Inleiding tot fluorescentiemicroscopie

Fluorescentie is een fenomeen dat optreedt wanneer een stof licht absorbeert bij een bepaalde golflengte en licht uitzendt bij een andere golflengte. Fluorescentie vindt plaats wanneer een elektron, dat is aangeslagen naar een hogere en instabielere energietoestand, terugkeert naar zijn grondtoestand en daarbij een foton licht afgeeft. Het licht dat verantwoordelijk is voor de excitatie, of het brengen van het elektron naar een hogere energietoestand, heeft een kortere golflengte en een hogere energie dan de fluorescentie-emissie, die een langere golflengte, een lagere energie en een andere kleur heeft.

Fluorescentiemicroscopie combineert de vergrotende eigenschappen van de lichtmicroscoop met fluorescentietechnologie die de excitatie van en detectie van emissies door fluorforen — fluorescerende chemische verbindingen — mogelijk maakt. Met fluorescentiemicroscopie kunnen wetenschappers de locatie van specifieke celtypen binnen weefsels of moleculen binnen cellen observeren.

De belangrijkste componenten van de fluorescentiemicroscoop vertonen een grote overlap met die van de traditionele lichtmicroscoop. De twee belangrijkste verschillen zijn echter het type lichtbron en het gebruik van gespecialiseerde filterelementen.

Fluorescentiemicroscopie vereist een zeer krachtige lichtbron, zoals een xenon- of kwikdamplamp, zoals hier getoond. Het licht dat door de kwikdamplamp wordt uitgezonden, is 10-100 keer helderder dan dat van de meeste gloeilampen en biedt licht in een breed golflengtebereik, van ultraviolet tot infrarood. Deze krachtige lichtbron is het gevaarlijkste onderdeel van de opstelling van de fluorescentiemicroscoop, aangezien direct kijken in ongefilterd licht uw netvliezen ernstig kan beschadigen en onjuiste behandeling van de lampen kan leiden tot explosies.

Het principe achter fluorescentiemicroscopie is eenvoudig. Wanneer het licht de booglamp verlaat, wordt het door een excitatiefilter geleid, dat de excitatiegolflengte selecteert.

Dit licht wordt door een speciale spiegel, een dichroïsche spiegel genoemd, naar het monster gereflecteerd; deze spiegel is zo ontworpen dat hij alleen licht bij de excitatiegolflengte reflecteert. Het gereflecteerde licht passeert het objectief, waar het op het fluorescerende preparaat wordt gefocust. De emissies van het preparaat worden vervolgens weer terug via het objectief geleid – waar de vergroting van het beeld plaatsvindt – en nu door de dichroïsche spiegel.

Dit licht wordt gefilterd door het barrièrefilter, dat de emissiegolflengte selecteert en storend licht van de booglamp of andere bronnen dat reflecteert op de microscoopcomponenten wegfiltert. Ten slotte wordt de gefilterde fluorescentie-emissie naar een detector gestuurd waar het beeld gedigitaliseerd kan worden, of het wordt doorgegeven aan het oculair voor optische waarneming.

Het excitatiefilter, de dichroïsche spiegel en het barrièrefilter kunnen samen worden geassembleerd in een component die bekend staat als de filterkubus. Tijdens het bekijken van het preparaat kunnen verschillende filterkubussen worden gewisseld om de excitatiegolflengte te veranderen, en een reeks diafragma's kan worden gebruikt om de intensiteit van de excitatie aan te passen.

Bij het uitvoeren van fluorescentiemicroscopie kan de fluorofoor net zo belangrijk zijn als de microscoop zelf, en het type fluorofoor dat wordt afgebeeld bepaalt de gebruikte excitatiegolflengte en de gedetecteerde emissiegolflengte. De excitatiegolflengten bevatten een klein bereik aan energieën die door de fluorofoor kunnen worden geabsorbeerd, waardoor deze overgaat in een aangeslagen toestand. Eenmaal aangeslagen zijn er diverse emissies mogelijk, of overgangen terug naar de energietoestand met een lager niveau, wat resulteert in een emissiespectrum.

Het verschil tussen de piek van de absorptie- of excitatiecurve en de piek van de emissiecurve staat bekend als de Stokes-verschuiving. Hoe groter de afstand in deze verschuiving, hoe gemakkelijker het is om de twee verschillende golflengten te scheiden. Bovendien moet elk overlappend spectrum worden verwijderd door de componenten van de filterkubus voor een verminderde achtergrond en een verbeterde beeldkwaliteit.

