Name: Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: Leer een vergelijkende interactomics-aanpak voor pathogeen-gastheer eiwit-eiwit interacties met behulp van Y2H en HT-GPCA. Deze methode identificeert genotype-specifieke biomarkers en therapeutische doelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd mede ondersteund door de financiering van het Institut Pasteur en door subsidies van de Ligue nationale contre le Cancer (subsidies R05/75-129 en RS07/75-75), de Association pour la Recherche sur le Cancer (subsidies ARC A09 / 1/5031 en 4867), en het Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 en ANR09 MIEN 026 01). MM was een ontvanger van een MENRT fellowship.

1. Gist twee-hybride Screenings <ol><li> Maak de volgende gewenste oplossingen: <ol><li> Volledige Synthetische Drop Out (SD): los 26,7 g minimale SD basis met glucose in 1 L water. Voeg 2 g aminozuurmengsel als volgt bereid: 2 g adenine hemisulfaat, 2 g Arginine HCl, 2 g Histidine HCl, 2 g Isoleucine, Leucine 4 g, 2 g Lysine HCl, 2 g methionine, fenylalanine 3 g, 2 g L -Serine, 2 gram L-Threonine, 3 g tryptofaan, 2 g Tyrosine, 1,2 g Uracil, 9 g Valine. </li><li> Selectieve Drop Out SD-L/-W/-H: SD bevatten alle essentiële aminozuren, behalve die welke in deze (-L:-Leucine;-W:-tryptofaan;-H:-histidine). </li><li> YPGLU: voor 1 L, gewicht 10 g gistextract, 10 g Bacto pepton en 20 g glucose. Compleet met 25 g Bacto agar voor vaste media. </li><li> YCM: Zelfde als YPGLU, maar pH op 4,5. </li></ol></li><li> Paring en het verspreiden <ol><li> Gebruik ingevroren aliquots van pre-transformatieed giststam Y187 (mating type α) die een cDNA bibliotheek gekloneerd in pACT2. Controleer levensvatbaarheid van de cellen door plateren seriële verdunningen op SD-L platen. </li><li> Kloon van de ziekteverwekker ORF in pGBKT7 vector, en transformeren de recombinant plasmide met behulp van een standaard procedure in AH109 giststam (type paring a). </li><li> Spread pGBKT7-getransformeerde AH109 gist op SD-W platen. Incubeer minstens twee dagen 30 ° C in een bevochtigde incubator. Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C totdat de twee-hybride screening. </li><li> Gebruik 3-aminotriazool (3-AT), een competitieve remmer van het enzym HIS3, het potentieel zelf-transactivatie van het HIS3-reportergen tegen de pathogenen eiwitten. Voer een auto-activatie test door bepaling van de concentratie van 3-AT, die de groei van pGBKT7-getransformeerde gist voorkomt op SD-W/-H platen. </li><li> Zaad 30 ml SD-W met enkele kolonies van pGBKT7-getransformeerde AH109. Incubeer 30 uur bij 30 ° C met rotatie. </li><li> Zaad 200 ml SD-W met 30 mlde AH109 culturen. Incubeer bij draaiing over 20 uur bij 30 ° C. </li><li> Incubeer ontdooid cDNA-getransformeerde Y187 in 20 ml YPGLU, incubeer 10 min bij 30 ° C met rotatie. </li><li> Centrifugeer een volume van pGBKT7-getransformeerde AH109 cultuur overeenkomend met het aantal levensvatbare gistcellen Y187 gedurende 5 min bij 3500 rpm bij 20 ° C. Zuig het supernatant en resuspendeer pellet in 10 ml YPGLU. </li><li> Meng de geresuspendeerde AH109 gist met Y187 bevattende bibliotheek. Overbrengen in een 50 ml buis. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 3500 rpm bij 20 ° C, zuig supernatant (breekbaar pellet). </li><li> Resuspendeer pellet in YPGLU een totaal van 1,5 ml te krijgen. </li><li> Spread gist op 3 YCM-Agar platen van 150 mm, 0,5 ml / plaat. Incubeer 4,5 uur bij 30 ° C. </li><li> Verzamel gedekt gist uit YCM platen door schrapen met een hark glas in 10 ml SD-L/-W/-H. Spoel de platen twee keer met 5 ml SD-L/-W/-H medium en het zwembad. </li><li> Centrifugeer 5 minuten bij 3500 rpm, 20° C. Gooi supernatant en resuspendeer de gist pellet in 5 ml SD-L/-W/-H medium. </li><li> Verspreid gedekt gist op tot 10 platen (0,5 ml / plaat) van SD-L/-W/-H Agar aangevuld met de juiste concentratie van 3-aminotriazool (3-AT) bepaald in de auto-activatie test. Incubeer bij 30 ° C in een vochtige atmosfeer gedurende 6-10 dagen. </li><li> Bepaal de diploïde (2n) tarief om paring efficiëntie te evalueren door het verspreiden van 250 ul van seriële verdunningen (10 -4 tot 10 -6) van de gedekt gistsuspensie op SD-L/-W platen. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende twee dagen. Rekenen kolonies gegroeid op SD-L/-W, en afleiden van de totale diploïde aantal aanwezig in het oorspronkelijke volume van paarde gist. Meld deze diploïde aantal levensvatbare bibliotheek-bevattende gist nummer om de diploïde berekenen. Het moet variëren rond 10-25%. </li><li> 6-10 dagen na incubatie bij 30 ° C, kies gedekt gistkolonies in verse SD-L/-W/-H + 3-AT platen. [Tip: Om de gist in een schema van 8stegen van 12 wells reproduceren van een plaat met 96 putjes zodat het gemakkelijker daarna voor sequentiebepaling] is. Laat gist kolonies groeien gedurende 4-5 dagen bij 30 ° C in een vochtige atmosfeer. </li></ol></li><li> Screening van his3 positieve klonen door PCR en sequencing Het doel is om PCR amplificeren van het ORF in de pACT2 vectoren van gist kolonies gekweekt op selectieve platen SD-L/-H/-W. <ol><li> Zet een 96 wells PCR-plaat op het ijs. </li><li> Om gistcellen lyseren voeg 50 ul per putje van een Zymolase 20T oplossing (2,5 mg / ml in 10 mM HEPES buffer pH 7.7). </li><li> Voorzichtig resuspendeer een kolonie per putje. </li><li> Incubeer 15 min bij 37 ° C en 15 min bij 95 ° C. </li><li> Zet de plaat terug op het ijs. Voeg 50 ul van gedistilleerd water per put. Meng goed door en neer te pipetteren. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 3500 rpm en 4 ° C. </li><li> PCR amplificeren 10 ul van een insert met primers hybridiseren weerszijden van de ORF afgeleid van cDNA in pACT2 vectoren detecteren. Het protocol is gIven voor amplificatie van 96 gelyseerde gistkolonies met de ExTaq polymerase. Bereid het volgende mengsel: 525 pl 10X ExTaq buffer, 420 pl dNTP mix (2,5 mM), 10,5 ui Forward Primer (1 ug / ul), 10,5 pl Reverse Primer (1 ug / ul), 31,5 pl ExTaq (5 U / pl ) en 3202,5 ​​ui H 2 0. Verdeel 40 ul van het mengsel per putje in een 96 wells PCR-plaat. Voeg 10 ul van gelyseerde gist per putje. Voer amplificatie als volgt: 94 ° C gedurende 3 min, vervolgens 35 cycli bij 94 ° C gedurende 30 seconden, 60 ° C gedurende 1 min, 72 ° C gedurende 4 min, en eindigt met 72 ° C gedurende 7 minuten. Run 3 ui van de PCR producten op een 1,2% agarose gel om PCR-positieve klonen gedetecteerd. Merk op dat het gebruik van pre-cast 96 goed agarosegelen wordt aanbevolen. [Tip: plaat kan bij -20 ° C gedurende enkele maanden worden opgeslagen en hergebruikt voor nieuwe PCR] </li><li> Sequentie van de PCR geamplificeerde fragmenten geïsoleerd van HIS3 positieve klonen. Voer een BLAST analyse om cellulaire ORF identificeren. Lage vertrouwen afstemmingen (E waarde &amp;gt; 10 -10, identiteit &lt;80%, peptide lengte &lt;20 aminozuren) worden afgevoerd, evenals frameshifted en voortijdig stopcodon bevatten sequenties. </li></ol></li></ol> 2. Matrix gebouw voor HT-GPCA HT-GPCA een zoogdiercel gebaseerde test waarbij zowel pathogeen en gastheer eiwit transiënt tot expressie worden gefuseerd met complementaire fragmenten van de gesplitste Gaussia princeps luciferase. Na interactie van de partners, wordt dit enzym opgelost waardoor de mate van de enzymatische activiteit. De interactie intensiteit wordt dus afgeleid uit een genormaliseerde luminescentie Ratio (zie hieronder en figuur 1) <ol start="4"><li> Selectie gastheercel partners <ol><li> Selecteer eiwitten die meer dan drie keer de Y2H screenings voor verdere bevestiging in zoogdiercellen worden geïdentificeerd om de dataset vertrouwen 9 toenemen. </li><li> Voeg bekende interactie partners van de ziekteverwekker eiwitten als positive controles. </li></ol></li><li> Overschrijven naar HT-GPCA compatibel vectoren <ol><li> Klonen elk pathogeen eiwit ORF in een pSPICA-N2 vector te ziekteverwekker proteïnen met aminozuren 110-185 van het gehumaniseerde Gaussia princeps luciferase gefuseerd bij de N-terminus (GL2-pathogeen eiwitfusies) genereren. </li><li> PCR amplificeren cellulair eiwit ORF rechtstreeks van de Y2H positieve klonen of andere hulpmiddelen ORF (Human ORFeoom <a href="http://horfdb.dfci.harvard.edu/" target="_blank">http://horfdb.dfci.harvard.edu/</a> ) en deze overbrengen naar pSPICA-N1 vectoren proteïnen gefuseerd aan de N-terminus met het genereren de aminozuren 18-109 van gehumaniseerd Gaussia princeps luciferase (GL1-host eiwitfusies). [Tip: Voor grootschalige klonen, wordt het Gateway kloneringssysteem aanbevolen. In dat geval is voor PCR amplificatie, gebruikt primers ontworpen Gateway compatibele sites bevatten]. </li><li> Sequence alle expressievectoren. Sequenties van de pSPICA-N1 en N2-pSPICAis te vinden in referentie 8. </li></ol></li></ol> Merk op dat plasmideconstructen kan worden omgekeerd, dwz pathogenen eiwitten in pSPICA-N1 en gastheer eiwit in pSPICA-N2. 3. High-Throughput Gaussia princeps Luciferase-Based Protein Complementatie Assay (HT-GPCA) <ol start="6"><li> Cell Transfectie <ol><li> Seed 293T cellen bij 350.000 cellen / ml van DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS) zonder antibioticum. Verdeel 100 ul / putje in steriele witte cultuur platen. Neem niet meer dan 10 platen in een enkel experiment. Laat cellen groeien gedurende 24 uur bij 37 ° C met 5% CO2. [Tip:. Aangezien pSPICA plasmiden bevatten een SV40, het gebruik van 293T cellen maakt het repliceren in getransfecteerde cellen en dus leidt tot overexpressie van de twee fragmenten luciferase] </li><li> De volgende dag, transfecteren cellen met elke geschikte transfectie protocol. Merk op dat voor bepaalde transfectiereagentia, de number van cellen gezaaid kan worden aangepast. Gebruik 100 ng per putje van zowel de pathogeen en gastheer ORF plasmideconstructen. Co-transfecteren 10 ng per putje van een van CMV-Firefly luciferase plasmide te normaliseren voor transfectie-efficiëntie. Elk punt wordt in triplo getest. [Tip:. DNA mengsels kan de dag voor transfectie uitgevoerd en bewaard bij -20 ° C met lijmafdichtingen] </li><li> Overdracht transfectiemengsel aan de platen van gekweekte 293T cellen. Let op de DNA schud zachtjes zetten op de cellen, zoals 293T niet sterk hechtend en gemakkelijk los van de bodem van de put. Incubeer in een celkweek incubator gedurende 24-30 uur bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol></li></ol><ol start="7"><li> Cellysis en Gaussia luciferase dosering <ol><li> Was de cellen met PBS (100 ul / putje). Voeg 40 ul 1X lysisbuffer Renilla. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder roeren. </li><li> Bespaart 10 ul van cellysaten in een andere witte plate voor daaropvolgende dosering van het Firefly luciferase activiteit. Bewaar bij 4 ° C of alternatief bij -20 ° C met afdichting. </li><li> Meet de Gaussia activiteit op de resterende 30 pl cellysaten door toevoegen van 100 pl Renilla luciferase assay reagens en tellen luminescentie gedurende 10 seconden met een luminometer. Dosering van een 96 wells plaat duurt ongeveer een half uur. Voeren meting met verse cel extracten sinds bevriezing of langdurige opslag interactie-gemedieerde Gaussia activiteit kunnen beïnvloeden. </li></ol></li></ol><ol start="8"><li> Meting van Firefly activiteit <ol><li> Meet de Firefly activiteit van de opgeslagen 10 pl cellysaten door toevoeging van 50 pl firefly luciferase assay reagens en tellen luminescentie gedurende 10 sec. Dosering van een 96 wells plaat duurt ongeveer een half uur. [Tip: De dosering van Firefly luciferase kan worden uitgevoerd de dag na op bevroren lysaten.] </li></ol></li></ol><ol start="9"><li> NLR Berekeningen <ol><li&gt; Voor elke interactie Bereken de verhouding tussen Gaussia luciferaseactiviteit en Firefly luciferase activiteit een genormaliseerde luminescentie Gaussia waarde inachtneming transfectie-efficiëntie en de levensvatbaarheid van de cellen te verkrijgen. Bereken het gemiddelde van de drie herhalingen. </li><li> Om de interactie te controleren, schatten een genormaliseerde luminescentie Ratio (NLR) voor elk pathogeen-gastheer paar. Hiertoe verdelen de genormaliseerde luminescentie Gaussia activiteit gedetecteerd in aanwezigheid van zowel pathogeen en gastheer eiwitten door de som van de activiteiten gemeten in controleputjes (figuur 1 aangepast van referentie 8). Het NLR cut-off waarde voor positieve interacties is geschat op ongeveer 3,5 8. </li></ol></li></ol><ol start="10"><li> Data-analyse <ol><li> Voer hiërarchische clustering met de R statistiek pakket. Ten eerste, de groep van de NLR data in categorieën, bereken dan een interactie dendrogram met behulp van de volledige koppeling methode. Visualiseer ditdendrogram met JavaTreeView 10. Bereken de afstand tussen de interactie dendrogram en fylogenetische boom met behulp van een Pearson correlatiecoëfficiënt. </li><li> Om interactie netwerken genereren, selecteert u de positieve interacties van de HT-GPCA dataset en gebruik de Cytoscape software 1. Pak de graden van de gastheer-en plot hun distributie toegang tot het netwerk lokale dynamiek. Host-pathogenen netwerken kunnen worden gelegd op de gastheer interactoom om een ​​beoordeling van de globale impact van de ziekteverwekker eiwitten in de gastheer cellulaire netwerk. </li><li> Extract van de GO (Gene Ontology) termen in verband met de beoogde cellulaire factoren met de DAVID bioinformatica databank 12 aan de functionele verrijking van de dataset te beoordelen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+viruses+hijack+cell+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">How viruses hijack cell regulation.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).</li>
<li>Calderwood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+and+virus+human+protein+interaction+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).</li>
<li>de Chassey, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+infection+protein+network%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus infection protein network.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 230(2008).</li>
<li>Simonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactome+mapping+for+HTLV-1+and+-2+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses.</a> Retrovirology. 9, 26(2012).</li>
<li>Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+human+proteins+interacting+with+viruses+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens.</a> PLoS Pathog. 4, e32(2008).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437, 1173-1178 (2005).</li>
<li>Venkatesan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+empirical+framework+for+binary+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An empirical framework for binary interactome mapping.</a> Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).</li>
<li>Cassonnet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+a+luciferase+complementation+assay+for+detecting+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes.</a> Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).</li>
<li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).</li>
<li>Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoscape+2.8%3A+new+features+for+data+integration+and+network+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization.</a> Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761(2012).</li>
<li>Neveu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+virus-host+interactomes+with+a+mammalian+high-throughput+protein+complementation+assay+based+on+Gaussia+princeps+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase.</a> Methods. , (2012).</li>
<li>Braun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimentally+derived+confidence+score+for+binary+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions.</a> Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Onafhankelijk, gist-twee hybride en zoogdieren interactie assays, zoals GST pull-down, LUMIER of MAPPIT, hebben bewezen effectieve tools om eiwit-eiwit interacties te detecteren, maar worden beperkt door het hoge percentage van vals-positieve en vals-negatieve interacties die met deze technieken 15. Bovendien is bewijs groeit dat combineren orthogonale methoden verhoogt de betrouwbaarheid van de verkregen interactie dataset 7. De recente ontwikkeling van de HT-GPCA hier beschreven techniek is niet ...

