MUB standaard door een voorraadoplossing van 100 uM 4-methylumbelliferon in steriel gedestilleerd H2O In de koelkast bewaren in oranje of folie verpakte fles. Onmiddellijk vóór gebruik verdunnen 100 uM voorraadoplossing van 1/10 in steriel H2O een werkoplossing van 10 pM voor enzym assays maken. </li><li> Bereid een voorraad oplossing van 100 mM bicarbonaat buffer door het oplossen van 8,4 g NaHCO &lt;sub&gt; 3 in 1 LH 2 O en autoclaaf. Verdun deze stamoplossing 1/20 in steriele H 2 O als nodig is om een werkende oplossing van 5 mm voor enzymanalyses maken. </li></ol> 2. Het organiseren van watermonsters op een 96-Well Black Microplaat <ol><li> Dient een microplaat voor elk enzym overeenkomstig de in figuur 2 voorbeeld. Merk op dat het toestaan ​​voor een adequate replicatie, normen en controles, deze procedure kan de activiteit van een enkel enzym assay voor maximaal negen watermonsters op een 96-wells zwarte microtiterplaat. </li><li> Verdeel ongeveer 5 ml van het eerste monster in een reservoir pipet en gebruik een 8-kanaals pipet om pl pipette200 in alle putjes in kolom 1 van de microplaat (s). Gooi gebruikte pipet tips en herhalen als nodig is voor elk watermonster kolommen 1-9 te vullen. </li></ol> 3. Het opzetten van Sample, Standaard, Quench en Ondergrond Controls <ol><li> Opgezet controles om rekening te houden met monsters, standaards, substraat en afschrikken dezelfde zwarte microplaat de monsters (Figuur 2). </li><li> Steekproef controles bevatten monster water en bicarbonaat buffer, en worden niet gebruikt in de activiteit berekeningen maar zal aantonen lezen van coherentie in de loop van het experiment. De demping controles bestaan ​​van het monster water en een standaard bedrag van de tl-tag en worden gebruikt om de diffractie van de fluorescentie in de steekproef van het water te meten. Substraat en standaard controles zijn samengesteld uit of-substraat verbonden of de standaard tl-tag, respectievelijk, en bicarbonaat buffer. </li><li> Verdeel ongeveer 5 ml 5 mM bicarbonaatbuffer in een schone pipet reservoir. Pipetteer 50 ul buffer aan putjes microplaat 1 tot 9 in rijen D en E vormen twee repliceren putjes van monster controles per monster. Verandering pipetuiteinden vervolgens overbrengen 200 ul van bicarbonaat putjes 10 tot en met 12 in Rijen A en H. </li><li> Verminder omgevingslicht door het dimmen of uitschakelen van lights als de tl-standaard is lichtgevoelig. </li><li> Verdeel ongeveer 5 ml 10 uM 4-methylumbelliferon in een schone pipet reservoir. Pipetteer 50 ul in microtiterplaat putjes 1 tot en met 12 in rij H, en in putten 1 tot en met 9 in Rijen G en F tot drie herhalingen van afschrik controles per monster en de algemene standaard controles vormen. Ofwel plaats de microplaat in het donker of bedekken met een ondoorzichtige deksel