Blootstelling van de fluorofoor aan langdurige excitatie zal leiden tot fotobleken, wat een verzwakking of verlies van fluorescentie is. Om fotobleken te verminderen, kan een anti-fade montagemedium aan de slide worden toegevoegd en kunnen de randen met nagellak worden afgedicht. De slide moet tevens in het donker worden bewaard wanneer deze niet wordt afgebeeld.

Om te beginnen met fluorescentiebeeldvorming, schakelt u de xenon- of kwiklichtbron in en laat u deze tot 15 minuten opwarmen zodat een constante verlichting wordt bereikt.

Plaats vervolgens uw monster op de objecttafel en zet dit vast. Schakel daarna de witlichtbron van uw microscoop in. Stel de scherpstelling op uw monster in met het objectief met de laagste vergroting door de grove en fijne focusknop aan te passen. Gebruik vervolgens de knoppen voor de tafelverstelling om het gebied van interesse te vinden.

Schakel daarna de witlichtbron uit, evenals onnodige kamerverlichting, om de achtergrondruis te verminderen.

Selecteer de juiste filterkubus voor de kleurstof die u beeldt en open de sluiter om uw monster te verlichten.

Maak tot slot fijne focusaanpassingen en richt het uitgangslicht op de beeldvormingscamera. U zult waarschijnlijk de belichtingstijd moeten aanpassen voor elke gebruikte fluorofoor of fluorescerende kleurstof. Het is echter belangrijk om de belichtingstijd constant te houden bij het vergelijken van kenmerken met dezelfde kleurstof op verschillende monsters.

Om meerdere kleurstoffen op hetzelfde monster in beeld te brengen, wijzigt u de filterkubus zodat deze overeenkomt met elke fluorofoor en legt u het nieuwe beeld vast.

Nadat elke kleurstof in het monster is vastgelegd, kunnen de afzonderlijke beelden over elkaar worden gelegd en worden samengevoegd.

Veel verschillende soorten experimenten maken gebruik van fluorescentiemicroscopie en maken gebruik van verschillende typen fluoroforen. Een van de meest voorkomende toepassingen van fluorescentiemicroscopie is de beeldvorming van eiwitten die zijn gelabeld met antilichamen die zijn gekoppeld aan, of "geconjugeerd" met, fluorescerende verbindingen. Hier werd een antilichaam tegen leptospirale oppervlakte-eiwitten gedetecteerd met behulp van een secundair antilichaam geconjugeerd aan alexafluor-488, dat groen fluoresceert bij excitatie.

Een andere manier om een specifiek kenmerk met fluorescentie te accentueren, is door de code voor een fluorescent eiwit, zoals groen fluorescent eiwit, of GFP, te integreren in het DNA van een organisme. Het gen voor GFP werd oorspronkelijk geïsoleerd uit kwallen en kan worden tot expressie gebracht, of geproduceerd, door gecultiveerde cellen als reactie op specifieke triggers of als onderdeel van een specifiek celtype, zoals de tumorcellen die gloeiend in deze afbeelding worden getoond

Een andere toepassing van fluorescentie-beeldvorming is Fluorescence Speckle Microscopy, een technologie die gebruikmaakt van fluorescent gelabelde macromoleculaire complexen, zoals het hier getoonde F-actine-netwerk, om de beweging en omzettingkinetiek van dit belangrijke cytoskelet-eiwit te bestuderen.

Een geavanceerde techniek genaamd Fluorescence recovery after photobleaching, of FRAP, wordt uitgevoerd door opzettelijk een klein gebied van een monster te fotobleken om de diffusiesnelheid van fluorescent gelabelde moleculen terug naar het gefotobleekte gebied te monitoren.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over fluorescentiemicroscopie bekeken.

In deze video hebben we geleerd over het concept van fluorescentie, hoe fluorescentiemicroscopie verschilt van lichtmicroscopie en hoe u een fluorescentiebeeld via de microscoop maakt. We hebben ook geleerd over enkele basis- en geavanceerde toepassingen die gebruikmaken van fluorescentie. Bedankt voor het kijken en vergeet niet dat fotobleken er weliswaar goed uitziet op uw tanden, maar niet bepaald gunstig is voor uw monsters.