De toenemende hoeveelheid gegevens verzameld om eiwit-eiwit interacties kaarten genereren opent perspectieven om verder te begrijpen pathogeen infecties. Als globale begrip van pathogeen infecties begint te ontstaan, het biedt toegang tot het bereik van de verstoringen veroorzaakt door ziekteverwekkers eiwitten bij het ​​aansluiten van het menselijk proteoom 1. Het biedt daarmee een manier om te begrijpen hoe pathogenen manipuleren van de gastheercel machinerie. Met name de afbeelding van verscheidene virale en gastheer interactienetwerken gebleken dat virale eiwitten voorkeur samen eiwitten die sterk verbonden in het cellulaire netwerk (hubs), of die essentieel zijn voor vele paden in een netwerk (bottlenecks eiwitten) 2-4 targeten. Deze interacties kunnen virussen op belangrijke cellulaire processen te manipuleren, dat is instrumenteel om te repliceren en te produceren infectieus nageslacht. Vergelijkende interacties mapping werden onlangs uitgevoerd op verwante virussen met het doel om informatie met betrekking totpathogenese 4. Bovendien hebben studies van de gastheer-pathogenen interacties landschap uitgebreid naar vele ziekteverwekkers 5. De gerichte cel identificatie factoren geeft inzicht in de strategieën die door ziekteverwekkers om cellen te infecteren en maakt de ontdekking van potentiële pathogene markers. De gist twee-hybride systeem is de meest populaire methode om binaire interacties vast omdat genetische screening is een efficiënt en gevoelig hulpmiddel voor high-throughput kaart brengen van eiwit-eiwit interacties. De hier voorgestelde aanpak verbetert verder individuele Y2H screenings door beoordeling van een eiwit van meerdere pathogenen stamvarianten, waardoor toegang tot een vergelijkend overzicht van pathogeen-gastheer eiwit-eiwit interacties. Bovendien is een belangrijke beperking van gist twee-hybride screening ligt in een hoog percentage vals-negatieve, aangezien herstelt ongeveer 20% van de totale interacties 6. Dit betekent dat interactie gedetecteerd met slechts een subset van pathogens varianten zouden zijn ontsnapt detectie met de anderen. Daarom worden de individuele partners die uit alle twee-hybride screening verder uitgedaagd voor interactie met het complete assortiment van stammen bestudeerd, verstrekking van vergelijkende interactie datasets. Aangezien werd aangetoond dat het combineren van verschillende methodologieën sterk verhoogt de robuustheid van eiwit-eiwit interacties datasets 7, wordt deze validatie uitgevoerd in zoogdiercellen door een nieuw ontwikkelde eiwit fragment complementatie bepaling genoemd HT-GPCA 8. Deze cel-gebaseerde systeem kan de detectie van eiwit interacties door complementatie van de Gaussia princeps gesplitst luciferase en is ontworpen compatibel met een hoog-formaat zijn. Dankzij de luminescentie gebaseerde technologie en lage achtergrondruis in vergelijking met andere fluorescentie-gebaseerde test, HT-GPCA toont een opvallend hoge gevoeligheid. Kortom, deze benadering vormt een efficiëntehulpmiddel om een ​​uitgebreide kaart brengen van gastheer-pathogeen wisselwerkingen, die de eerste stap naar een wereldwijd begrip van de gastheercel kapen vertegenwoordigt genereren.