aan het licht degradatie van MUB verminderen. </li><li> Zet de fluorometer en de set-up van alle benodigde software klaar om te lezen voordat u de ondergrond te zijn. Opmerking: sommige fluormeter bollen kan een warm-up tijd van 3 min of meer nodig. </li><li> Verdeel ongeveer 5 ml van de geschikte MUB-gekoppelde substraat (bijv. 4-MUB-fosfaat) in een schone pipet reservoir. Gebruik een 12-kanaals pipet 50 ul pipet in microtiterplaat putjes 1 tot 12 in rij A en in putten 1 tot 9 in rijen B en C drie replica testen voor elk monster en drie controles substraat vormen. Immediately verder naar stap 4.1, opname fluorescentie. </li></ol> 4. Opnemen Fluorescentie <ol><li> Lees de initiële fluorescentie onmiddellijk na substraat naast de microplaat. Na het lezen van fluorescentie, incubeer de microplaat bij kamertemperatuur (22 ° C), hetzij in het donker of bedekt met een opake deksel lichtdegradatie van MUB verminderen. </li><li> De incubatietijd nodig om de maximale potentiële enzymactiviteit in een watermonster maatregel zal afhangen van de enzymconcentratie in het monster. Aangezien dit niet bekend voordat de test is voltooid, wordt de microplaat moeten worden gelezen op verschillende tijdstippen stappen. Typisch lezen met intervallen van 10-15 min in de loop van 1 uur is aanvaardbaar voor vele enzymen, hoewel monsters met zeer hoge activiteit voor bepaalde enzymen piek bereikt voor 10 minuten. </li><li> Lees verder fluorescentie in de microplaat op de door u tussenpozen gedurende minstens 1 uur. Zorg ervoor dat houden de microplaat bedekt of in het donker tussen lezens. </li></ol> 5. Berekening van de enzymactiviteit per volume water <ol><li> Voor elk monster op elk tijdsinterval berekenen: betekenen eerste steekproef fluorescentie (putten D en E), de gemiddelde uiteindelijke steekproef fluorescentie (putten AC), de gemiddelde standaard fluorescentie (putten H10-11), en de gemiddelde demping controle fluorescentie (wells FG). </li><li> Voor elk tijdsinterval berekenen enzymactiviteit in nmol h -1 -1 ml van de vergelijking: </li></ol> Enzymactiviteit = (gemiddelde monster fluorescentie - bedoel eerste steekproef fluorescentie) / ((gemiddelde standaard fluorescentie / 0,5 mol) x (gemiddelde controle fluorescentie doven / gemiddelde standaard fluorescentie) x (0,2 ml) x (tijd in hr)) <ol start="3"><li> Onderzoek de activiteit worden berekend voor ieder keer stap. Bepaal laatste potentiële activiteit vanaf het moment stap met de hoogste activiteit. Als activiteit waarden blijven stijgen dan later stappen tijd kan nodig zijn, als activiteit waarden vallen throughout het verloop van de run, ren dan weer met kortere tijd stappen. Final activiteit is in nmol substraat verbruikt hr -1 ml -1, maar kan worden opgeschaald om uit te drukken als umol hr -1 L -1. </li></ol>

