Bepaling van Microbiële extracellulaire enzymactiviteit in Waters, bodem en sedimenten behulp High Throughput Microplaat Testen

Het algemene doel van de volgende procedure is om de extracellulaire enzymactiviteit van microben in diverse natuurlijke omgevingen snel te analyseren. Dit wordt bereikt door monsters van water of bodemsuspensies aan een microplaat toe te voegen om voldoende replicatie te verkrijgen. Als tweede stap wordt een kunstmatig colorimetrisch of fluorometrisch substraat aan de putjes van de microplaat toegevoegd, waardoor enzymatische reacties kunnen plaatsvinden. Vervolgens wordt de absorbentie of fluorescentie gemeten om de hoeveelheid eindproduct te bepalen die tijdens de reactie is vrijgekomen.

De resultaten tonen verschillen in extracellulaire enzymactiviteit tussen monsters aan op basis van de absorptie of fluorescentie van de uiteindelijke reactie. Vandaag gaan we demonstreren hoe de extracellulaire enzymactiviteit in natuurlijke omgevingen kan worden gemeten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de microbiële ecologie, zoals de snelheid van organische stofverwerking in water en nutriëntenmineralisatie in bodems, sedimenten en wateren. Over het algemeen hebben mensen die nieuw zijn in het gebruik van deze methode moeite met het scheiden van deeltjes van de reactieoplossing, vooral bij het analyseren van een groot aantal monsters.

Een visuele demonstratie van deze procedure is essentieel, aangezien een plaatindeling moeilijk aan te leren kan zijn en het uitvoeren van metingen op meerdere tijdstippen deze procedure uitdagender kan maken. De colorimetrische analyse van extracellulaire enzymactiviteit voor bodems en sedimenten begint met de bereiding van de substraatbuffer en standaardoplossingen zoals beschreven in het tekstprotocol voor bodem; bereid voor elk te analyseren monster een slurry in een steriele centrifugebuis van 15 milliliter. Voeg voor sedimenten een concentratie van ongeveer één gram per milliliter toe met gebruik van 50 millimolar acetaatbuffer.

Voeg voldoende acetaatbuffer toe om de slurry gemakkelijk pipetteerbaar te maken. Het exacte benodigde volume slurry varieert afhankelijk van het aantal te analyseren enzymen, maar een minimum van vijf milliliters wordt aanbevolen. Vortex elke slurry totdat alle klonten grond of sediment zijn gedispergeerd.

En noteer het eindvolume. Knip de uiteinden van de pipetpunten met een schaar af vóór het pipetteren. Omdat bodemsuspensies de neiging hebben om de punten te verstoppen, dient elke suspensie opnieuw gevortexd te worden, waarna direct 150 µL in elk van de zes wells wordt gepipetteerd.

In een 96-well deep well block. Het is belangrijk om grondig en regelmatig te vortexen. Om bodemdeeltjes in suspensie te houden, moeten er per block ten minste twee wells leeg blijven om als substraatcontrole te dienen.

Bereid voor elk te analyseren enzym één blok van 96 putjes voor. Giet ongeveer vijf milliliter acetaatbuffer in een pipetreservoir en gebruik een achtkanals pipet om 150 microliters van de buffer toe te voegen aan de laatste twee putjes van elk monster.

Voor de monsterbuffercontroles en de twee substraatcontroleputjes. Giet ongeveer 10 milliliters van de geschikte p nitro fennel of PNP substraatoplossing in een pipetreservoir en gebruik een achtkanalige pipet om 150 microliters van de substraatoplossing toe te voegen aan de eerste vier putjes van elk monster en aan de twee substraatcontroleputjes. Noteer het tijdstip waarop de reactie begint, direct nadat de substraatoplossing is toegevoegd.

Incubeer de platen gedurende 0,5 tot vier uur bij kamertemperatuur. De exacte incubatietijd varieert afhankelijk van het activiteitsniveau in de monsters en het te analyseren enzym. Terwijl de assays incuberen, wordt één transparante 96-wells microplate klaargemaakt.

Pipette voor elk deep well-blok, om de absorptie te kunnen meten, 190 µL gedestilleerd water en 10 µL één molar natriumhydroxide in elke well van de microplate. Natriumhydroxide vertraagt de enzymatische reactie en verhoogt de pH, wat de kleur van het tijdens de reactie na incubatie vrijgekomen PNP versterkt. Centrifugeer de 96-wells blokken bij 2000 tot 5 000 ×g gedurende vijf minuten om bodemdeeltjes te pelletteren.

Het verwijderen van de vloeistof zonder het pellet te verstoren kan een uitdaging zijn. Men moet voorkomen dat er aanvankelijk te veel bodemmonster wordt gebruikt. Zorg ervoor dat er lang genoeg wordt gecentrifugeerd en gebruik een voorzichtige maar resolute beweging om de vloeistof af te nemen.

