Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren
18 juli 2013
Dit artikel richt zich op de identificatie van hoog-vertrouwen interactie datasets tussen gastheer en pathogeen-eiwitten met behulp van een combinatie van twee orthogonale methoden: gist twee-hybride, gevolgd door een high-throughput interactie test bij zoogdiercellen genaamd HT-GPCA.
Het algemene doel van het volgende experiment is om ectomische studies uit te voeren om interactieprofielen van eiwitten van verschillende pathogeenvarianten te vergelijken met een gemeenschappelijke reeks cellulaire factoren. Dit wordt bereikt door op kruising gebaseerde gist, twee hybride screenings van CDNA om potentiële interacterende partners van eiwitten van verschillende pathogeenvarianten te identificeren. Als tweede stap worden de open leesramen van de interacterende partners gesequenced en overgebracht naar vectoren die compatibel zijn voor verdere validatie.
Vervolgens wordt een set individuele partners geselecteerd die uit alle twee hybride screenings naar voren komt en opnieuw getest op hun interactie met het volledige bereik van bestudeerde stammen. Dit wordt gedaan met behulp van een orthogonale gia, luciferase-gebaseerde proteïnefragmentcomplementatietest uitgevoerd in zoogdiercellen om robuuste vergelijkende interactiegegevenssets te leveren. De resultaten tonen verschillende interactie-intensiteiten tussen de pathogeen-eiwitten en de cellulaire eiwitten op basis van de verkregen luciferinemetingen, en bieden dus een vergelijkend overzicht van pathogeen-gastheer-eiwit-eiwitinteracties.
Verwerking van de interactieprofielen door hiërarchische clustering correleert specifieke gastheer-pathogeeninteracties met pathologische eigenschappen en geeft inzicht in de betrokkenheid van pathogeen-eiwitten bij pathogenese. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak boven andere methoden voor het in kaart brengen van pathogeen-gastheer-eiwit-eiwitinteracties is dat het een strenge vergelijkende interactiegegevensset tussen meerdere stamvarianten biedt. Deze techniek biedt inzicht in het interactienetwerk van een pathogeen-eiwit, maar kan ook worden toegepast op andere systemen als een infectieus molecuul met behulp van complete virussen en riviergenetica, bijvoorbeeld, Begin dit protocol met het mengen en verspreiden van de gistcellen zoals beschreven in het schriftelijke protocolzaad.
30 milliliter selectief afvalmedium zonder tryptofaan met enkele kolonies van AH 1 0 9 giststam getransformeerd met de P-G-B-K-T zeven plasmide die het pathogeen-eiwit tot expressie brengt. 30 uur incuberen bij 30 graden Celsius met rotatie. Vervolgens zaaien, 200 milliliter selectief afvalmedium minus tryptofaan met de 30 milliliter van de AH 1 0 9.
Culturen incuberen met rotatie gedurende 20 uur bij 30 graden Celsius. Ook incuberen gedacht CDNA-bibliotheek getransformeerd Y 187 in 20 milliliter YP-lijm gedurende 10 minuten bij 30 graden Celsius met rotatie. Centrifugeer vervolgens een volume van de PG BK T zeven getransformeerde AH 109-cultuur die overeenkomt met een gelijkwaardige hoeveelheid levensvatbare Y 187-gistcellen gedurende vijf minuten bij 3.500 RPM en 20 graden Celsius.
Trek voorzichtig het supernatant terug en Resus suspendeert de smaak in 10 milliliter YP-lijm. Meng de gesuspendeerde AH 109-gist met de Y 187-bibliotheek die de bibliotheek bevat. Breng over naar een 50 milliliter buis voordat u gedurende vijf minuten centrifugeert bij 3.500 RPM en 20 graden Celsius.
Na het voorzichtig terugtrekken van de super dat Resus, schorsten de pellet in YP-lijm om een totaal van 1,5 milliliter te krijgen. Verspreid vervolgens de gist op drie YCM-agar, 150 millimeter platen bij 0,5 milliliter per plaat en incubeer 4,5 uur bij 30 graden Celsius. Verzamel de gepaarde gist van YCM-platen door te schrabben met een rakeglas in 10 milliliter selectief afvalmedium minus leucine, tryptofaan en histidine.
Spoel de plaat twee keer met vijf milliliter van hetzelfde medium en pool volgend centrifugeren gedurende vijf minuten bij 3.500 RPM en 20 graden Celsius. Gooi het supernatant weg en gebruik het opnieuw. Suspendeer het gistpellet in vijf milliliter selectief afvalmedium minus leucine, tryptofaan en histidine.
Verspreid vervolgens de gepaarde gist op 10 platen selectief afvalagar minus leucine, tryptofaan en histamine, aangevuld met de juiste concentratie drie aminotriazool of drie at zoals bepaald in de auto-activatietest. Bereken de diploïde snelheid zoals beschreven in het schriftelijke protocol na incubatie bij 30 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer gedurende zes tot 10 dagen. Kies gistkolonies en breng over naar platen vers bereid uit selectief afvalagar minus leucine, tryptofaan en histidine plus drie a t.
Orden de gist in een schema van acht banen van 12 putjes die een 96-putjesplaat reproduceren, zodat het later gemakkelijker zal zijn voor sequencing. Laat de gistkolonies vier tot vijf dagen groeien bij 30 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer. Het doel van deze sectie is om de CDNA, die in de PA ct twee vectoren van gelyseerde gistkolonies zit die zijn gekweekt op selectief afvalagar minus leucine, tryptofaan en histidine platen, te PCR-versterken.
Begin met het plaatsen van een 96-putjes PCR-plaat op ijs om gistcellen te lyce bij 50 microliter per putje van xmal 20 T-oplossing. Hersuspenseer voorzichtig één kolonie per putje. Incubeer de plaat 15 minuten bij 37 graden Celsius en 15 minuten bij 95 graden Celsius.