<table><tbody><tr><td>Giststammen</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimale SD-basis</td><td>US biological</td><td>D9500</td><td></td></tr><tr><td>Aminozuren</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4-Triazool (3-AT)</td><td>Acros organics</td><td>264571000</td><td></td></tr><tr><td>Zymolase</td><td>Seikagaku</td><td>120491</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat buffer Saline (PBS)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Renilla luciferase assay</td><td>Promega</td><td>E2820</td><td></td></tr><tr><td>Witte kweekplaat</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>96-wellsPCR platen</td><td>4titude</td><td>4t-i0730/C</td><td></td></tr><tr><td>Incubator (30 &deg;C)</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator (37 &deg;C)</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Berthold</td><td>Centro XS-LB 960</td><td></td></tr></tbody></table>

een vergelijkende benadering van het landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Aanzienlijke inspanningen werden verzameld om grootschalige uitgebreide eiwit-eiwit interactie netwerk kaarten te genereren. Dit is een randvoorwaarde om de pathogeen-gastheer relaties begrijpen en werd hoofdzakelijk uitgevoerd door genetische screenings in gist twee-hybride systemen. De recente verbetering van eiwit-eiwit interacties detectie door een Gaussia luciferase-gebaseerde fragment complementatie test biedt nu de mogelijkheid om integratieve vergelijkende interactomic benaderingen nodig ontwikkelen om rigoureus interactieprofielen van eiwitten te vergelijken van verschillende pathogene stam varianten tegen een gemeenschappelijke set van cellulaire factoren. Dit document richt zich specifiek op het nut van het combineren van twee orthogonale methoden om eiwit-eiwit interactie datasets te genereren: gist twee-hybride (Y2H) en een nieuwe test, high-throughput Gaussia princeps eiwit complementeringsbepaling (HT-GPCA) uitgevoerd in zoogdiercellen. nt &#39;&gt; Een grootschalige identificatie van cellulaire partners van een pathogeen eiwit wordt uitgevoerd door voortplanting gebaseerd gist twee-hybride screening van cDNA-bibliotheken die meerdere pathogenen stamvarianten. Een subgroep van interactie partners geselecteerd op een veel vertrouwen statistische scoring verder gevalideerd in zoogdiercellen paarsgewijze interacties met het geheel van pathogene varianten eiwitten met HT-GPCA. Deze combinatie van twee complementaire methoden verbetert de robuustheid van de interactie dataset, en kan de prestatie van een strenge vergelijkende interactieanalyse. die vergelijking interactomics vormen een betrouwbare en krachtige strategie te ontcijferen elke pathogeen-gastheer wisselwerkingen.