Gebruik een meerkanaals pipet om 100 µL uit elke well op te nemen, waarbij u er zorgvuldig op let dat u de pellet vermijdt. Overbreng de vloeistof naar de overeenkomstige well op een voorbereide transparante 96-well microplate. Zet de microplate-reader aan en configureer de benodigde software. Registreer de absorbentie bij 410 nm. Na bepaling van de droge massa van de monsters, zoals beschreven in het tekstprotocol, berekent u de uiteindelijke absorbentie van elk monster door de absorbentie van de monstercontrole af te trekken van de absorbentie van de monsteranalyse.

Als de substraatcontroles een hoge absorbentie van meer dan 0,060 hebben, trek deze dan af. Bereken vervolgens de enzymactiviteit in micromol per uur per gram droge massa met behulp van deze vergelijking. Nadat een zwarte microplate voor elk enzym is ingericht volgens het voorbeeld in het tekstprotocol, giet u ongeveer vijf milliliter van het eerste watermonster in een pipetreservoir en gebruikt u een achtkanalige pipet om 200 microliters in alle wells te pipetteren.

Gebruik in kolom één van de microplaat wegwerppipetpunten en herhaal dit indien nodig voor elk watermonster om de kolommen één tot en met negen te vullen. Stel controles in voor monsters, standaarden, substraat en quenching op dezelfde zwarte microplaat als de monsters. Monstercontroles bevatten monstertwater en bicarbonaatbuffer en worden niet gebruikt in de activiteitsberekeningen, maar dienen om de consistentie van de metingen gedurende het experiment aan te tonen.

De quench-controles bestaan uit monsterwater en een standaardhoeveelheid van de fluorescente tag en worden gebruikt om de diffractie van fluorescentie te meten. De substraat- en standaardcontroles in monsterwater worden samengesteld uit respectievelijk het gekoppelde substraat of de standaard fluorescente tag en bicarbonaatbuffer. Giet ongeveer vijf milliliter vijf millimolaire bicarbonaatbuffer in een schoon pipetreservoir.

Pipetteer 50 µL buffer in de microplate-wells één tot en met negen in de rijen d en e om twee replica-wells van monstercontroles per monster te vormen; ververs de pipetpunten en breng vervolgens 200 µL bicarbonaatbuffer over naar wells 10 tot en met 12 in de rijen A en H. Hoewel het licht in deze demonstratie voor filmoefeningen fel blijft, moet de omgevingsverlichting worden verminderd door lichten te dimmen of uit te schakelen, aangezien de fluorescerende standaard lichtgevoelig is. Giet ongeveer 5 mL 10 µM 4-methylumbelliferone of MUB in een schoon pipetreservoir en pipetteer 50 µL in microplate-wells één tot en met 12 in rij H. Pipetteer vervolgens 50 µL in wells één tot en met negen in de rijen G and F om drie replica's van quench-controles per monster en algemene standaardcontroles te vormen. Plaats de microplate in het donker of dek deze af met een ondoorzichtig deksel om lichtdegradatie van MUB te verminderen; schakel de fluorimeter in en configureer de benodigde software zodat deze klaar is voor de uitlezing voordat het substraat wordt toegevoegd.

Breng ongeveer vijf milliliter van het geschikte MUB-gecoate substraat over in een schoon pipetreservoir. Gebruik een 12-kanaals pipet om 50 µL te pipetteren in de microplaatputjes 1 tot en met 12 in rij A en in putjes 1 tot en met 9 in de rijen B en C, om zo drie replicate assays voor elk monster en drie substraatcontroles te vormen. Ga onmiddellijk over tot het registreren van de fluorescentie. Lees de initiële fluorescentie direct na toevoeging van het substraat aan de microplaat af. Incubeer de microplaat na het uitlezen van de fluorescentie op kamertemperatuur, in het donker of afgedekt met een ondoorzichtig deksel.

Om lichtdegradatie van MUB te verminderen. De incubatietijd die nodig is om de maximale potentiële enzymactiviteit te meten, is afhankelijk van de enzymconcentratie in een monster. Omdat dit onbekend is, moet de microplaat op meerdere tijdstippen worden uitgelezen voordat het monster wordt geanalyseerd.

Voor de meeste enzymen is een interval van 10 tot 15 minuten gedurende een uur passend, hoewel sommige monsters met hoge concentraties vóór 10 minuten hun piek bereiken. Ga door met het meten van de fluorescentie in de microplaat met de aangegeven intervallen gedurende ten minste een uur. Zorg ervoor dat de microplaat tussen de metingen door afgedekt blijft of in het donker wordt bewaard.

Bereken voor elk monster bij elk tijdsinterval de gemiddelde initiële monsterfluorescentie, de gemiddelde uiteindelijke monsterfluorescentie, de gemiddelde standaardfluorescentie en de gemiddelde quench-controlefluorescentie voor elk tijdsinterval. Bereken de enzymactiviteit in m per uur per milliliter met behulp van de vergelijking in het tekstprotocol.