Nadat de plaat weer op ijs is geplaatst, voeg 50 microliter gedistilleerd water per putje toe, meng door op en neer te pipetten en centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 3.500 RPM en vier graden Celsius. Na het bereiden van de X-tack mix zoals beschreven in het tekstprotocol, verdeel 40 microliter van de mix per putje in de 96-putjes PCR-plaat. Voeg 10 microliter van de gelyseerde gist per putje toe en voer de versterking uit zoals vermeld in het tekstprotocol.
Laat drie microliter van de PCR-producten op een 1,2% agrosgel lopen om PCR-positieve klonen te detecteren. Sequence de PCR-versterkte fragmenten geïsoleerd uit deze drie positieve klonen. Voer vervolgens een blast-analyse uit om cellulaire open leesramen te identificeren, laag vertrouwen uitlijningen, evenals frameshift en voortijdige stopcode op bevattende sequenties te verwerpen voorafgaand aan celtransfectie.
Breng de open leesramen van het pathogeen-eiwit en he
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel richt zich op de identificatie van datasets met hoogwaardige interacties tussen gastheer- en pathogeen-eiwitten door middel van een combinatie van twee orthogonale methoden: yeast two-hybrid gevolgd door een hoogdoorvoer interactie-assay in zoogdiercellen genaamd HT-GPCA.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Eiwit-eiwit interacties
- Pathogeen-gastheer interacties
- Hoogdoorvoer screeningsmethoden
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitinteracties is cruciaal voor het verklaren van pathogeenmechanismen.
- Yeast two-hybrid screening is een veel gebruikte methode voor het identificeren van eiwitinteracties.
- HT-GPCA biedt een robuust platform voor het valideren van interacties in zoogdiercellen.
- Vergelijkende studies kunnen verschillen in interactieprofielen tussen verschillende pathogeenvarianten onthullen.
Doel van het onderzoek
- Om interactieprofielen van eiwitten van verschillende pathogeenvarianten te vergelijken.
- Om potentiële interacterende partners van pathogeen-eiwitten te identificeren.
- Om een vergelijkend overzicht te geven van pathogeen-gastheer eiwitinteracties.
Gebruikte methoden
- Yeast two-hybrid screenings van cDNA om interacterende partners te identificeren.
- Sequencing van open reading frames van geïdentificeerde partners.
- Validatie van interacties met behulp van een luciferase-gebaseerde eiwitfragment complementatie assay.
- Vergelijking van interactie-intensiteiten met behulp van luciferase metingen.
Belangrijkste resultaten
- Verschillende interactie-intensiteiten waargenomen tussen pathogeen-eiwitten en cellulaire eiwitten.
- Robuuste vergelijkende interactie-datasets gegenereerd.
- Inzichten in de dynamiek van pathogeen-gastheer interacties.
- Identificatie van belangrijke interacterende partners voor verder onderzoek.
Conclusies
- Het onderzoek identificeert met succes hoogwaardige interacties tussen gastheer- en pathogeen-eiwitten.
- Resultaten geven waardevolle inzichten in de mechanismen van pathogeeninteracties.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om therapeutische doelen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Comparative interactomics using orthogonal protein-protein interaction assays enables rigorous mapping of host-pathogen interaction networks, directly informing target validation and mechanistic de-risking in infectious disease research. Integrating yeast two-hybrid and high-throughput Gaussia luciferase complementation assays provides quantitative, high-confidence datasets that support predictive confidence at key discovery inflection points. This approach enhances portfolio decision-making by enabling genotype-specific biomarker identification and prioritization of therapeutic targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of pathogen protein interactions with host factors across multiple strain variants.
- Supports functional target validation by quantifying interaction strengths and specificity.
- Facilitates mechanistic de-risking by correlating interaction profiles with pathological traits.
- Provides robust datasets for triaging targets based on comparative interaction landscapes.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative interaction data for downstream screening workflows.
- Standardizes assay outputs using normalized luminescence ratios for reproducibility.
- Enables high-throughput, scalable evaluation of protein-protein interactions in mammalian systems.
- Supports reliable compound evaluation by minimizing false positives and negatives.
Translational & Preclinical Research
- Aligns interaction profiles with disease-relevant biomarkers and pathogenic mechanisms.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by linking genotype-specific interactions to phenotypic outcomes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative interaction data.
- Facilitates identification of translational biomarkers for infectious disease portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This comparative interactomics workflow bridges early discovery, target validation, and translational research by providing a standardized, quantitative platform for mapping host-pathogen protein interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through orthogonal validation of interaction networks.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible outputs with defined sensitivity and specificity thresholds.
- Analytics: Delivers normalized luminescence ratios and hierarchical clustering to compare interaction profiles across variants.
- Translational Research: Links interaction data to disease traits and biomarker identification for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for diverse pathogen systems and protein complexes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of interaction mapping workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust comparative analyses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of infectious disease targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, yeast genetics, and mammalian cell culture.
- Needs access to high-throughput luminometry and sequencing infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to various pathogen systems and scalable for large interaction networks.
- Practical limitations include assay sensitivity, specificity, and the need for orthogonal validation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:02
Yeast Two-hybrid Screenings
5:21
Screening of HIS3 Positive Clones by PCR and Sequencing
7:00
Cell Transfection
8:26
Cell Lysis and Gaussia Luciferase Dosage
9:23
Measurement of Firefly Activity and Normalized Luminescence Ratio (NLR) Calculations
10:29
Results: Characterization of Virus-host Protein-protein Interactions for the E2, E6 and E7 Early Proteins of Human Papillomaviruses
13:05
Conclusion