<ol><li>Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+microbial+cellulose+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Ecology of microbial cellulose degradation.</a> Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood+decomposition+over+a+first-order+watershed%3A+mass+loss+as+a+function+of+lignocellulase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).</li>
<li>Dalal, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+organic+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+agronomy%22%5BJournal%5D)">Soil organic phosphorus.</a> Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resource+allocation+to+extracellular+enzyme+production%3A+a+model+for+nitrogen+and+phosphorus+control+of+litter+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).</li>
<li>Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+p-nitrophenyl+phosphate+for+assay+of+soil+phosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).</li>
<li>Parham, J. A., Deng, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+quantification+and+characterization+of+%CE%B2-glucosaminidase+activity+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil.</a> Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).</li>
<li>Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+heavy+metal+concentrations%2C+microbial+biomass+and+enzyme+activities+in+a+contaminated+grassland+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem.</a> Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).</li>
<li>Olander, L. P., Vitousek, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+soil+phosphatase+and+chitinase+activity+by+N+and+P+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability.</a> Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).</li>
<li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+salinity+and+nutrient+enrichment+on+microbial+assemblages+in+Louisiana+wetland+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Wetlands%22%5BJournal%5D)">Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments.</a> Wetlands. 29, 277-287 (2009).</li>
<li>Hoppe, H. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+exoenzymatic+activities+in+the+ecology+of+brackish+water%3A+measurements+by+means+of+methylumbelliferyl-substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+ecology+progress+series%22%5BJournal%5D)">Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates.</a> Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).</li>
<li>Somville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+study+of+substrate+specificity+of+exoglucosidase+activity+in+eutrophic+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water.</a> Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).</li>
<li>Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorogenic+substrates+for+measuring+enzyme+activity+in+peatlands%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+soil%22%5BJournal%5D)">The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands.</a> Plant and soil. 175, 147-152 (1995).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+analysis+of+riverine+bacterioplankton+production%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+oceanography%22%5BJournal%5D)">Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production.</a> Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).</li>
<li>Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microplate+fluorometric+assay+for+the+study+of+enzyme+diversity+in+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils.</a> Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).</li>
<li>Jackson, C. R., Weeks, A. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+bacterial+community+structure+in+aquatic+sediments+as+revealed+by+16S+rRNA+gene+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis.</a> Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).</li>
<li>Canion, A. K., Ochs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+dynamics+of+freshwater+armored+dinoflagellates+in+a+small+lake+in+Mississippi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+freshwater+ecology%22%5BJournal%5D)">The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi.</a> Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+soil+enzyme+activity+at+global+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+letters%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale.</a> Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).</li>
<li>Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+enzyme+activities+as+indicators+of+organic+matter+processing+rates+in+a+Lake+Erie+coastal+wetland%5BTitle%5D)+AND+%22Freshwater+biology%22%5BJournal%5D)">Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland.</a> Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).</li>
<li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+activity+and+decomposition+of+fine+particulate+organic+matter+in+a+Louisiana+cypress+swamp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+north+american+benthological+society%22%5BJournal%5D)">Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp.</a> Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).</li>
<li>Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+changes+with+depth+in+microbial+communities+in+a+tropical+Malaysian+peat+swamp+forest%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest.</a> Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).</li>
<li>Rietl, A. J., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+ecological+restoration+practices+of+prescribed+burning+and+mechanical+thinning+on+soil+microbial+enzyme+activities+and+leaf+litter+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).</li>
<li>Smart, K. A., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+scale+patterns+in+microbial+extracellular+enzyme+activity+during+leaf+litter+decomposition+in+a+stream+and+its+floodplain%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain.</a> Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Het bepalen van de activiteit van een verscheidenheid van extracellulaire microbiële enzymen in bodems en sedimenten kunnen bruikbare inzichten tarieven voedingsstoffen mineralisatie en organisch materiaal verwerking 17 verschaffen. Echter, kan de bodem variëren in hun vochtgehalte, dus is het belangrijk om te standaardiseren op drooggewicht. Dit vereist een extra droogstap (gewoonlijk twee dagen) dan alleen het meten van enzymactiviteit. Aldus, in tegenstelling tot assays enzymactiviteit in watermonsters die...