Een grote kracht van HT-GPCA ligt in zijn hoge gevoeligheid, zoals blijkt uit de evaluatie van vals-positieve en fout-negatieve uitslagen voor de HPV-E2 eiwit in figuur 2 (aangepast uit referentie 13). Om de valse negatieve tarief te bepalen, werden bekende interacties van E2 van HPV16 beoordeeld door HT-GPCA (Figuur 2A). Vier van de 18 interacties werden niet hersteld (wat overeenkomt met een 22% vals negatieve tarief). De valse positieve interacties werden gemeten tot 5,8% met 12 HPV-...

Dit artikel richt zich op de identificatie van hoog-vertrouwen interactie datasets tussen gastheer en pathogeen-eiwitten met behulp van een combinatie van twee orthogonale methoden: gist twee-hybride, gevolgd door een high-throughput interactie test bij zoogdiercellen genaamd HT-GPCA.

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om ectomische studies uit te voeren om interactieprofielen van eiwitten van verschillende pathogeenvarianten te vergelijken met een gemeenschappelijke set cellulaire factoren. Dit wordt bereikt door middel van paringsgebaseerde gist-twee-hybride screenings van cDNA om potentiële interactiepartners van eiwitten uit verschillende pathogeenvarianten te identificeren. Als tweede stap worden de open leesramen van de interactiepartners gesequenced en overgebracht naar vectoren die geschikt zijn voor verdere validatie.Vervolgens wordt een set individuele partners die voortkomen uit beide hybride screenings geselecteerd en opnieuw getest op hun interactie met het volledige scala aan bestudeerde stammen. Dit wordt gedaan met behulp van een orthogonale, op luciferase gebaseerde proteïnefragment-complementatie-assay uitgevoerd in zoogdiercellen, om robuuste vergelijkende interactiedatasets te verkrijgen. De resultaten tonen, op basis van de verkregen luciferase-metingen, verschillende interactie-intensiteiten tussen de pathogeneproteïnen en de cellulaire proteïnen en bieden zo een vergelijkend overzicht van proteïne-proteïne-interacties tussen

a-comparative-approach-to-characterize-landscape-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video describes the proximity ligation assay to study in situ protein-protein interactions in nematode cells. The close proximity of the proteins of interest generates the circular DNA template with the help of a PLA probe attached to a secondary antibody. The probe is further amplified using the amplification solution, which produces a long single-stranded DNA followed by the hybridization of the detector probe, enabling the localization of protein-protein interactions in cells.

Proximity Ligation Assay to Study In Situ Protein-Protein Interactions

Dit artikel illustreert het gebruik van puls-chase radio-labeling in combinatie met plaatsspecifiek fotocrosslinking om interacties te monitoren tussen een eiwit van belang en andere factoren in E. coli. In tegenstelling tot traditionele chemische cross-linking methoden, genereert deze aanpak hoge resolutie “momentopnamen” van een geordende assemblageroute in een levende cel.