Bestudeer de berekende activiteitswaarden voor elke tijdstap en bepaal de uiteindelijke potentiële activiteit op basis van de tijdstap met de hoogste activiteit. Als de activiteitswaarden blijven stijgen, kunnen latere tijdstappen noodzakelijk zijn. Als de activiteitswaarden gedurende de gehele run dalen, voer de run dan opnieuw uit met kortere tijdstappen.

Bodemgronden en aquatische sedimenten vertonen doorgaans aanzienlijke niveaus van extracellulaire enzymactiviteit als gevolg van gehechte microbiële gemeenschappen die groeien op het oppervlak van partikels. Deze figuur laat zien hoe deze activiteit verandert afhankelijk van de grootte van de partikels die zijn verkregen uit het oppervlaksediment van een beek van de derde orde in het noorden van Mississippi, USA. Een eerdere studie heeft aangetoond dat de bacteriële gemeenschappen op sedimentpartikels uit deze beek kunnen worden onderverdeeld in drie verschillende groepen op basis van moleculaire analyse van hun gemeenschapsstructuur.

Die op 0,063 millimeter deeltjes, die op 0,125, 0,25 en 0,5 millimeter deeltjes en die op één millimeter deeltjes. Analyse van patronen in extracellulaire enzymactiviteit ondersteunt deze conclusie, waarbij fosfatase vergelijkbaar is op 0,125, 0,25 en 0,5 millimeter deeltjes, maar veel hoger is op de fracties van één en 0,063 millimeter wanneer gemeten met de PNP-gekoppelde substraattechniek. Andere enzymen, zoals bèta-glucoside en nAGAs, vertonen vergelijkbare pieken op de fijnste deeltjes, maar zijn niet verhoogd op de één millimeter deeltjes.

Hierbij wordt benadrukt dat verschillende enzymen verschillende omgevingsverdelingen kunnen vertonen en dat deze met deze assay kunnen worden opgehelderd. De relatief kleine foutenbalken tonen aan dat colorimetrische assays van enzymactiviteit in sedimenten reproduceerbaar zijn en derhalve geschikt voor statistische analyse. Bij het vergelijken van verschillende milieu-monsters vertonen natuurlijke wateren doorgaans een lagere extracellulaire enzymactiviteit per milliliter dan bodems of sedimenten per gram.

Daarom moeten ze fluorimetrisch worden bepaald met behulp van MUB-gekoppelde substraten. Deze figuur laat zien hoe de activiteit van de enzymen fosfatase, bètaglucosidase en NGA's varieert met de diepte. In een ondiep meer in het noorden van Mississippi, VS, staat bekend dat het meer nutriëntenarm is, wat ook wordt gesuggereerd door de relatief hoge activiteit van fosfatase en enzymen die micro-organismen produceren om fosfaat uit organische verbindingen te verkrijgen.

Voor alle drie de enzymen vertoonden assay-monsters die werden verzameld aan het wateroppervlak en op 50 centimeter diepte een vergelijkbare activiteit. Hoewel de activiteit in het monster van 100 centimeter verhoogd was, werd dit monster in essentie genomen van de interface tussen het water en het sediment; de aanwezigheid van sedimentdeeltjes in het monster verklaart waarschijnlijk de hogere activiteit die in dit monster werd waargenomen, met name voor beta-glucco en n-AGA's. Net als bij de PNP-substraten laten de kleine foutbalken zien dat de reproduceerbaarheid van fluorometrische assays met MUB-substraten hoog is, zelfs met slechts drie herhaalde metingen.

Let op dat de eenheden voor de enzymactiviteit van watermonsters in nmol geconsumeerd substraat zijn, terwijl die voor de enzymactiviteit op sedimentdeeltjes in micromol geconsumeerd substraat zijn, ook al is de grootte per eenheid vergelijkbaar. Dit benadrukt het feit dat bodems en sedimenten doorgaans een veel hogere extracellulaire activiteit vertonen dan natuurlijk water. Het demonstreert tevens de verhoogde gevoeligheid van de MUB-gekoppelde substraattechniek en de noodzaak om deze techniek te gebruiken voor het bepalen van de extracellulaire enzymactiviteit in watermonsters zodra men hierin vaardig is geworden.

Deze techniek kan worden gebruikt om negen watermonsters op enzymen te analyseren in iets meer dan een uur. Bij het uitvoeren van deze procedure voor bodems en sedimenten is het belangrijk om een bekend massa-materiaal te gebruiken, zodat de activiteit op basis van het drooggewicht kan worden uitgedrukt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u extracellulaire enzymactiviteit in diverse natuurlijke omgevingen kunt meten met behulp van colorimetrische of fluorimetrische technieken.