Micro-organismen zoals bacteriën en schimmels verkrijgen voedingsstoffen en koolstof uit complexe organische verbindingen door de productie van extracellulaire enzymen. Deze enzymen hydrolyseren typisch polymeren in kleinere subeenheden die in de cel kan worden genomen. Daarom op een ecologisch vlak, deze microbiële extracellulaire enzymen verantwoordelijk voor veel van de voedingsstoffen mineralisatie en afbraak organische materie die voorkomt in de natuur. Enzymen zoals cellobiohydrolase (CBH) en β-glucosidase zijn belangrijk voor degradatie van cellulose en werken samen om de hydrolyse van cellulose tot glucose 1,2, die bruikbaar koolstofsubstraat voor opname en microbiële assimilatie zorgt katalyseren. Het enzym fosfatase releases oplosbare anorganische fosfaatgroepen van organofosfaten, wezen mineralisatie van fosfaat en beschikbaar te maken voor gebruik door de meeste organismen 3. Andere enzymen, zoals N-acetylglucosaminidase (NAGase) zijn important in chitine degradatie en kan zowel koolstof en stikstof beschikbaar voor microbiële overname 4 maken. Een van de procedures voor de bepaling van microbiële extracellulaire enzymactiviteit in de natuur is het gebruik van kunstmatige p-nitrofenyl (p NP) verbonden substraten, een benadering die oorspronkelijk werd ontwikkeld bodem fosfataseactiviteit 5 detecteren. Deze benadering berust op de detectie van een gekleurd eindproduct, p-nitrofenol, dat vrijkomt wanneer de kunstmatig substraat wordt gehydrolyseerd door het geschikte enzym. De p-nitrofenol kan vervolgens colorimetrisch gekwantificeerd door het meten van de absorptie bij ongeveer 400-410 nm. Deze methode is vervolgens toegepast op andere enzymen zoals NAGase 6 detecteren, en is gebruikt in verschillende onderzoeken naar microbiële extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten 7-9. Een alternatieve benadering die originall wasy ontwikkeld om extracellulaire glucosidasewerkzaamheid beoordelen in het aquatisch milieu 10,11 maakt gebruik van 4-methylumbelliferon (MUB) gekoppeld substraten. Het eindproduct uitgebracht (4-methylumbelliferon) is sterk fluorescerende en kan worden gedetecteerd met behulp van een fluorometer met een excitatie / emissie instelling rond 360/460 nm. Diverse MUB-gekoppelde kunstmatige substraten zijn, waardoor de fluorometrische meting van de activiteit van ten minste evenveel enzymen (bijv. β-glucosidase, cellobiohydrolase, NAGase, fosfatase) zoals kan worden bepaald met de p NP-substraat colorimetrische werkwijze. Andere microbiële extracellulaire enzymen, zoals eiwit-afbrekende leucine aminopeptidase kan fluorometrisch worden getest met 7-amino-4-methylcumarine (COU) verbonden substraten. Zowel MUB-en COU-gekoppelde substraten zijn gebruikt om enzymactiviteit te bepalen in verschillende terrestrische en aquatische monsters 12,13. Hoewel eerdere studies hebben descrIBED fluorometrische of colorimetrische microplaat benaderingen van extracellulaire enzymactiviteit 14 te bepalen, er is behoefte aan een duidelijke presentatie van hoe dergelijke tests uit te voeren. Hier laten we procedures voor de high throughput microplaat voor de analyse van extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten met de colorimetrische p-NP verbonden substraten benadering en in natuurlijk water via de fluorescente MUB verbonden substraten techniek. Wij richten ons op de meting van de activiteiten van β-glucosidase, NAGase en fosfatase als deze enzymen respectievelijk kunnen worden gekoppeld aan koolstof, stikstof en fosfor fietsen. Echter, de hier beschreven procedures voor bepaling van andere extracellulaire enzymen met verschillende artificiële substraten.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS EN MATERIALEN</td></tr><tr><td>Glaziale azijnzuur</td><td></td><td></td><td>Verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td></td><td></td><td>Verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td></td><td></td><td>Verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>p-Nitrofenol</td><td>Fisher</td><td>BP612-1</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>p-Nitrofenyl (pNP)-fosfaat</td><td>Sigma</td><td>N3234</td><td>pNP-substraat</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-glucopyranoside</td><td>Sigma</td><td>N7006</td><td>pNP-substraat</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-N-acetylglucosami-nide</td><td>Sigma</td><td>N9376</td><td>pNP-substraat</td></tr><tr><td>Duidelijke 96-well microplates</td><td>Fisher</td><td>12-563-301</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>96-well deep well-blokken</td><td>Costar</td><td>3958</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Aluminium weegschalen</td><td></td><td></td><td>Verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Steriele 15 ml centrifugeerbuisjes</td><td></td><td></td><td>Verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Steriele 50 ml centrifugeerbuisjes</td><td></td><td></td><td>Verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferoon</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl (MUB)-fosfaat</td><td>Sigma</td><td>M8883</td><td>MUB-substraat</td></tr><tr><td>4-MUB-glucopyranoside</td><td>Sigma</td><td>M3633</td><td>MUB-substraat</td></tr><tr><td>4-MUB-N-acetylglucosami-nide</td><td>Sigma</td><td>M2133</td><td>MUB-substraat</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td></td><td></td><td>Verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Zwarte 96-well microplate</td><td>Costar</td><td>3792</td><td></td></tr><tr><td>Pipetreservoir</td><td></td><td></td><td>Verschillende leveranciers</td></tr><tr><td colspan="4">APPARATUUR</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge rotor</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-81</td><td>Voor microplates/deep-well blokken</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Microplate fluorometer</td><td>BioTek</td><td>FLx 800</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>8-kanaals pipettor</td><td></td><td></td><td>Verschillende leveranciers</td></tr></tbody></table>