Monitoring van de Assemblee van een afgescheiden virulentiewerd Factor behulp van Site-specifieke Crosslinking

Eiwitten interageren met elkaar en deze interacties bepalen voor een groot deel hun functies. Eiwitinteractiepartners kunnen op grote schaal in vivo worden geïdentificeerd met behulp van een gistfitnesstest op basis van de dihydrofolaatreducase-eiwitfragmentcomplementatietest (DHFR-PCA).

Genoom-brede Eiwit-eiwit Interactie Screening door Eiwit-fragment Complementatie Assay (PCA) in levende cellen

Beschreven is een proteomica-workflow voor het identificeren van eiwit interactie partners uit een nucleaire subcellulaire fractie met behulp van immunoaffinity verrijking van een gegeven proteïne van belang en label-vrije massaspectrometrie. De workflow omvat subcellulaire fractionering, immunoprecipitatie, filter aided monstervoorbereiding, offline opruimen, massaspectrometrie, en een downstream bioinformatica pijpleiding.

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Deze studie was gericht op het presenteren van een strategie voor het identificeren van drug-peptide interacties. De strategie omvat het biopanning van drug-herkennende korte peptiden op basis van een kwarts-kristal microbalans (QCM) biosensor, gevolgd door bioinformatica analyse voor het kwantitatief beoordelen van de informatie verkregen voor de drugherkenning en annotatie van de drug-bindende sites op eiwitten.

Biosensor-gebaseerde high throughput biopanning en bioinformatica analyse strategie voor de wereldwijde validatie van drug-eiwit interacties

Hier presenteren we een protocol om het samenspel tussen gastheer en ziekteverwekker te profileren tijdens infectie door op massaspectrometrie gebaseerde proteomics. Dit protocol maakt gebruik van labelvrije kwantificering om veranderingen in eiwitrijkdom van zowel gastheer (bijv. macrofagen) als ziekteverwekker (bijv. Cryptococcus neoformans)in één experiment te meten.

Labelvrije kwantitatieve proteomics workflow voor discovery-driven host-pathogen interacties

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een complete pijplijn om RNA-sequencing transcriptoomgegevens te analyseren, van ruwe reads tot functionele analyse, inclusief kwaliteitscontrole en voorbewerkingsstappen tot geavanceerde statistische analytische benaderingen.

Transcriptoomanalyse met hoge doorvoer voor het onderzoeken van gastheer-pathogeeninteracties

We presenteren een systeembiologische tool JUMPn om netwerkanalyse uit te voeren en te visualiseren voor kwantitatieve proteomics-gegevens, met een gedetailleerd protocol inclusief gegevensvoorverwerking, co-expressieclustering, pathway-verrijking en eiwit-eiwitinteractienetwerkanalyse.

JUMPn: Een gestroomlijnde toepassing voor eiwit co-expressie clustering en netwerkanalyse in proteomics

Hier presenteren we een protocol om het vastleggen en identificeren van ziektespecifieke eiwit-eiwitinteracties van natuurlijke cellen en weefsels mogelijk te maken met behulp van chemische sondes en massaspectrometrie. De resulterende interactiedatasets worden geanalyseerd via een speciaal webgebaseerd platform om dynamische netwerkdisfuncties en routeveranderingen die verband houden met ziekte aan het licht te brengen.

In kaart brengen van disfunctionele eiwit-eiwitinteracties bij ziekte

Er wordt een methode beschreven om levende pathogenen individueel te selecteren, te manipuleren en te beelden met behulp van een optische pincet gekoppeld aan een spinning disk-microscoop. De optische pincet biedt ruimtelijke en temporele controle over de organismen en plaatst deze naast gastheercellen. Fluorescentiemicroscopie legt dynamische intercellulaire interacties vast met minimale verstoring van de cellen.

Het gebruik van een optische val voor de Studie van gastheer-pathogeen interacties voor Dynamic live cell imaging

Leer een vergelijkende interactomics-aanpak voor pathogeen-gastheer eiwit-eiwit interacties met behulp van Y2H en HT-GPCA. Deze methode identificeert genotype-specifieke biomarkers en therapeutische doelen.

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

Meer video's verkennen