bepaling van microbiële extracellulaire enzymactiviteit in waters, bodem en sedimenten behulp high throughput microplaat testen

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Een groot deel van de cycli van nutriënten en koolstof verwerking in natuurlijke omgevingen gebeurt door de activiteit van extracellulaire enzymen vrij door micro-organismen. Zo kan het meten van de activiteit van deze extracellulaire enzymen inzicht te geven in de tarieven van de ecosysteem-niveau processen, zoals afbraak van organisch materiaal en stikstof en fosfor mineralisatie. Testen van extracellulaire enzymactiviteit in milieu monsters gewoonlijk uit het blootstellen van de monsters naar kunstmatige colorimetrische of fluorometrische substraten en het bijhouden van de snelheid van substraathydrolyse. Hier beschrijven we microplaat-methoden, voor deze procedures die de analyse van grote aantallen monsters binnen een kort tijdsbestek mogelijk te maken. Monsters worden reageren met kunstmatige substraten in 96 putjes microplaten of diepe microplaat blokken en enzymactiviteit wordt vervolgens bepaald door absorptie of fluorescentie van het verkregen eindproduct met een typische microplaat lezer of fluorometer. Dergelijke hoge throughput procedures niet alleen vergelijkingen tussen ruimtelijk verschillende plaatsen of ecosystemen vergemakkelijken, maar ook de kosten van dergelijke tests aanzienlijk beperken door algemene reagensvolumes nodig per monster.

Bodems en waterbodems hebben meestal aanzienlijke niveaus van extracellulaire enzymactiviteit als gevolg van de bijgevoegde microbiële gemeenschappen (biofilms) groeien op het oppervlak van deeltjes. Figuur 3 toont hoe deze activiteit is afhankelijk van de grootte van de deeltjes verkregen bij het ​​oppervlak sediment van een derde orderstroom in het noorden van Mississippi, USA. Een eerdere studie heeft aangetoond dat de bacteriële gemeenschappen sedimentpartikels van deze stroom kan worden gescheiden ...

Microplaat procedures beschreven voor de colorimetrische of fluorometrische analyse van extracellulaire enzymactiviteit. Deze procedures zorgen voor de snelle bepaling van een dergelijke activiteit in grote aantallen milieu-monsters er binnen afzienbare tijd frame.

Bepaling van Microbiële extracellulaire enzymactiviteit in Waters, bodem en sedimenten behulp High Throughput Microplaat Testen

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Het algemene doel van de volgende procedure is om de extracellulaire enzymactiviteit van microben in diverse natuurlijke omgevingen snel te analyseren. Dit wordt bereikt door monsters van water of bodemsuspensies aan een microplaat toe te voegen om voldoende replicatie te verkrijgen. Als tweede stap wordt een kunstmatig colorimetrisch of fluorometrisch substraat aan de putjes van de microplaat toegevoegd, waardoor enzymatische reacties kunnen plaatsvinden. Vervolgens wordt de absorbentie of fluorescentie gemeten om de hoeveelheid eindproduct te bepalen die tijdens de reactie is vrijgekomen.De resultaten tonen verschillen in extracellulaire enzymactiviteit tussen monsters aan op basis van de absorptie of fluorescentie van de uiteindelijke reactie. Vandaag gaan we demonstreren hoe de extracellulaire enzymactiviteit in natuurlijke omgevingen kan worden gemeten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de microbiële ecologie, zoals de snelheid van organische stofverwerking in water en nutriëntenmineralisatie in bodems, sedimenten en wateren. Over het algemeen hebben mensen die nieuw zijn in het gebruik van deze methode moeite met het scheiden van deeltjes van de r

determination-microbial-extracellular-enzyme-activity-waters-soils

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Dit protocol beschrijft een high throughput scherm voor cellulolytische activiteit van een metagenomic bibliotheek uitgedrukt in Escherichia coli. Het scherm is oplossing gebaseerd en sterk geautomatiseerde, en maakt gebruik van een-pot chemie in 384 goed microtiterplaten met de uiteindelijke uitlezing als een absorptie meting.

Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken

Beschrijven we een low cost, high throughput methode voor het screenen op schimmels endoglucanase activiteit...

High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em

This video demonstrates an assay for screening antimicrobial compounds that efficiently eliminate biofilms using a peg-plate. The methodology monitors the biofilm's metabolic state after treatment with antimicrobial compounds, facilitating the determination of the minimum biofilm eradication concentration.

A Peg Plate Biofilm Assay for Screening Antibacterial Agents

Om mogelijke tarieven van de bodem extracellulair enzym activiteiten te meten, zijn synthetische substraten die zijn gebonden aan een fluorescerende kleurstof toegevoegd aan bodemmonsters. De enzymactiviteit wordt gemeten als de fluorescerende kleurstof wordt vrijgemaakt uit het substraat door een enzym gekatalyseerde reactie, waarbij hoger fluorescentie geeft meer substraat afbraak.

High-throughput Fluorometrische Meting van Potentiële Soil Extracellular Enzyme Activiteiten

Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Hier presenteren we protocollen om snel enzymen te screenen en te karakteriseren op antimicrobiële activiteit. De microslide-diffusietest en de kleurstof-releasetest maken gebruik van doelbacteriële substraten voor kwalitatieve en kwantitatieve evaluatie van enzymatische activiteit.

Kwalitatieve en Kwantitatieve Testen voor detectie en karakterisering van proteïne Antimicrobials

Dit werk presenteert een methode voor hoogdoorvoerscherming met behulp van een universeel genetisch enzymschermingssysteem dat theoretisch kan worden toegepast op meer dan 200 enzymen. Hier identificeert het enkele schermsysteem drie verschillende enzymen (lipase, cellulase en alkalische fosfatase) door eenvoudigweg het gebruikte substraat te veranderen (p-nitrofenylacetaat, p-nitrofenyl-α-D-cellobioside en fenylfosfaat).

Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System

Een high-throughput assay voor enzymscreening wordt beschreven. Deze multiplexed, gebruiksklare assaykit bestaat uit vooraf gekozen Chromogene Polymer Hydrogel (CPH) substraten en complexe Insoluble Chromogene Biomass (ICB) substraten. Doelenzym zijn polysacharide-afbrekende endo-enzymen en proteasen.

High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

Presenteren we een protocol voor snelle screening van milieu monsters voor siderofoor potentieel bijdragen aan micronutriënt biologische beschikbaarheid en omzet in terrestrische systemen.

Siderofoor High-throughput Screening van milieu monsters: plantaardige weefsels, Bulk bodems en rhizosfeer bodems

De co-cultuur interactie testen gepresenteerd in dit protocol zijn goedkoop, hoge doorvoer, en eenvoudig. Deze testen kunnen worden gebruikt om microbiële interacties in co-cultuur te observeren, interactie patronen te identificeren en het remmende potentieel van een microbiële stam van belang tegen menselijke en milieu pathogenen te karakteriseren.

Co-Culture-tests met hoge doorvoer voor het onderzoek naar microbiële interacties

Leer microbiële extracellulaire enzymactiviteit bepalen in water, bodem en sedimenten met behulp van high-throughput microplaat testen. Deze methode versnelt onderzoek naar organisch materiaal verwerking.

Bepaling van Microbiële extracellulaire enzymactiviteit in Waters, bodem en sedimenten behulp High Throughput Microplaat Testen

Meer video's verkennen